In vivo beeldvorming van volledig actief hersenweefsel in wakkere zebravislarven en juvenielen door schedel- en huidverwijdering
Summary
Hier presenteren we een methode om de zebravis embryonale hersenen in vivo tot larvale en juveniele stadia in beeld te brengen. Deze microinvasieve procedure, aangepast aan elektrofysiologische benaderingen, biedt toegang tot cellulaire en subcellulaire details van volwassen neuronen en kan worden gecombineerd met optogenetica en neurofarmacologische studies voor het karakteriseren van hersenfunctie en medicamenteuze interventie.
Abstract
Het begrijpen van de kortstondige veranderingen die optreden tijdens de ontwikkeling en rijping van de hersenen vereist gedetailleerde beeldvorming met hoge resolutie in ruimte en tijd bij cellulaire en subcellulaire resolutie. Vooruitgang in moleculaire en beeldvormingstechnologieën heeft ons in staat gesteld om tal van gedetailleerde inzichten te krijgen in cellulaire en moleculaire mechanismen van hersenontwikkeling in het transparante zebravisembryo. Onlangs zijn processen van verfijning van neuronale connectiviteit die enkele weken na bevruchting in latere larvale stadia optreden, die bijvoorbeeld controle van sociaal gedrag, besluitvorming of motivatiegestuurd gedrag zijn, in focus van onderzoek gegaan. In deze stadia interfereert pigmentatie van de zebravishuid met lichte penetratie in hersenweefsel, en oplossingen voor embryonale stadia, bijvoorbeeld farmacologische remming van pigmentatie, zijn niet meer haalbaar.
Daarom wordt een minimaal invasieve chirurgische oplossing voor microscopietoegang tot de hersenen van wakkere zebravissen geboden die is afgeleid van elektrofysiologische benaderingen. Bij teleosten kunnen huid en zacht schedelkraakbeen zorgvuldig worden verwijderd door deze lagen te micropelen, waardoor onderliggende neuronen en axonale tractus zonder schade worden blootgelegd. Dit maakt het mogelijk om neuronale morfologie, inclusief synaptische structuren en hun moleculaire inhoud, en de observatie van fysiologische veranderingen zoals Ca2 + transiënten of intracellulaire transportgebeurtenissen vast te houden. Bovendien is ondervraging van deze processen door middel van farmacologische remming of optogenetische manipulatie mogelijk. Deze benadering van blootstelling aan de hersenen biedt informatie over structurele en fysiologische veranderingen in neuronen, evenals de correlatie en onderlinge afhankelijkheid van deze gebeurtenissen in levend hersenweefsel in het bereik van minuten of uren. De techniek is geschikt voor in vivo hersenbeeldvorming van zebravislarven tot 30 dagen na bevruchting, de nieuwste ontwikkelingsfase die tot nu toe is getest. Het biedt dus toegang tot belangrijke vragen zoals synaptische verfijning en schaalvergroting, axonale en dendritische transport, synaptische targeting van cytoskeletlading of lokale activiteitsafhankelijke expressie. Daarom kan een breed gebruik voor deze montage- en beeldvormingsbenadering worden verwacht.
Introduction
In de afgelopen decennia is de zebravis (Danio rerio) geëvolueerd als een van de meest populaire gewervelde modelorganismen voor embryonale en larvale ontwikkelingsstudies. De grote vruchtbaarheid van zebravis vrouwtjes in combinatie met de snelle ex utero ontwikkeling van het embryo en de transparantie ervan tijdens vroege embryonale ontwikkelingsfasen zijn slechts een paar belangrijke factoren die zebravissen tot een krachtig modelorganisme maken om ontwikkelingsvragen aan te gaan1. Vooruitgang in moleculair genetische technologieën in combinatie met hoge resolutie in vivo beeldvormingsstudies maakten het mogelijk celbiologische mechanismen aan te pakken die ten grondslag liggen aan ontwikkelingsprocessen2. Met name op het gebied van neuronale differentiatie, fysiologie, connectiviteit en functie heeft zebravis in ongekende details licht geworpen op het samenspel van moleculaire dynamica, hersenfuncties en organismegedrag.
Toch zijn de meeste van deze studies beperkt tot embryonale en vroege larvale stadia tijdens de eerste week van ontwikkeling, omdat transparantie van het zenuwstelselweefsel geleidelijk verloren gaat. In deze stadia wordt hersenweefsel verhinderd door microscopiebenaderingen met hoge resolutie die worden afgeschermd door schedeldifferentiatie en pigmentatie3.
