In vivo הדמיה של רקמת מוח פעילה לחלוטין בזחלי דגי זברה ערים וצעירים על ידי הסרת גולגולת ועור
Summary
כאן אנו מציגים שיטה לדימוי המוח העוברי של דג הזברה בשלבים של זחלים ונוער. הליך מיקרו-פולשני זה, המותאם מגישות אלקטרופיזיולוגיות, מספק גישה לפרטים תאיים ותת-תאיים של נוירון בוגר וניתן לשלבו עם אופטוגנטיקה ומחקרים נוירופרמקולוגיים לאפיון תפקוד המוח והתערבות תרופתית.
Abstract
הבנת השינויים הארעיים המתרחשים במהלך התפתחות המוח וההתבגרות דורשת הדמיה מפורטת ברזולוציה גבוהה במרחב ובזמן ברזולוציה תאית ותת-תאית. ההתקדמות בטכנולוגיות מולקולריות והדמיה אפשרה לנו לקבל תובנות מפורטות רבות על מנגנונים תאיים ומולקולריים של התפתחות המוח בעובר דג הזברה השקוף. לאחרונה, תהליכים של עידון קישוריות עצבית המתרחשים בשלבים מאוחרים יותר של זחל מספר שבועות לאחר ההפריה, שהם למשל שליטה על התנהגות חברתית, קבלת החלטות או התנהגות מונעת מוטיבציה, עברו למוקד המחקר. בשלבים אלה, פיגמנטציה של עור דג הזברה מפריעה לחדירת אור לרקמת המוח, ופתרונות לשלבים עובריים, למשל, עיכוב פרמקולוגי של פיגמנטציה, אינם אפשריים יותר.
לכן, פתרון כירורגי זעיר פולשני לגישה מיקרוסקופית למוח של דגי זברה ערים מסופק כי נגזר גישות אלקטרופיזיולוגיות. בטלוסטים, עור וסחוס גולגולת רך ניתן להסיר בזהירות על ידי מיקרו קילוף שכבות אלה, חשיפת נוירונים הבסיסיים ועלונים אקסוניים ללא נזק. זה מאפשר הקלטה של מורפולוגיה עצבית, כולל מבנים סינפטיים ותכולתם המולקולרית, ותצפית על שינויים פיזיולוגיים כגון Ca2 + ארעי או אירועי תחבורה תאיים. בנוסף, חקירה של תהליכים אלה באמצעות עיכוב פרמקולוגי או מניפולציה אופטוגנטית היא אפשרית. גישה זו של חשיפה למוח מספקת מידע על שינויים מבניים ופיזיולוגיים בתאי העצב, כמו גם על המתאם והתלות ההדדית של אירועים אלה ברקמת מוח חיה בטווח של דקות או שעות. הטכניקה מתאימה להדמיה מוחית של זחלי דגי זברה עד 30 יום לאחר ההפריה, השלב ההתפתחותי האחרון שנבדק עד כה. זה, אם כן, מספק גישה לשאלות חשובות כגון עידון סינפטי ושינוי קנה מידה, הובלה אקסונית ודנדריטית, מיקוד סינפטי של מטען ציטוס שלד או ביטוי תלוי פעילות מקומית. לכן, ניתן לצפות לשימוש נרחב בגישת הרכבה והדמיה זו.
Introduction
במהלך העשורים האחרונים, דג הזברה (דניו rerio) התפתח כאחד האורגניזמים מודל החוליות הפופולרי ביותר עבור מחקרים התפתחותיים עובריים וזחלים. פוריותן הגדולה של נקבות דגי הזברה יחד עם התפתחות הרחם האקסית המהירה של העובר ושקיפותו בשלבים התפתחותיים עובריים מוקדמים הם רק כמה גורמים מרכזיים שהופכים את דג הזברה לאורגניזם מודל רב עוצמה כדי להפוך שאלות התפתחותיות1. התקדמות בטכנולוגיות גנטיות מולקולריות בשילוב עם רזולוציה גבוהה במחקרי הדמיה vivo מותר לטיפול מנגנונים ביולוגיים תאים שבבסיס תהליכים התפתחותיים2. בפרט, בתחום ההבחנה העצבית, הפיזיולוגיה, הקישוריות והתפקוד, דגי הזברה שפכו אור על יחסי הגומלין של דינמיקה מולקולרית, תפקודי מוח והתנהגות אורגניגנית בפירוט חסר תקדים.
עם זאת, רוב המחקרים הללו מוגבלים לשלבים עובריים וזחליים מוקדמים במהלך השבוע הראשון של ההתפתחות כמו שקיפות של רקמת מערכת העצבים הולך לאיבוד בהדרגה. בשלבים אלה, רקמת המוח נמנעת מגישה על ידי גישות מיקרוסקופיות ברזולוציה גבוהה להיות מוגן על ידי בידול הגולגולת פיגמנטציה3.
