두개골과 피부 제거에 의해 깨어 얼룩말 물고기 애벌레와 청소년에서 완전히 활성 뇌 조직의 생체 내 이미징
Summary
여기서 우리는 생체 내 최대 애벌레와 청소년 단계에서 제브라피시 배아 뇌를 이미지화하는 방법을 제시합니다. 전기 생리학적 접근법에서 채택된 이 미세침습 절차는 성숙한 뉴런의 세포 및 세포 세포 이하 세부 사항에 대한 액세스를 제공하며 뇌 기능 및 약물 개입을 특성화하기 위한 광유전학 및 신경 약리학과 결합될 수 있습니다.
Abstract
뇌 발달 과 성숙 중에 발생하는 일시적인 변화를 이해하려면 세포 및 세포 외 해상도의 공간과 시간에 대한 상세한 고해상도 이미징이 필요합니다. 분자 및 이미징 기술의 발전으로 투명한 제브라피시 배아에서 뇌 발달의 세포 및 분자 메커니즘에 대한 수많은 상세한 통찰력을 얻을 수 있었습니다. 최근, 사회 행동의 제어, 의사 결정 또는 동기 부여 중심 행동의 예를 들어 제어되는 수정 후 몇 주 후 후 애벌레 단계에서 발생하는 신경 연결의 정제 과정은 연구의 초점으로 이동했다. 이러한 단계에서, 제브라피쉬 피부의 색소 침착은 뇌 조직에 대한 가벼운 침투를 방해하고, 배아 단계에 대한 해결책, 예를 들어, 색소 침착의 약리학적 억제는 더 이상 가능하지 않다.
따라서, 깨어 있는 제브라피시의 뇌에 대한 현미경 접근을 위한 최소침습수술용용액은 전기생리학적 접근법에서 유래되는 것을 제공한다. 텔레오스트에서 피부와 부드러운 두개골 연골은 이러한 층을 미세 하게 벗겨내어 손상없이 기본 뉴런과 축산 관을 노출시킴으로써 조심스럽게 제거 할 수 있습니다. 이를 통해 시냅스 구조와 분자 내용을 포함한 신경 형태학을 기록하고 Ca2+ 과도 또는 세포내 운송 이벤트와 같은 생리적 변화의 관찰을 할 수 있습니다. 또한 약리학적 억제 또는 광유전학 적 조작을 통해 이러한 프로세스의 심문이 가능합니다. 이 두뇌 노출 접근은 분 또는 시간의 범위에 있는 살아있는 두뇌 조직에 있는 이 사건의 상호 관계 그리고 상호 의존뿐만 아니라 뉴런에 있는 구조적이고 생리적인 변경에 관하여 정보를 제공합니다. 이 기술은 지금까지 테스트 된 최신 발달 단계인 수정 후 30 일까지 제브라피시 애벌레의 생체 내 뇌 이미징에 적합합니다. 따라서 시냅스 미세 조정 및 스케일링, 축산 및 수지상 운송, 시토스켈레탈 화물의 시냅스 타겟팅 또는 현지 활동에 의존하는 표현과 같은 중요한 질문에 대한 액세스를 제공합니다. 따라서 이러한 마운팅 및 이미징 접근 방식에 대한 광범위한 사용이 예상될 수 있습니다.
Introduction
최근 수십 년 동안,제브라피쉬(Danio rerio)는배아 및 애벌레 발달 연구를 위한 가장 인기 있는 척추동물 모델 유기체 중 하나로 발전해 왔습니다. 제브라피쉬 암컷의 큰 대변은 배아의 급속한 자궁 발달과 초기 배아 발달 단계 동안의 투명성과 결합된 몇 가지 주요 요인에 불과하며, 제브라피쉬는 발달 문제1을유발하는 강력한 모델 유기체로 만드는 몇 가지 주요 요인일 뿐이다. 생체 내 고해상도와 결합된 분자 유전 기술의 어드밴스는 발달 과정의 기본 세포 생물학적 메커니즘을 해결하는 데허용하였다 2. 특히, 신경 분화, 생리학, 연결 성 및 기능 분야에서, 제브라피쉬는 전례없는 세부 사항에서 분자 역학, 뇌 기능 및 유기체 행동의 상호 작용에 빛을 비추고있다.
그러나, 이 연구 결과의 대부분은 신경계 조직의 투명성이 점진적으로 분실되기 때문에 발달의 첫번째 주 도중 배아 및 초기 애벌레 단계에 제한됩니다. 이러한 단계에서 뇌 조직은 두개골 분화 및 색소 침착3에의해 차폐되는 고해상도 현미경 검사법에 의해 접근이 방지됩니다.
따라서, 신경 분화의 주요 질문, 성숙, 및 뉴런 연결또는 시냅스 스케일링의 정제와 같은 가소성은 공부하기 어렵다. 이러한 세포 과정은 예를 들어 사회적 행동, 의사 결정 또는 동기 부여 기반 행동을 구동하는 세포 메커니즘을 정의하기 위해 중요하며, 몇 주 간의 오래된 애벌레에 대한 제브라피시 연구가 최근 행동 연구4에기초한 주요 연구 결과를 기여했습니다.