Daarom zijn belangrijke vragen over neuronale differentiatie, rijping en plasticiteit, zoals de verfijning van neuronale connectiviteit of synaptische schaling, moeilijk te bestuderen. Deze cellulaire processen zijn belangrijk om cellulaire mechanismen te definiëren die bijvoorbeeld sociaal gedrag, besluitvorming of op motivatie gebaseerd gedrag stimuleren, gebieden waaraan zebravisonderzoek op enkele weken oude larven onlangs belangrijke bevindingen heeft bijgedragen op basis van gedragsstudies4.
Farmacologische benaderingen om pigmentatie bij zebravislarven gedurende enkele weken te remmen zijn nauwelijks haalbaar of kunnen zelfs schadelijke effecten veroorzaken5,6,7,8. Dubbele of drievoudige mutante stammen met specifieke pigmentatiedefecten, zoals casper9 of kristal10,zijn enorm waardevolle hulpmiddelen geworden, maar zijn moeizaam in de fokkerij, bieden weinig nakomelingen en vormen het gevaar van het accumuleren van genetische misvormingen als gevolg van overmatige inteelt.
Hier wordt een minimale invasieve procedure als alternatief geboden die van toepassing is op elke zebravisstam. Deze procedure werd aangepast van elektrofysiologische studies om neuronale activiteit in levende en wakkere zebravislarven vast te leggen. Bij teleosten kunnen huid en zacht schedelkraakbeen zorgvuldig worden verwijderd door deze lagen te micropelen, omdat ze niet nauw verweven zijn met de vasculatuur van de hersenen. Dit maakt het mogelijk om hersenweefsel met neuronen en axonale tractus zonder schade bloot te stellen en voor het registreren van neuronale morfologie, inclusief synaptische structuren en hun moleculaire inhoud, die op hun beurt de observatie van fysiologische veranderingen zoals Ca2 + transiënten of intracellulaire transportgebeurtenissen gedurende maximaal enkele uren omvatten. Bovendien, naast beschrijvende karakteriseringen, maakt de directe toegang tot hersenweefsel ondervraging van volwassen neuronale functies mogelijk door middel van neurofarmacologische toediening van stoffen en optogenetische benaderingen. Daarom kunnen echte structuurfunctierelaties worden onthuld in de juveniele zebravishersenen met behulp van deze hersenblootstellingsstrategie.
Protocol
Representative Results
Discussion
De gepresenteerde methode biedt een alternatieve benadering van hersenisolatie of de behandeling van zebravislarven met geneesmiddelen die pigmentatie remmen voor het opnemen van hoge resolutie beelden van neuronen in hun in vivo omgeving. De kwaliteit van beelden die met deze methode zijn opgenomen, is vergelijkbaar met beelden van uitgeplante hersenen, maar onder natuurlijke omstandigheden.
Bovendien wordt een verlies in intensiteit van fluorescentie vermeden, omdat er geen behandel…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We danken vooral Timo Fritsch voor de uitstekende verzorging van dieren en Hermann Döring, Mohamed Elsaey, Sol Pose-Méndez, Jakob von Trotha, Komali Valishetti en Barbara Winter voor hun behulpzame steun. We zijn ook alle andere leden van het Köster lab dankbaar voor hun feedback. Het project werd gedeeltelijk gefinancierd door de Duitse Stichting voor Onderzoek (DFG, KO1949/7-2) project 241961032 (aan RWK) en het Bundesministerium für Bildung und Forschung (BMBF; Era-Net NEURON II CIPRESS project 01EW1520 naar JCM) wordt erkend.
Materials
| Calcium chloride | Roth | A119.1 | |
| Confocal Laser scanning microscope | Leica | TCS SP8 | |
| d-Glucose | Sigma | G8270-1KG | |
| d-Tubocurare | Sigma-Aldrich | T2379-100MG | |
| Glass Capillary type 1 | WPI | 1B150F-4 | |
| Glass Capillary type 2 | Harvard Apparatus | GC100F-10 | |
| Glass Coverslip | deltalab | D102424 | |
| HEPES | Roth | 9105.4 | |
| Hoechst 33342 | Invitrogen (Thermo Fischer) | H3570 | |
| Imaging chamber | Ibidi | 81156 | |
| Potassium chloride | Normapur | 26764298 | |
| LM-Agarose | Condalab | 8050.55 | |
| Magnesium chloride (Hexahydrate) | Roth | A537.4 | |
| Microscope Camera | Leica | DFC9000 GTC | |
| Needle-Puller type 1 | NARISHIGE | Model PC-10 | |
| Needle-Puller type 2 | Sutter Instruments | Model P-2000 | |
| Pasteur-Pipettes 3ml | A.Hartenstein | 20170718 | |
| Sodium chloride | Roth | P029.2 | |
| Sodium hydroxide | Normapur | 28244262 | |
| Tricain | Sigma-Aldrich | E10521-50G | |
| Waterbath | Phoenix Instrument | WB-12 | |
| 35 mm petri dish | Sarstedt | 833900 | |
| 90 mm petri dish | Sarstedt | 821473001 |
References
- Embryology. Zebrafish Development Available from: https://embryology.med.unsw.edu.au/embryology/index.php/Zebrafish_Development (2020)
- Sassen, W. A., Köster, R. W. A molecular toolbox for genetic manipulation of zebrafish. Advances in Genomics and Genetics. Dove Medical Press. 2015 (5), 151-163 (2015).
