जाग ज़ेब्राफिश लार्वा और खोपड़ी और त्वचा हटाने द्वारा किशोरों में पूरी तरह से सक्रिय मस्तिष्क ऊतक के वीवो इमेजिंग में
Summary
यहां हम लार्वा और किशोर चरणों तक वीवो में जेब्राफिश भ्रूण मस्तिष्क की छवि के लिए एक विधि प्रस्तुत करते हैं। इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल दृष्टिकोणों से अनुकूलित यह माइक्रोइनवेसिव प्रक्रिया परिपक्व न्यूरॉन के सेलुलर और उपकोशिक विवरण तक पहुंच प्रदान करती है और मस्तिष्क समारोह और दवा हस्तक्षेप की विशेषता के लिए ऑप्टोजेनेटिक्स और न्यूरोफार्माकोलॉजिकल अध्ययनों के साथ जोड़ा जा सकता है।
Abstract
मस्तिष्क के विकास और परिपक्वता के दौरान होने वाले क्षणभंगुर परिवर्तनों को समझना सेलुलर और उपकोशिकीय संकल्प पर अंतरिक्ष और समय में विस्तृत उच्च-रिज़ॉल्यूशन इमेजिंग की आवश्यकता होती है। आणविक और इमेजिंग प्रौद्योगिकियों में प्रगति ने हमें पारदर्शी ज़ेब्राफ़िश भ्रूण में मस्तिष्क के विकास के सेलुलर और आणविक तंत्र में कई विस्तृत अंतर्दृष्टि प्राप्त करने की अनुमति दी है। हाल ही में, निषेचन के कई हफ्तों बाद लार्वा चरणों में होने वाले न्यूरोनल कनेक्टिविटी के शोधन की प्रक्रियाएं, जो उदाहरण के लिए सामाजिक व्यवहार, निर्णय लेने या प्रेरणा-चालित व्यवहार का नियंत्रण हैं, अनुसंधान के ध्यान में चले गए हैं। इन चरणों में, ज़ेब्राफ़िश त्वचा का पिगमेंटेशन मस्तिष्क के ऊतकों में प्रकाश प्रवेश के साथ हस्तक्षेप करता है, और भ्रूणीय चरणों के समाधान, उदाहरण के लिए, पिगमेंटेशन का औषधीय अवरोध, अब संभव नहीं है।
इसलिए, जाग जेब्राफिश के मस्तिष्क तक माइक्रोस्कोपी पहुंच के लिए एक न्यूनतम आक्रामक शल्य चिकित्सा समाधान प्रदान किया जाता है जो इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल दृष्टिकोण से प्राप्त होता है। टेलीओस्ट में, त्वचा और नरम खोपड़ी उपास्थि को इन परतों को माइक्रो-छीलने से सावधानीपूर्वक हटाया जा सकता है, जो अंतर्निहित न्यूरॉन्स और अक्षीय क्षेत्रों को नुकसान के बिना उजागर करता है। यह सिनैप्टिक संरचनाओं और उनकी आणविक सामग्री सहित न्यूरोनल आकृति विज्ञान को रिकॉर्ड करने और सीए2 + यात्रियों या इंट्रासेलुलर परिवहन घटनाओं जैसे शारीरिक परिवर्तनों के अवलोकन की अनुमति देता है। इसके अलावा, औषधीय अवरोध या ऑप्टोजेनेटिक हेरफेर के माध्यम से इन प्रक्रियाओं से पूछताछ संभव है। यह मस्तिष्क जोखिम दृष्टिकोण न्यूरॉन्स में संरचनात्मक और शारीरिक परिवर्तनों के साथ-साथ मिनट या घंटों की सीमा में जीवित मस्तिष्क ऊतक में इन घटनाओं के सहसंबंध और परस्पर निर्भरता के बारे में जानकारी प्रदान करता है। यह तकनीक निषेचन के बाद 30 दिनों तक जेब्राफिश लार्वा के वीवो ब्रेन इमेजिंग में उपयुक्त है, अब तक का नवीनतम विकासात्मक चरण परीक्षण किया गया है। इस प्रकार, यह सिनैप्टिक परिष्करण और स्केलिंग, अक्षीय और डेंड्रिटिक परिवहन, साइटोस्केलेल कार्गो या स्थानीय गतिविधि-निर्भर अभिव्यक्ति के सिनैप्टिक लक्ष्यीकरण जैसे महत्वपूर्ण प्रश्नों तक पहुंच प्रदान करता है। इसलिए, इस बढ़ते और इमेजिंग दृष्टिकोण के लिए एक व्यापक उपयोग का अनुमान लगाया जा सकता है।
