In vivo Bildgebung von vollaktivem Hirngewebe bei wachen Zebrafischlarven und Jungtieren durch Schädel- und Hautentfernung

Paul Schramm; Florian Hetsch; Jochen C. Meier; Reinhard W. Köster

doi:10.3791/62166

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Methodenartikel

In vivo Bildgebung von vollaktivem Hirngewebe bei wachen Zebrafischlarven und Jungtieren durch Schädel- und Hautentfernung

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DOI:

10.3791/62166

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10. Februar 2021

Paul Schramm¹ , Florian Hetsch² , Jochen C. Meier³ , Reinhard W. Köster¹

¹Cellular and Molecular Neurobiology, Zoological Institute, Technische Universität Braunschweig, ²Institute of Pathophysiology, University Medical Center of the Johannes Gutenberg University, ³Cell Physiology, Zoological institute, Technische Universität Braunschweig

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Hier stellen wir eine Methode vor, um das embryonale Gehirn des Zebrafischs in vivo bis hin zu Larven- und Juvenilenstadien abbilden zu können. Dieses mikroinvasive Verfahren, das von elektrophysiologischen Ansätzen adaptiert wurde, bietet Zugang zu zellulären und subzellulären Details reifer Neuronen und kann mit optogenetischen und neuropharmakologischen Studien zur Charakterisierung der Gehirnfunktion und der medikamentösen Intervention kombiniert werden.

Zusammenfassung

Das Verständnis der ephemeren Veränderungen, die während der Entwicklung und Reifung des Gehirns auftreten, erfordert eine detaillierte hochauflösende Bildgebung in Raum und Zeit mit zellulärer und subzellulärer Auflösung. Fortschritte in molekularen und bildgebenden Technologien haben es uns ermöglicht, zahlreiche detaillierte Einblicke in zelluläre und molekulare Mechanismen der Gehirnentwicklung im transparenten Zebrafischembryo zu gewinnen. In jüngster Zeit sind Prozesse der Verfeinerung neuronaler Konnektivität, die in späteren Larvenstadien mehrere Wochen nach der Befruchtung auftreten, die beispielsweise die Kontrolle des Sozialverhaltens, die Entscheidungsfindung oder motivationsgetriebenes Verhalten sind, in den Fokus der Forschung gerückt. In diesen Stadien stört die Pigmentierung der Zebrafischhaut das Eindringen von Licht in das Hirngewebe, und Lösungen für Embryonalstadien, z. B. pharmakologische Hemmung der Pigmentierung, sind nicht mehr realisierbar.

Daher wird eine minimalinvasive chirurgische Lösung für den mikroskopischen Zugang zum Gehirn von wachen Zebrafischen bereitgestellt, die aus elektrophysiologischen Ansätzen abgeleitet ist. Bei Teleosten können Haut- und weichschädeliger Knorpel vorsichtig entfernt werden, indem diese Schichten mikroschält werden, wodurch darunter liegende Neuronen und axonale Bahnen ohne Schäden freigelegt werden. Dies ermöglicht die Erfassung der neuronalen Morphologie, einschließlich synaptischer Strukturen und ihrer molekularen Inhalte, sowie die Beobachtung physiologischer Veränderungen wie Ca²⁺ Transienten oder intrazelluläre Transportereignisse. Darüber hinaus ist eine Abfrage dieser Prozesse mittels pharmakologischer Hemmung oder optogenetischer Manipulation möglich. Dieser Gehirnexpositionsansatz liefert Informationen über strukturelle und physiologische Veränderungen in Neuronen sowie die Korrelation und Interdependenz dieser Ereignisse im lebenden Hirngewebe im Bereich von Minuten oder Stunden. Die Technik eignet sich für die In-vivo-Bildgebung von Zebrafischlarven bis zu 30 Tage nach der Befruchtung, dem neuesten bisher getesteten Entwicklungsstadium. Es bietet somit Zugang zu so wichtigen Fragen wie synaptischer Verfeinerung und Skalierung, axonaler und dendritischer Transport, synaptisches Targeting von Zytoskelettladung oder lokale aktivitätsabhängige Expression. Daher ist mit einem breiten Einsatz für diesen Montage- und Imaging-Ansatz zu rechnen.

Einleitung

Der Zebrafisch (Danio rerio) hat sich in den letzten Jahrzehnten zu einem der beliebtesten Wirbeltiermodellorganismen für Embryonal- und Larvenentwicklungsstudien entwickelt. Die große Fruchtbarkeit der Zebrafischweibchen gepaart mit der schnellen Ex-utero-Entwicklung des Embryos und seiner Transparenz in frühen embryonalen Entwicklungsstadien sind nur einige Schlüsselfaktoren, die Zebrafische zu einem leistungsfähigen Modellorganismus für adressierte Entwicklungsfragen machen¹. Fortschritte in molekulargenetischen Technologien in Kombination mit hochauflösenden In-vivo-Bildgebungsstudien ermöglichten es, zellbiologis....