In vivo Imaging af fuldt aktivt hjernevæv i vågen zebrafisk larver og unge fugle ved kraniet og fjernelse af huden

Summary

Her præsenterer vi en metode til at forestille zebrafisk embryonale hjerne in vivo op til larve og unge stadier. Denne mikroinvasive procedure, der er tilpasset fra elektrofysiologiske tilgange, giver adgang til cellulære og subcellulære detaljer om moden neuron og kan kombineres med optogenetik og neurofarmakologiske undersøgelser til karakterisering af hjernefunktion og lægemiddelintervention.

Abstract

Forståelse af de kortvarige ændringer, der opstår under hjernens udvikling og modning kræver detaljeret høj opløsning billeddannelse i tid og rum på cellulære og subcellulære opløsning. Fremskridt inden for molekylære og billeddannelsesteknologier har gjort det muligt for os at få mange detaljerede indsigter i cellulære og molekylære mekanismer i hjernens udvikling i det gennemsigtige zebrafiskembryo. For nylig er processer til raffinement af neuronal forbindelse, der forekommer på senere larvestadier flere uger efter befrugtning, som for eksempel er kontrol over social adfærd, beslutningstagning eller motivationsdrevet adfærd, flyttet i fokus for forskning. På disse stadier forstyrrer pigmentering af zebrafiskhuden lysindtrængning i hjernevævet, og løsninger til embryonale stadier, f.eks. farmakologisk hæmning af pigmentering, er ikke længere mulige.

Derfor gives en minimalt invasiv kirurgisk løsning til mikroskopiadgang til hjernen af vågen zebrafisk, der stammer fra elektrofysiologiske tilgange. I teleosts, hud og bløde kraniet brusk kan forsigtigt fjernes ved mikro-peeling disse lag, udsætter underliggende neuroner og axonale skrifter uden skader. Dette giver mulighed for registrering af neuronal morfologi, herunder synaptiske strukturer og deres molekylære indhold, og observation af fysiologiske ændringer såsom Ca^{2 +} transienter eller intracellulære transporthændelser. Desuden er det muligt at forhøre disse processer ved hjælp af farmakologisk hæmning eller optogenetisk manipulation. Denne hjerneeksponeringsmetode giver information om strukturelle og fysiologiske ændringer i neuroner samt sammenhængen og den indbyrdes afhængighed mellem disse hændelser i levende hjernevæv inden for få minutter eller timer. Teknikken er velegnet til in vivo hjernescanning af zebrafisk larver op til 30 dage efter befrugtning, den seneste udviklingsstadie testet hidtil. Det giver således adgang til så vigtige spørgsmål som synaptisk raffinement og skalering, axonal og dendritisk transport, synaptisk målretning af cytoskeletal last eller lokalt aktivitetsafhængigt udtryk. Derfor kan der forventes en bred anvendelse af denne monterings- og billedbehandlingsmetode.

Introduction

I løbet af de seneste årtier har zebrafisken (Danio rerio) udviklet sig som en af de mest populære hvirveldyrmodelorganismer til embryonale og larveudviklingsundersøgelser. Zebrafiskhunnernes store fecundity kombineret med embryoets hurtige udvikling og dets gennemsigtighed i de tidlige embryonale udviklingsstadier er blot nogle få nøglefaktorer, der gør zebrafisk til en stærk modelorganisme til at løse udviklingsmæssige spørgsmål¹. Fremskridt inden for molekylære genteknologier kombineret med undersøgelser med høj opløsning in vivo-billeddannelse gjorde det muligt at behandle cellebiologiske mekanismer, der ligger til grund for udviklingsprocesser². Især inden for neuronal differentiering, fysiologi, forbindelse og funktion har zebrafisk kastet lys over samspillet mellem molekylær dynamik, hjernefunktioner og organismeadfærd i hidtil usete detaljer.

Men de fleste af disse undersøgelser er begrænset til embryonale og tidlige larvestadier i løbet af den første uge af udviklingen, da gennemsigtigheden af nervesystemvævet gradvist går tabt. På disse stadier forhindres hjernevæv fra adgang ved højopløsningsmikroskopimetoder, der bliver afskærmet af kraniedifferentiering og pigmentering³.

Derfor er centrale spørgsmål om neuronal differentiering, modning og plasticitet såsom forfinelse af neuronal forbindelse eller synaptisk skalering vanskelige at studere. Disse cellulære processer er vigtige for at definere cellulære mekanismer, der kører, for eksempel social adfærd, beslutningstagning eller motivationsbaseret adfærd, områder, som zebrafisk forsker i flere ugers gamle larver for nylig har bidraget med nøgleresultater baseret på adfærdsundersøgelser⁴.