- Singh, A. P., Nüsslein-Volhard, C. Zebrafish stripes as a model for vertebrate colour pattern formation. Current Biology. 25 (2), 81-92 (2015).
- Kalueff, A. V., et al. Time to recognize zebrafish ‘affective’ behavior. Brill: Behaviour. 149 (10-12), 1019-1036 (2012).
- Karlsson, J., von Hofsten, J., Olsson, P. -. E. Generating transparent zebrafish: a refined method to improve detection of gene expression during embryonic development. Marine Biotechnology. 3, 522-527 (2001).
- Bohnsack, B. L., Gallina, D., Kahana, A. Phenothiourea sensitizes zebrafish cranial neural crest and extraocular muscle development to changes in retinoic acid and IGF signaling. PloS One. 6, 22991 (2011).
- Elsalini, O. A., Rohr, K. B. Phenylthiourea disrupts thyroid function in developing zebrafish. Development Genes and Evolution. 212, 593-598 (2003).
- Baumann, L., Ros, A., Rehberger, K., Neuhauss, S. C. F., Segner, H. Thyroid disruption in zebrafish (Danio rerio) larvae: Different molecular response patterns lead to impaired eye development and visual functions. Aquatic Toxicology. 172, 44-55 (2016).
- White, R., et al. Transparent adult zebrafish as a tool for in vivo transplantation analysis. Cell Stem Cell. 2, 183-189 (2008).
- Antinucci, P., Hindges, R. A crystal-clear zebrafish for in vivo imaging. Scientific Reports. 6, 29490 (2016).
- Burr, S. A., Leung, Y. L. Curare (d-Tubocurarine). Encyclopedia of Toxicology (3rd Edition). , 1088-1089 (2014).
- Gesler, H. M., Hoppe, J. 3,6-bis(3-diethylaminopropoxy) pyridazine bismethiodide, a long-acting neuromuscular blocking agent. The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 118 (4), 395-406 (1956).
- Furman, B. . Alpha Bungarotxin. Reference Module in Biomedical Sciences. , (2018).
- Attili, S., Hughes, S. M. Anaesthetic tricaine acts preferentially on neural voltage-gated sodium channels and fails to block directly evoked muscle contraction. PLoS One. 9 (8), 103751 (2014).
- Namikawa, K., et al. Modeling neurodegenerative spinocerebellar ataxia type 13 in zebrafish using a Purkinje neuron specific tunable coexpression system. Journal of Neuroscience. 39 (20), 3948-3969 (2019).
- Hennig, M. Theoretical models of synaptic short term plasticity. Frontiers in Computational Neuroscience. 7 (45), (2013).
- Wang, Y., et al. Moesin1 and Ve-cadherin are required in endothelial cells during in vivo tubulogenesis. Development. 137, 3119-3128 (2010).
- Hobro, A., Smith, N. An evaluation of fixation methods: Spatial and compositional cellular changes observed by Raman imaging. Vibrational Spectroscopy. 91, 31-45 (2017).
- Knogler, L. D., Kist, A. M., Portugues, R. Motor context dominates output from purkinje cell functional regions during reflexive visuomotor behaviours. eLife. 8, 42138 (2019).
- Hsieh, J., Ulrich, B., Issa, F. A., Wan, J., Papazian, D. M. Rapid development of Purkinje cell excitability, functional cerebellar circuit, and afferent sensory input to cerebellum in zebrafish. Frontier in Neural Circuits. 8 (147), (2014).
- Scalise, K., Shimizu, T., Hibi, M., Sawtell, N. B. Responses of cerebellar Purkinje cells during fictive optomotor behavior in larval zebrafish. Journal of Neurophysiology. 116 (5), 2067-2080 (2016).
- Harmon, T. C., Magaram, U., McLean, D. L., Raman, I. M. Distinct responses of Purkinje neurons and roles of simple spikes during associative motor learning in larval zebrafish. eLife. 6, 22537 (2017).
- Zehendner, C. M., et al. Moderate hypoxia followed by reoxygenation results in blood-brain barrier breakdown via oxidative stress-dependent tight-junction protein disruption. PLoS One. 8 (12), 82823 (2013).
- Dhabhar, F. S. The short-term stress response – mother nature’s mechanism for enhancing protection and performance under conditions of threat, challenge, and opportunity. Frontiers of Neuroendocrinology. 49, 175-192 (2018).