Introduction
हाल के दशकों में, जेब्राफिश(डैनियो रेरियो)भ्रूण और लार्वा विकास अध्ययनों के लिए सबसे लोकप्रिय कशेरुकी मॉडल जीवों में से एक के रूप में विकसित हुआ है। जेब्राफिश मादाओं की बड़ी मलकंपना के साथ – साथ भ्रूण के तेजी से पूर्व गर्भाशय विकास और प्रारंभिक भ्रूणीय विकास के चरणों के दौरान इसकी पारदर्शिता केवल कुछ प्रमुख कारक हैं जो जेब्राफिश को विकासात्मक प्रश्नों को दूर करने के लिए एक शक्तिशाली आदर्श जीव बनाते हैं1। आणविक आनुवंशिक प्रौद्योगिकियों में प्रगति जो वीवो इमेजिंग अध्ययनों में उच्च संकल्प के साथ संयुक्त रूप से विकास प्रक्रियाओं में अंतर्निहित कोशिका जैविक तंत्र को संबोधित करने के लिए अनुमति दी गई2. विशेष रूप से, न्यूरोनल भेदभाव, शरीर विज्ञान, कनेक्टिविटी और फ़ंक्शन के क्षेत्र में, जेब्राफिश ने अभूतपूर्व विस्तार से आणविक गतिशीलता, मस्तिष्क कार्यों और ऑर्गेनिक व्यवहार के परस्पर क्रिया पर प्रकाश डाला है।
फिर भी, इन अध्ययनों के अधिकांश भ्रूण और प्रारंभिक लार्वा चरणों के विकास के पहले सप्ताह के दौरान प्रतिबंधित कर रहे है के रूप में तंत्रिका तंत्र के ऊतकों की पारदर्शिता उत्तरोत्तर खो दिया है । इन चरणों में, मस्तिष्क के ऊतकों को खोपड़ी भेदभाव और पिगमेंटेशन 3 द्वारा परिरक्षित होने वाले उच्च रिज़ॉल्यूशन माइक्रोस्कोपी दृष्टिकोणों द्वारा पहुंच से रोकाजाताहै।
इसलिए, न्यूरोनल भेदभाव, परिपक्वता और प्लास्टिसिटी के प्रमुख प्रश्न जैसे न्यूरोनल कनेक्टिविटी या सिनैप्टिक स्केलिंग का शोधन अध्ययन करना मुश्किल है। इन सेलुलर प्रक्रियाओं के क्रम में सेलुलर तंत्र ड्राइविंग को परिभाषित करने के लिए महत्वपूर्ण हैं, उदाहरण के लिए, सामाजिक व्यवहार, निर्णय लेने, या प्रेरणा आधारित व्यवहार, क्षेत्रों के लिए जो कई हफ्तों के पुराने लार्वा पर ज़ेब्राफिश अनुसंधान हाल ही में व्यवहार अध्ययन के आधार पर महत्वपूर्ण निष्कर्षों का योगदान दिया है4।
कई हफ्तों तक जेब्राफिश लार्वा में पिगमेंटेशन को रोकने के लिए औषधीय दृष्टिकोण बमुश्किल संभव हैं या हानिकारक प्रभाव भी पैदा कर सकते हैं5,6,7,8. विशिष्ट पिगमेंटेशन दोषों जैसे कैस्पर9 या क्रिस्टल10के साथ डबल या ट्रिपल उत्परिवर्ती उपभेद, काफी मूल्यवान उपकरण बन गए हैं, लेकिन प्रजनन में श्रमसाध्य हैं, कुछ संतान प्रदान करते हैं, और अत्यधिक प्रजनन के कारण आनुवंशिक विकृतियों को जमा करने का खतरा पैदा करते हैं।
यहां, एक विकल्प के रूप में एक न्यूनतम आक्रामक प्रक्रिया प्रदान की जाती है जो किसी भी जेब्राफिश तनाव पर लागू होती है। इस प्रक्रिया को इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल अध्ययनों से जीवित और जागते जेब्राफिश लार्वा में न्यूरोनल गतिविधि रिकॉर्ड करने के लिए अनुकूलित किया गया था। टेलीओस्ट में, त्वचा और नरम खोपड़ी उपास्थि को इन परतों को माइक्रो-छीलने से सावधानीपूर्वक हटाया जा सकता है, क्योंकि वे मस्तिष्क वैक्यूलेचर के साथ कसकर नहीं बुने जाते हैं। यह बिना किसी क्षति के न्यूरॉन्स और