Imágenes in vivo de tejido cerebral completamente activo en larvas y juveniles de pez cebra despiertos mediante la extirpación del cráneo y la piel
Summary
Aquí presentamos un método para obtener imágenes del cerebro embrionario del pez cebra in vivo hasta etapas larvales y juveniles. Este procedimiento microinvasivo, adaptado de enfoques electrofisiológicos, proporciona acceso a detalles celulares y subcelulares de neuronas maduras y se puede combinar con estudios optogenéticos y neurofarmacológicos para caracterizar la función cerebral y la intervención farmacológica.
Abstract
Comprender los cambios efímeros que ocurren durante el desarrollo y la maduración del cerebro requiere imágenes detalladas de alta resolución en el espacio y el tiempo a resolución celular y subcelular. Los avances en las tecnologías moleculares y de imágenes nos han permitido obtener numerosos conocimientos detallados sobre los mecanismos celulares y moleculares del desarrollo cerebral en el embrión transparente de pez cebra. Recientemente, los procesos de refinamiento de la conectividad neuronal que ocurren en etapas larvales posteriores varias semanas después de la fertilización, que son, por ejemplo, el control del comportamiento social, la toma de decisiones o el comportamiento impulsado por la motivación, se han trasladado al foco de la investigación. En estas etapas, la pigmentación de la piel del pez cebra interfiere con la penetración de la luz en el tejido cerebral, y las soluciones para las etapas embrionarias, por ejemplo, la inhibición farmacológica de la pigmentación, ya no son factibles.
Por lo tanto, se proporciona una solución quirúrgica mínimamente invasiva para el acceso de microscopía al cerebro del pez cebra despierto que se deriva de enfoques electrofisiológicos. En los teleóstos, la piel y el cartílago blando del cráneo se pueden eliminar cuidadosamente mediante la micro-peeling de estas capas, exponiendo las neuronas subyacentes y los tractos axonales sin daño. Esto permite registrar la morfología neuronal, incluidas las estructuras sinápticas y su contenido molecular, y la observación de cambios fisiológicos como transitorios de Ca2+ o eventos de transporte intracelular. Además, es factible el interrogatorio de estos procesos mediante inhibición farmacológica o manipulación optogenética. Este enfoque de exposición cerebral proporciona información sobre los cambios estructurales y fisiológicos en las neuronas, así como la correlación e interdependencia de estos eventos en el tejido cerebral vivo en el rango de minutos u horas. La técnica es adecuada para imágenes cerebrales in vivo de larvas de pez cebra hasta 30 días después de la fertilización, la última etapa de desarrollo probada hasta ahora. Por lo tanto, proporciona acceso a cuestiones tan importantes como el refinamiento sináptico y la escala, el transporte axonal y dendrítico, la orientación sináptica de la carga citoesquelética o la expresión dependiente de la actividad local. Por lo tanto, se puede anticipar un amplio uso para este enfoque de montaje e imágenes.
Introduction
En las últimas décadas, el pez cebra(Danio rerio)ha evolucionado como uno de los organismos modelo de vertebrados más populares para estudios de desarrollo embrionario y larvario. La gran fecundidad de las hembras de pez cebra junto con el rápido desarrollo ex utero del embrión y su transparencia durante las primeras etapas del desarrollo embrionario son solo algunos factores clave que hacen del pez cebra un poderoso organismo modelo para abordar las preguntas del desarrollo1. Los avances en las tecnologías genéticas moleculares combinados con estudios de imágenes in vivo de alta resolución permitieron abordar los mecanismos biológicos celulares subyacentes a los procesos de desarrollo2. En particular, en el campo de la diferenciación neuronal, la fisiología, la conectividad y la función, el pez cebra ha arrojado luz sobre la interacción de la dinámica molecular, las funciones cerebrales y el comportamiento organísmico con un detalle sin precedentes.
Sin embargo, la mayoría de estos estudios se restringen a etapas embrionarias y larvales tempranas durante la primera semana de desarrollo, ya que la transparencia del tejido del sistema nervioso se pierde progresivamente. En estas etapas, el tejido cerebral se ve impedido de acceder por los enfoques de microscopía de alta resolución quedando protegido por la diferenciación y pigmentación del cráneo3.
Por lo tanto, las cuestiones clave de la diferenciación neuronal, la maduración y la plasticidad, como el refinamiento de la conectividad neuronal o la escala sináptica, son difíciles de estudiar. Estos procesos celulares son importantes para definir los mecanismos celulares que impulsan, por ejemplo, el comportamiento social, la toma de decisiones o el comportamiento basado en la motivación, áreas a las que la investigación del pez cebra sobre larvas de varias semanas de edad ha contribuido recientemente con hallazgos clave basados en estudios de comportamiento4.