לכן, שאלות מרכזיות של הבחנה עצבית, התבגרות, ופלסטיות כגון עידון של קישוריות עצבית או קנה מידה סינפטי קשה ללמוד. תהליכים תאיים אלה חשובים על מנת להגדיר מנגנונים תאיים המניעים, למשל, התנהגות חברתית, קבלת החלטות או התנהגות מבוססת מוטיבציה, תחומים שבהם מחקר דגי זברה על זחלים בני מספר שבועות תרם לאחרונה ממצאים מרכזיים המבוססים על מחקרים התנהגותיים4.
גישות פרמקולוגיות לעכב פיגמנטציה בזחלי דגי זברה במשך מספר שבועות הם בקושי אפשרי או אפילו עלול לגרום השפעות מזיקות5,6,7,8. זנים מוטנטיים כפולים או משולשים עם פגמים פיגמנטציה ספציפיים, כגון קספר9 או קריסטל10, הפכו לכלים בעלי ערך רב, אך הם מייגעים ברבייה, מספקים צאצאים מעטים ומהווים את הסכנה של צבירת מומים גנטיים עקב הכלאה מופרזת.
כאן, הליך פולשני מינימלי כחלופה מסופק כי הוא חל על כל זן דג זברה. הליך זה הותאם ממחקרים אלקטרופיזיולוגיים כדי לתעד פעילות עצבית בזחלי דגי זברה חיים וערים. בטלוסטים, עור וסחוס גולגולת רך ניתן להסיר בזהירות על ידי מיקרו קילוף שכבות אלה, כי הם אינם שזורים היטב עם כלי המוח. זה מאפשר חשיפת רקמת מוח המכילה נוירונים ודרכיים אקסונליות ללא נזק להקלטת מורפולוגיה עצבית, כולל מבנים סינפטיים ותכולתם המולקולרית, אשר בתורם כוללים תצפית על שינויים פיזיולוגיים כגון Ca2 + ארעיים או אירועי תחבורה תאיים עד מספר שעות. יתר על כן, מעבר לאפיונים תיאוריים, הגישה הישירה לרקמת המוח מאפשרת חקירה של תפקודים עצביים בוגרים באמצעות מתן חומרים נוירופרמקולוגיים וגישות אופטוגנטיות. לכן, יחסי תפקוד מבנה אמיתיים יכולים להתגלות במוח דגי הזברה הצעירים באמצעות אסטרטגיית חשיפה זו למוח.
Protocol
Representative Results
Discussion
השיטה המוצגת מספקת גישה חלופית לבידוד המוח או לטיפול בזחלי דגי זברה עם תרופות המעכבות פיגמנטציה להקלטת תמונות ברזולוציה גבוהה של נוירונים בסביבת הוויו שלהם. איכות התמונות המתועדת בשיטה זו דומה לתמונות ממוחות מוסברים, אך בתנאים טבעיים.
יתר על כן, אובדן בעוצמת הפלואורס?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים במיוחד לטימו פריטש על טיפול מעולה בבעלי חיים והרמן דרינג, מוחמד אלסיי, סול פוזה – מנדז, יעקב פון טרוטה, קומאלי ולישטי וברברה וינטר על תמיכתם המועילה. אנו גם אסירי תודה לכל שאר חברי מעבדת קסטר על המשוב שלהם. הפרויקט מומן בחלקו על ידי קרן המחקר הגרמנית (DFG, KO1949/7-2) פרויקט 241961032 (ל- RWK) ובונדסמיניסטריום פיור בילדונג או פורשונג (BMBF; פרויקט CIPRESS נוירון II ERA-Net 01EW1520 ל- JCM) הוא הודה.
Materials
| Calcium chloride | Roth | A119.1 | |
| Confocal Laser scanning microscope | Leica | TCS SP8 | |
| d-Glucose | Sigma | G8270-1KG | |
| d-Tubocurare | Sigma-Aldrich | T2379-100MG | |
| Glass Capillary type 1 | WPI | 1B150F-4 | |
| Glass Capillary type 2 | Harvard Apparatus | GC100F-10 | |
| Glass Coverslip | deltalab | D102424 | |
| HEPES | Roth | 9105.4 | |
| Hoechst 33342 | Invitrogen (Thermo Fischer) | H3570 | |
| Imaging chamber | Ibidi | 81156 | |
| Potassium chloride | Normapur | 26764298 | |
| LM-Agarose | Condalab | 8050.55 | |
| Magnesium chloride (Hexahydrate) | Roth | A537.4 | |
| Microscope Camera | Leica | DFC9000 GTC | |
| Needle-Puller type 1 | NARISHIGE | Model PC-10 | |
| Needle-Puller type 2 | Sutter Instruments | Model P-2000 | |
| Pasteur-Pipettes 3ml | A.Hartenstein | 20170718 | |
| Sodium chloride | Roth | P029.2 | |
| Sodium hydroxide | Normapur | 28244262 | |
| Tricain | Sigma-Aldrich | E10521-50G | |
| Waterbath | Phoenix Instrument | WB-12 | |
| 35 mm petri dish | Sarstedt | 833900 | |
| 90 mm petri dish | Sarstedt | 821473001 |
References
- Embryology. Zebrafish Development Available from: https://embryology.med.unsw.edu.au/embryology/index.php/Zebrafish_Development (2020)
- Sassen, W. A., Köster, R. W. A molecular toolbox for genetic manipulation of zebrafish. Advances in Genomics and Genetics. Dove Medical Press. 2015 (5), 151-163 (2015).