Farmakologiske metoder til at hæmme pigmentering i zebrafisklarver i flere uger er næppe gennemførlige eller kan endda forårsage skadelige virkninger^5,6,7,8. Dobbelt eller tredobbelt mutant stammer med specifikke pigmenteringsdefekter, såsom casper⁹ eller krystal¹⁰, er blevet enormt værdifulde værktøjer, men er besværlige i avl, giver få afkom og udgør faren for at akkumulere genetiske misdannelser på grund af overdreven indavl.

Her gives en minimal invasiv procedure som et alternativ, der gælder for enhver zebrafiskstamme. Denne procedure blev tilpasset fra elektrofysiologiske undersøgelser for at registrere neuronal aktivitet i levende og vågne zebrafisklarver. I teleosts, hud og bløde kraniet brusk kan forsigtigt fjernes ved mikro-peeling disse lag, fordi de ikke er tæt sammenvævet med hjernen vaskulatur. Dette giver mulighed for at udsætte hjernevæv, der indeholder neuroner og axonale skrifter uden skader og til registrering af neuronal morfologi, herunder synaptiske strukturer og deres molekylære indhold, som igen omfatter observation af fysiologiske ændringer som Ca^{2 +} transienter eller intracellulære transporthændelser i op til flere timer. Ud over beskrivende karakteristik muliggør den direkte adgang til hjernevæv desuden forhør af modne neuronale funktioner ved hjælp af neurofarmakologisk stofbrug og optogenetiske tilgange. Derfor kan ægte strukturfunktionsforhold afsløres i den unge zebrafiskhjerne ved hjælp af denne hjerneeksponeringsstrategi.

Protocol

Alt dyrearbejde, der beskrives her, er i overensstemmelse med lovbestemmelser (EU-direktiv 2010/63). Vedligeholdelse og håndtering af fisk er blevet godkendt af de lokale myndigheder og af dyrevelfærdsrepræsentanten for Technische Universität Braunschweig. 1. Fremstilling af kunstig cerebro spinalvæske (ACSF), lavt smeltende agarose og skarpe glasnåle Forbered ACSF ved at opløse de anførte kemikalier ved følgende koncentrationer i destilleret vand. 134 mM NaCl (58,44 g/mol),…

Representative Results

Figur 3AC viser en 14 dpf larve af den transgene linje Tg[-7.5Ca8:GFP]bz12[15] med kraniet stadig intakt. Pigmentcellerne i den overlejrende hud fordeles over hele hovedet og forstyrrer fluorescenssignalet i interesseområdet (her lillehjernen). Med larven i denne tilstand er det ikke muligt at opnå billeder i høj opløsning af hjernen. Figur 3B viser en larve af sa…

Discussion

Den præsenterede metode giver en alternativ tilgang til hjerneisolation eller behandling af zebrafisklarver med lægemidler, der hæmmer pigmentering til optagelse af billeder i høj opløsning af neuroner i deres in vivo-miljø. Kvaliteten af billeder optaget med denne metode kan sammenlignes med billeder fra udplantede hjerner, men under naturlige forhold.

Desuden undgås et tab i intensiteten af fluorescens, fordi der ikke er behov for behandling med fikseringsmidler<sup class="xr…

Materials

Calcium chloride	Roth	A119.1
Confocal Laser scanning microscope	Leica	TCS SP8
d-Glucose	Sigma	G8270-1KG
d-Tubocurare	Sigma-Aldrich	T2379-100MG
Glass Capillary type 1	WPI	1B150F-4
Glass Capillary type 2	Harvard Apparatus	GC100F-10
Glass Coverslip	deltalab	D102424
HEPES	Roth	9105.4
Hoechst 33342	Invitrogen (Thermo Fischer)	H3570
Imaging chamber	Ibidi	81156
Potassium chloride	Normapur	26764298
LM-Agarose	Condalab	8050.55
Magnesium chloride (Hexahydrate)	Roth	A537.4
Microscope Camera	Leica	DFC9000 GTC
Needle-Puller type 1	NARISHIGE	Model PC-10
Needle-Puller type 2	Sutter Instruments	Model P-2000
Pasteur-Pipettes 3ml	A.Hartenstein	20170718
Sodium chloride	Roth	P029.2
Sodium hydroxide	Normapur	28244262
Tricain	Sigma-Aldrich	E10521-50G
Waterbath	Phoenix Instrument	WB-12
35 mm petri dish	Sarstedt	833900
90 mm petri dish	Sarstedt	821473001