Imaging in vivo del tessuto cerebrale completamente attivo in larve di zebrafish svegli e giovani mediante rimozione del cranio e della pelle
Summary
Qui presentiamo un metodo per immaginare il cervello embrionale del pesce zebra in vivo fino agli stadi larvale e giovanile. Questa procedura microinvasiva, adattata da approcci elettrofisiologici, fornisce l’accesso ai dettagli cellulari e subcellulari del neurone maturo e può essere combinata con studi optogenetici e neurofarmacologici per caratterizzare la funzione cerebrale e l’intervento farmacologico.
Abstract
Comprendere i cambiamenti effimeri che si verificano durante lo sviluppo e la maturazione del cervello richiede un’imaging dettagliato ad alta risoluzione nello spazio e nel tempo a risoluzione cellulare e subcellulare. I progressi nelle tecnologie molecolari e di imaging ci hanno permesso di ottenere numerose informazioni dettagliate sui meccanismi cellulari e molecolari dello sviluppo del cervello nell’embrione trasparente di zebrafish. Recentemente, i processi di raffinamento della connettività neuronale che si verificano in fasi larvali successive diverse settimane dopo la fecondazione, che sono ad esempio il controllo del comportamento sociale, il processo decisionale o il comportamento guidato dalla motivazione, si sono spostati al centro della ricerca. In queste fasi, la pigmentazione della pelle del pesce zebra interferisce con la penetrazione della luce nel tessuto cerebrale e le soluzioni per gli stadi embrionali, ad esempio l’inibizione farmacologica della pigmentazione, non sono più fattibili.
Pertanto, viene fornita una soluzione chirurgica minimamente invasiva per l’accesso al microscopio al cervello del pesce zebra sveglio che deriva da approcci elettrofisiologici. Nei teleostei, la pelle e la cartilagine cranica morbida possono essere accuratamente rimosse micro-peeling di questi strati, esponendo i neuroni sottostanti e i tratti assonali senza danni. Ciò consente di registrare la morfologia neuronale, comprese le strutture sinaptiche e il loro contenuto molecolare, e l’osservazione di cambiamenti fisiologici come i transitori di Ca2+ o gli eventi di trasporto intracellulare. Inoltre, è possibile interrogare questi processi mediante inibizione farmacologica o manipolazione optogenetica. Questo approccio di esposizione cerebrale fornisce informazioni sui cambiamenti strutturali e fisiologici nei neuroni, nonché sulla correlazione e l’interdipendenza di questi eventi nel tessuto cerebrale vivo nell’intervallo di minuti o ore. La tecnica è adatta per l’imaging cerebrale in vivo di larve di zebrafish fino a 30 giorni dopo la fecondazione, l’ultimo stadio di sviluppo testato finora. Fornisce quindi l’accesso a questioni importanti come il raffinamento e il ridimensionamento sinaptico, il trasporto assonale e dendritico, il targeting sinaptico del carico citoscheletrico o l’espressione locale dipendente dall’attività. Pertanto, è possibile prevedere un ampio utilizzo di questo approccio di montaggio e imaging.
Introduction
Negli ultimi decenni, il pesce zebra (Danio rerio) si è evoluto come uno degli organismi modello di vertebrati più popolari per gli studi sullo sviluppo embrionale e larvale. La grande fecondità delle femmine di zebrafish unita al rapido sviluppo ex utero dell’embrione e alla sua trasparenza durante le prime fasi di sviluppo embrionale sono solo alcuni dei fattori chiave che rendono il pesce zebra un potente organismo modello per affrontare le domande sullo sviluppo1. I progressi nelle tecnologie genetiche molecolari combinati con studi di imaging in vivo ad alta risoluzione hanno permesso di affrontare i meccanismi biologici cellulari alla base dei processi di sviluppo2. In particolare, nel campo della differenziazione neuronale, della fisiologia, della connettività e della funzione, zebrafish ha fatto luce sull’interazione tra dinamica molecolare, funzioni cerebrali e comportamento organismico con dettagli senza precedenti.
Tuttavia, la maggior parte di questi studi sono limitati agli stadi embrionali e larvali precoci durante la prima settimana di sviluppo, poiché la trasparenza del tessuto del sistema nervoso viene progressivamente persa. In queste fasi, il tessuto cerebrale è impedito dall’accesso con approcci microscopici ad alta risoluzione che vengono schermati dalla differenziazione del cranio e dalla pigmentazione3.