अक्षीय क्षेत्रों वाले मस्तिष्क के ऊतकों को उजागर करने और सिनैप्टिक संरचनाओं और उनकी आणविक सामग्री सहित न्यूरोनल आकृति विज्ञान को रिकॉर्ड करने के लिए अनुमति देता है, जिसमें बदले में कई घंटों तक सीए2 + यात्रियों या इंट्रासेलुलर परिवहन घटनाओं जैसे शारीरिक परिवर्तनों का अवलोकन शामिल है। इसके अलावा, वर्णनात्मक लक्षणों से परे, मस्तिष्क के ऊतकों तक सीधी पहुंच न्यूरोफार्माकोलॉजिकल पदार्थ प्रशासन और ऑप्टोजेनेटिक दृष्टिकोणों के माध्यम से परिपक्व न्यूरोनल कार्यों से पूछताछ में सक्षम बनाती है। इसलिए, इस मस्तिष्क जोखिम रणनीति का उपयोग कर किशोर ज़ेब्राफ़िश मस्तिष्क में सही संरचना समारोह संबंधों को प्रकट किया जा सकता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
प्रस्तुत विधि मस्तिष्क अलगाव या फार्मास्यूटिकल्स के साथ जेब्राफिश लार्वा के उपचार के लिए एक वैकल्पिक दृष्टिकोण प्रदान करती है जो वीवो वातावरण में न्यूरॉन्स की उच्च रिज़ॉल्यूशन छवियों को रिकॉर्?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम विशेष रूप से उत्कृष्ट पशु देखभाल और हरमन Döring, मोहंमद एल्से, सोल मुद्रा-Méndez, जैकब वॉन Trotha, कोमली Valishetti और बारबरा शीतकालीन उनके सहायक समर्थन के लिए के लिए Timo Fritsch शुक्रिया अदा करते हैं । हम उनकी प्रतिक्रिया के लिए कोस्टर लैब के अन्य सभी सदस्यों के आभारी भी हैं। इस परियोजना को जर्मन रिसर्च फाउंडेशन (डीएफजी, KO1949/7-2) परियोजना 241961032 (आरडब्ल्यूएके लिए) और बुंडेमिनिस्ट्रियम फ्यूर बिलडुंग एंड फोर्स्चुंग (बीएमबीएफ) द्वारा वित्त पोषित किया गया था; युग-नेट न्यूरॉन द्वितीय CIPRESS परियोजना 01EW1520 जेसीएम के लिए) स्वीकार किया है ।
Materials
| Calcium chloride | Roth | A119.1 | |
| Confocal Laser scanning microscope | Leica | TCS SP8 | |
| d-Glucose | Sigma | G8270-1KG | |
| d-Tubocurare | Sigma-Aldrich | T2379-100MG | |
| Glass Capillary type 1 | WPI | 1B150F-4 | |
| Glass Capillary type 2 | Harvard Apparatus | GC100F-10 | |
| Glass Coverslip | deltalab | D102424 | |
| HEPES | Roth | 9105.4 | |
| Hoechst 33342 | Invitrogen (Thermo Fischer) | H3570 | |
| Imaging chamber | Ibidi | 81156 | |
| Potassium chloride | Normapur | 26764298 | |
| LM-Agarose | Condalab | 8050.55 | |
| Magnesium chloride (Hexahydrate) | Roth | A537.4 | |
| Microscope Camera | Leica | DFC9000 GTC | |
| Needle-Puller type 1 | NARISHIGE | Model PC-10 | |
| Needle-Puller type 2 | Sutter Instruments | Model P-2000 | |
| Pasteur-Pipettes 3ml | A.Hartenstein | 20170718 | |
| Sodium chloride | Roth | P029.2 | |
| Sodium hydroxide | Normapur | 28244262 | |
| Tricain | Sigma-Aldrich | E10521-50G | |
| Waterbath | Phoenix Instrument | WB-12 | |
| 35 mm petri dish | Sarstedt | 833900 | |
| 90 mm petri dish | Sarstedt | 821473001 |
References
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