- Singh, A. P., Nüsslein-Volhard, C. Zebrafish stripes as a model for vertebrate colour pattern formation. Current Biology. 25 (2), 81-92 (2015).
- Kalueff, A. V., et al. Time to recognize zebrafish ‘affective’ behavior. Brill: Behaviour. 149 (10-12), 1019-1036 (2012).
- Karlsson, J., von Hofsten, J., Olsson, P. -. E. Generating transparent zebrafish: a refined method to improve detection of gene expression during embryonic development. Marine Biotechnology. 3, 522-527 (2001).
- Bohnsack, B. L., Gallina, D., Kahana, A. Phenothiourea sensitizes zebrafish cranial neural crest and extraocular muscle development to changes in retinoic acid and IGF signaling. PloS One. 6, 22991 (2011).
- Elsalini, O. A., Rohr, K. B. Phenylthiourea disrupts thyroid function in developing zebrafish. Development Genes and Evolution. 212, 593-598 (2003).
- Baumann, L., Ros, A., Rehberger, K., Neuhauss, S. C. F., Segner, H. Thyroid disruption in zebrafish (Danio rerio) larvae: Different molecular response patterns lead to impaired eye development and visual functions. Aquatic Toxicology. 172, 44-55 (2016).
- White, R., et al. Transparent adult zebrafish as a tool for in vivo transplantation analysis. Cell Stem Cell. 2, 183-189 (2008).
- Antinucci, P., Hindges, R. A crystal-clear zebrafish for in vivo imaging. Scientific Reports. 6, 29490 (2016).
- Burr, S. A., Leung, Y. L. Curare (d-Tubocurarine). Encyclopedia of Toxicology (3rd Edition). , 1088-1089 (2014).
- Gesler, H. M., Hoppe, J. 3,6-bis(3-diethylaminopropoxy) pyridazine bismethiodide, a long-acting neuromuscular blocking agent. The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 118 (4), 395-406 (1956).
- Furman, B. . Alpha Bungarotxin. Reference Module in Biomedical Sciences. , (2018).
- Attili, S., Hughes, S. M. Anaesthetic tricaine acts preferentially on neural voltage-gated sodium channels and fails to block directly evoked muscle contraction. PLoS One. 9 (8), 103751 (2014).
- Namikawa, K., et al. Modeling neurodegenerative spinocerebellar ataxia type 13 in zebrafish using a Purkinje neuron specific tunable coexpression system. Journal of Neuroscience. 39 (20), 3948-3969 (2019).
- Hennig, M. Theoretical models of synaptic short term plasticity. Frontiers in Computational Neuroscience. 7 (45), (2013).
- Wang, Y., et al. Moesin1 and Ve-cadherin are required in endothelial cells during in vivo tubulogenesis. Development. 137, 3119-3128 (2010).
- Hobro, A., Smith, N. An evaluation of fixation methods: Spatial and compositional cellular changes observed by Raman imaging. Vibrational Spectroscopy. 91, 31-45 (2017).
- Knogler, L. D., Kist, A. M., Portugues, R. Motor context dominates output from purkinje cell functional regions during reflexive visuomotor behaviours. eLife. 8, 42138 (2019).
- Hsieh, J., Ulrich, B., Issa, F. A., Wan, J., Papazian, D. M. Rapid development of Purkinje cell excitability, functional cerebellar circuit, and afferent sensory input to cerebellum in zebrafish. Frontier in Neural Circuits. 8 (147), (2014).
- Scalise, K., Shimizu, T., Hibi, M., Sawtell, N. B. Responses of cerebellar Purkinje cells during fictive optomotor behavior in larval zebrafish. Journal of Neurophysiology. 116 (5), 2067-2080 (2016).
- Harmon, T. C., Magaram, U., McLean, D. L., Raman, I. M. Distinct responses of Purkinje neurons and roles of simple spikes during associative motor learning in larval zebrafish. eLife. 6, 22537 (2017).
- Zehendner, C. M., et al. Moderate hypoxia followed by reoxygenation results in blood-brain barrier breakdown via oxidative stress-dependent tight-junction protein disruption. PLoS One. 8 (12), 82823 (2013).
- Dhabhar, F. S. The short-term stress response – mother nature’s mechanism for enhancing protection and performance under conditions of threat, challenge, and opportunity. Frontiers of Neuroendocrinology. 49, 175-192 (2018).