Pertanto, le questioni chiave della differenziazione neuronale, della maturazione e della plasticità come il perfezionamento della connettività neuronale o il ridimensionamento sinaptico sono difficili da studiare. Questi processi cellulari sono importanti per definire i meccanismi cellulari che guidano, ad esempio, il comportamento sociale, il processo decisionale o il comportamento basato sulla motivazione, aree a cui la ricerca sui pesci zebra su larve di diverse settimane ha recentemente contribuito con risultati chiave basati su studi comportamentali4.
Gli approcci farmacologici per inibire la pigmentazione nelle larve di zebrafish per diverse settimane sono a malapena fattibili o possono persino causare effetti dannosi5,6,7,8. I ceppi mutanti doppi o tripli con specifici difetti di pigmentazione, come casper9 o crystal10, sono diventati strumenti tremendamente preziosi, ma sono laboriosi nell’allevamento, forniscono pochi figli e rappresentano il pericolo di accumulare malformazioni genetiche a causa di un’eccessiva consanguineità.
Qui, viene fornita una procedura minimamente invasiva come alternativa applicabile a qualsiasi ceppo di zebrafish. Questa procedura è stata adattata da studi elettrofisiologici per registrare l’attività neuronale nelle larve di zebrafish viventi e sveglie. Nei teleostei, la pelle e la cartilagine morbida del cranio possono essere accuratamente rimosse micro-peeling di questi strati, perché non sono strettamente intrecciati con la vascolarizzazione cerebrale. Ciò consente di esporre il tessuto cerebrale contenente neuroni e tratti assonali senza danni e di registrare la morfologia neuronale, comprese le strutture sinaptiche e il loro contenuto molecolare, che a sua volta include l’osservazione di cambiamenti fisiologici come transitori di Ca2+ o eventi di trasporto intracellulare per un massimo di diverse ore. Inoltre, al di là delle caratterizzazioni descrittive, l’accesso diretto al tessuto cerebrale consente l’interrogazione delle funzioni neuronali mature mediante la somministrazione di sostanze neurofarmacologiche e approcci optogenetici. Pertanto, le vere relazioni funzionali alla struttura possono essere rivelate nel cervello del pesce zebra giovanile utilizzando questa strategia di esposizione cerebrale.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il metodo presentato fornisce un approccio alternativo all’isolamento cerebrale o al trattamento delle larve di zebrafish con farmaci che inibiscono la pigmentazione per la registrazione di immagini ad alta risoluzione di neuroni nel loro ambiente in vivo. La qualità delle immagini registrate con questo metodo è paragonabile alle immagini provenienti da cervelli espiantati, ma in condizioni naturali.
Inoltre, si evita una perdita di intensità di fluorescenza, perché non è necessa…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo in particolare Timo Fritsch per l’eccellente cura degli animali e Hermann Döring, Mohamed Elsaey, Sol Pose-Méndez, Jakob von Trotha, Komali Valishetti e Barbara Winter per il loro utile supporto. Siamo anche grati a tutti gli altri membri del laboratorio Köster per il loro feedback. Il progetto è stato finanziato in parte dal progetto della Fondazione tedesca per la ricerca (DFG, KO1949/7-2) 241961032 (a RWK) e dal Bundesministerium für Bildung und Forschung (BMBF; È riconosciuto il progetto ERA-Net NEURON II CIPRESS 01EW1520 to JCM).
Materials
| Calcium chloride | Roth | A119.1 | |
| Confocal Laser scanning microscope | Leica | TCS SP8 | |
| d-Glucose | Sigma | G8270-1KG | |
| d-Tubocurare | Sigma-Aldrich | T2379-100MG | |
| Glass Capillary type 1 | WPI | 1B150F-4 | |
| Glass Capillary type 2 | Harvard Apparatus | GC100F-10 | |
| Glass Coverslip | deltalab | D102424 | |
| HEPES | Roth | 9105.4 | |
| Hoechst 33342 | Invitrogen (Thermo Fischer) | H3570 | |
| Imaging chamber | Ibidi | 81156 | |
| Potassium chloride | Normapur | 26764298 | |
| LM-Agarose | Condalab | 8050.55 | |
| Magnesium chloride (Hexahydrate) | Roth | A537.4 | |
| Microscope Camera | Leica | DFC9000 GTC | |
| Needle-Puller type 1 | NARISHIGE | Model PC-10 | |
| Needle-Puller type 2 | Sutter Instruments | Model P-2000 | |
| Pasteur-Pipettes 3ml | A.Hartenstein | 20170718 | |
| Sodium chloride | Roth | P029.2 | |
| Sodium hydroxide | Normapur | 28244262 | |
| Tricain | Sigma-Aldrich | E10521-50G | |
| Waterbath | Phoenix Instrument | WB-12 | |
| 35 mm petri dish | Sarstedt | 833900 | |
| 90 mm petri dish | Sarstedt | 821473001 |
References
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