몇 주 동안 제브라피시 애벌레에서 색소 침착을 억제하는 약리학적 접근법은 거의 실현 가능하지 않거나5,6,7,8에해로운 효과를 일으킬 수도 있다. 캐스퍼9 또는 크리스탈10과같은 특정 색소 침착 결함을 가진 이중 또는 삼중 돌연변이 균주는 엄청난 귀중한 도구가되었지만 번식에서 힘들고 몇 자손을 제공하며 과도한 근친 교배로 인한 유전 적 기형을 축적 할 위험이 있습니다.
여기서, 대안으로 최소 침습 절차는 어떤 제브라피시 균주에 적용 할 수 있습니다. 이 절차는 생활과 깨어 얼룩말 물고기 애벌레에 있는 신경 활동을 기록하기 위하여 전기 생리학 연구 결과에서 적응되었습니다. 텔레오스트에서, 피부와 부드러운 두개골 연골은 두뇌 혈관과 단단히 섞이지 않기 때문에, 이 층을 마이크로 박리해서 주의 깊게 제거할 수 있습니다. 이것은 손상 없이 신경과 축 관을 포함 하는 뇌 조직을 노출 하 고 신경 형태를 기록에 대 한 허용, 시 냅 스 구조 와 그들의 분자 내용을 포함 하 여, 차례로 Ca 와 같은 생리적 변화의 관찰을 포함2+ 과도 또는 세포 내 전송 이벤트 최대 몇 시간 동안. 더욱이, 설명적 특성을 넘어, 뇌 조직에 직접 접근은 신경 약리학 물질 관리 및 광유전학 적 접근을 통해 성숙한 신경 기능의 심문을 가능하게 합니다. 따라서, 진정한 구조 기능 관계는 이 두뇌 노출 전략을 사용하여 청소년 제브라피시 뇌에서 드러나게 될 수 있다.
Protocol
Representative Results
Discussion
제시된 방법은 생체 내 환경에서 뉴런의 고해상도 이미지를 기록하기 위한 색소 침착을 억제하는 약제와 함께 뇌 격리 또는 제브라피시 애벌레의 치료에 대한 대체 접근법을 제공한다. 이 방법으로 기록 된 이미지의 품질은 이식 된 뇌의 이미지와 유사하지만 자연 조건에서도 마찬가지입니다.
더욱이, 형광의 강도의 손실은 고정제(18)로치료에 대한 ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 특히 훌륭한 동물 보호와 헤르만 도링, 모하메드 엘세이, 솔 포즈- 멘데스, 야콥 폰 트로타, 코말리 발리셰티, 바바라 윈터에게 도움을 준 티모 프리치에게 감사드립니다. 우리는 또한 그들의 의견에 대한 Köster 연구소의 다른 모든 구성원에게 감사드립니다. 이 프로젝트는 독일 연구 재단 (DFG, KO1949/7-2) 프로젝트 241961032 (RWK) 및 분데스 장관 퓌르 빌둥 und Forsung (BMBF)에 의해 부분적으로 투자되었다; 에라넷 뉴런 II CIPRESS 프로젝트 01EW1520 ~ JCM)이 인정된다.
Materials
| Calcium chloride | Roth | A119.1 | |
| Confocal Laser scanning microscope | Leica | TCS SP8 | |
| d-Glucose | Sigma | G8270-1KG | |
| d-Tubocurare | Sigma-Aldrich | T2379-100MG | |
| Glass Capillary type 1 | WPI | 1B150F-4 | |
| Glass Capillary type 2 | Harvard Apparatus | GC100F-10 | |
| Glass Coverslip | deltalab | D102424 | |
| HEPES | Roth | 9105.4 | |
| Hoechst 33342 | Invitrogen (Thermo Fischer) | H3570 | |
| Imaging chamber | Ibidi | 81156 | |
| Potassium chloride | Normapur | 26764298 | |
| LM-Agarose | Condalab | 8050.55 | |
| Magnesium chloride (Hexahydrate) | Roth | A537.4 | |
| Microscope Camera | Leica | DFC9000 GTC | |
| Needle-Puller type 1 | NARISHIGE | Model PC-10 | |
| Needle-Puller type 2 | Sutter Instruments | Model P-2000 | |
| Pasteur-Pipettes 3ml | A.Hartenstein | 20170718 | |
| Sodium chloride | Roth | P029.2 | |
| Sodium hydroxide | Normapur | 28244262 | |
| Tricain | Sigma-Aldrich | E10521-50G | |
| Waterbath | Phoenix Instrument | WB-12 | |
| 35 mm petri dish | Sarstedt | 833900 | |
| 90 mm petri dish | Sarstedt | 821473001 |
References
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