Los enfoques farmacológicos para inhibir la pigmentación en larvas de pez cebra durante varias semanas son apenas factibles o incluso pueden causar efectos perjudiciales5,6,7,8. Las cepas mutantes dobles o triples con defectos específicos de pigmentación, como casper9 o cristal10,se han convertido en herramientas tremendamente valiosas, pero son laboriosas en la reproducción, proporcionan poca descendencia y plantean el peligro de acumular malformaciones genéticas debido a la endogamia excesiva.
Aquí, se proporciona un procedimiento mínimamente invasivo como alternativa que es aplicable a cualquier cepa de pez cebra. Este procedimiento se adaptó a partir de estudios electrofisiológicos para registrar la actividad neuronal en larvas de pez cebra vivas y despiertas. En los teleóstos, la piel y el cartílago blando del cráneo se pueden eliminar cuidadosamente mediante la micro-peeling de estas capas, ya que no están estrechamente entrelazadas con la vasculatura cerebral. Esto permite exponer el tejido cerebral que contiene neuronas y tractos axonales sin daño y registrar la morfología neuronal, incluidas las estructuras sinápticas y su contenido molecular, que a su vez incluye la observación de cambios fisiológicos como transitorios de Ca2 + o eventos de transporte intracelular durante varias horas. Además, más allá de las caracterizaciones descriptivas, el acceso directo al tejido cerebral permite interrogar las funciones neuronales maduras mediante la administración de sustancias neurofarmacológicas y enfoques optogenéticos. Por lo tanto, las verdaderas relaciones de función de la estructura se pueden revelar en el cerebro juvenil del pez cebra utilizando esta estrategia de exposición cerebral.
Protocol
Representative Results
Discussion
El método presentado proporciona un enfoque alternativo para el aislamiento cerebral o el tratamiento de larvas de pez cebra con productos farmacéuticos que inhiben la pigmentación para registrar imágenes de alta resolución de neuronas en su entorno in vivo. La calidad de las imágenes grabadas con este método es comparable a las imágenes de cerebros explantados, pero en condiciones naturales.
Además, se evita una pérdida de intensidad de fluorescencia, ya que no hay necesida…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos especialmente a Timo Fritsch por el excelente cuidado de los animales y a Hermann Döring, Mohamed Elsaey, Sol Pose-Méndez, Jakob von Trotha, Komali Valishetti y Barbara Winter por su útil apoyo. También estamos agradecidos a todos los demás miembros del laboratorio de Köster por sus comentarios. El proyecto fue financiado en parte por el proyecto de la Fundación Alemana de Investigación (DFG, KO1949/7-2) 241961032 (a RWK) y el Bundesministerium für Bildung und Forschung (BMBF; Era-Net NEURON II CIPRESS proyecto 01EW1520 a JCM) es reconocido.
Materials
| Calcium chloride | Roth | A119.1 | |
| Confocal Laser scanning microscope | Leica | TCS SP8 | |
| d-Glucose | Sigma | G8270-1KG | |
| d-Tubocurare | Sigma-Aldrich | T2379-100MG | |
| Glass Capillary type 1 | WPI | 1B150F-4 | |
| Glass Capillary type 2 | Harvard Apparatus | GC100F-10 | |
| Glass Coverslip | deltalab | D102424 | |
| HEPES | Roth | 9105.4 | |
| Hoechst 33342 | Invitrogen (Thermo Fischer) | H3570 | |
| Imaging chamber | Ibidi | 81156 | |
| Potassium chloride | Normapur | 26764298 | |
| LM-Agarose | Condalab | 8050.55 | |
| Magnesium chloride (Hexahydrate) | Roth | A537.4 | |
| Microscope Camera | Leica | DFC9000 GTC | |
| Needle-Puller type 1 | NARISHIGE | Model PC-10 | |
| Needle-Puller type 2 | Sutter Instruments | Model P-2000 | |
| Pasteur-Pipettes 3ml | A.Hartenstein | 20170718 | |
| Sodium chloride | Roth | P029.2 | |
| Sodium hydroxide | Normapur | 28244262 | |
| Tricain | Sigma-Aldrich | E10521-50G | |
| Waterbath | Phoenix Instrument | WB-12 | |
| 35 mm petri dish | Sarstedt | 833900 | |
| 90 mm petri dish | Sarstedt | 821473001 |
References
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