In vivo avbildning av fullt aktivt hjernevev i våken sebrafisk larver og juveniler av hodeskalle og hudfjerning

Summary

Her presenterer vi en metode for å avbilde sebrafisk embryonal hjerne in vivo upto larval og juvenile stadier. Denne mikroinvasive prosedyren, tilpasset elektrofysiologiske tilnærminger, gir tilgang til cellulære og subcellulære detaljer om moden nevron og kan kombineres med optogenetikk og nevrofarmakologiske studier for karakterisering av hjernefunksjon og legemiddelintervensjon.

Abstract

Å forstå de flyktige endringene som oppstår under hjerneutvikling og modning krever detaljert høyoppløselig avbildning i rom og tid ved cellulær og subcellulær oppløsning. Fremskritt innen molekylære og avbildningsteknologier har gjort det mulig for oss å få mange detaljerte innsikter i cellulære og molekylære mekanismer for hjerneutvikling i det gjennomsiktige sebrafiskembryoet. Nylig har prosesser for raffinering av nevronforbindelse som oppstår på senere larvestadier flere uker etter befruktning, som for eksempel er kontroll over sosial atferd, beslutningstaking eller motivasjonsdrevet oppførsel, beveget seg i fokus for forskning. På disse stadiene forstyrrer pigmentering av sebrafiskhuden lysinntrengning i hjernevev, og løsninger for embryonale stadier, for eksempel farmakologisk hemming av pigmentering, er ikke mulig lenger.

Derfor er en minimalt invasiv kirurgisk løsning for mikroskopitilgang til hjernen til våken sebrafisk gitt som er avledet fra elektrofysiologiske tilnærminger. I teleoster kan hud og myk hodeskallebrusk forsiktig fjernes ved mikroskalling av disse lagene, og utsetter underliggende nevroner og axonale trakter uten skade. Dette gjør det mulig å registrere nevronal morfologi, inkludert synaptiske strukturer og deres molekylære innhold, og observasjon av fysiologiske endringer som Ca^{2 +} transienter eller intracellulære transporthendelser. I tillegg er avhør av disse prosessene ved hjelp av farmakologisk inhibering eller optogenetisk manipulasjon mulig. Denne hjerneeksponeringsmetoden gir informasjon om strukturelle og fysiologiske endringer i nevroner, samt korrelasjon og gjensidig avhengighet av disse hendelsene i levende hjernevev i løpet av minutter eller timer. Teknikken er egnet for in vivo hjerneavbildning av sebrafisk larver opptil 30 dager etter befruktning, det siste utviklingsstadiet testet så langt. Det gir dermed tilgang til slike viktige spørsmål som synaptisk raffinement og skalering, axonal og dendritisk transport, synaptisk målretting av cytoskeletal last eller lokalt aktivitetsavhengig uttrykk. Derfor kan en bred bruk for denne monterings- og bildemetoden forventes.

Introduction

I løpet av de siste tiårene har sebrafisken (Danio rerio) utviklet seg som en av de mest populære virveldyrmodellorganismer for embryonale og larveutviklingsstudier. Den store fecundity av sebrafisk kvinner kombinert med den raske ex utero utviklingen av embryoet og dets gjennomsiktighet i tidlige embryonale utviklingsstadier er bare noen få nøkkelfaktorer som gjør sebrafisk til en kraftig modellorganisme for å kle opp utviklingsspørsmål¹. Fremskritt innen molekylær genetisk teknologi kombinert med høyoppløselige in vivo-avbildningsstudier tillatt for å adressere cellebiologiske mekanismer som ligger til grunn for utviklingsprosesser². Spesielt innen nevronal differensiering, fysiologi, tilkobling og funksjon har sebrafisk kastet lys over samspillet mellom molekylær dynamikk, hjernefunksjoner og organismisk oppførsel i enestående detalj.

Likevel er de fleste av disse studiene begrenset til embryonale og tidlige larvestadier i løpet av den første uken av utviklingen, da gjennomsiktigheten av nervesystemvevet gradvis går tapt. På disse stadiene forhindres hjernevev fra tilgang ved høyoppløselige mikroskopi tilnærminger blir skjermet av hodeskalledifferensiering og pigmentering³.

Derfor er viktige spørsmål om nevronal differensiering, modning og plastisitet som raffinement av nevrontilkobling eller synaptisk skalering vanskelig å studere. Disse cellulære prosessene er viktige for å definere cellulære mekanismer som driver, for eksempel sosial atferd, beslutningstaking eller motivasjonsbasert oppførsel, områder som sebrafiskforskning på flere uker gamle larver nylig har bidratt med viktige funn basert på atferdsstudier⁴.

Farmakologiske tilnærminger for å hemme pigmentering i sebrafisk larver i flere uker er knapt mulig eller kan til og med forårsake skadelige effekter^5,6,7,8. Doble eller tredoble mutantstammer med spesifikke pigmenteringsfeil, som casper⁹ eller krystall¹⁰, har blitt enormt verdifulle verktøy, men er arbeidskrevende i avl, gir få avkom og utgjør faren for å akkumulere genetiske misdannelser på grunn av overdreven innavl.

Her er en minimal invasiv prosedyre som et alternativ gitt som gjelder for enhver sebrafiskstamme. Denne prosedyren ble tilpasset fra elektrofysiologiske studier for å registrere nevronal aktivitet i levende og våken sebrafisk larver. I teleoster kan hud og myk hodeskallebrusk forsiktig fjernes ved mikroskalling av disse lagene, fordi de ikke er tett vevd sammen med hjernens vaskulatur. Dette gjør det mulig å eksponere hjernevev som inneholder nevroner og axonale trakter uten skade og for registrering av nevronal morfologi, inkludert synaptiske strukturer og deres molekylære innhold, som igjen inkluderer observasjon av fysiologiske endringer som Ca^{2 +} transienter eller intracellulære transporthendelser i opptil flere timer. Videre, utover beskrivende karakteriseringer, muliggjør direkte tilgang til hjernevev forhør av modne nevronfunksjoner ved hjelp av nevrofarmakologisk substansadministrasjon og optogenetiske tilnærminger. Derfor kan ekte strukturfunksjonsrelasjoner avsløres i den juvenile sebrafiskhjernen ved hjelp av denne hjerneeksponeringsstrategien.

Protocol

Alt dyrearbeid som er beskrevet her er i samsvar med lovbestemmelser (EU-direktiv 2010/63). Vedlikehold og håndtering av fisk er godkjent av lokale myndigheter og av dyrevelferdsrepresentanten for Technische Universität Braunschweig. 1. Fremstilling av kunstig cerebro spinalvæske (ACSF), lav smeltende agarose og skarpe glassnåler Forbered ACSF ved å oppløse de oppførte kjemikaliene ved å følge konsentrasjoner i destillert vann. 134 mM NaCl (58,44 g/mol), 2,9 mM KCl (74,55 g/…

Representative Results

Figur 3A,C vise en 14 dpf larve av den transgene linjen Tg[-7.5Ca8:GFP]bz12[15] med skallen fortsatt intakt. Pigmentcellene i overleggshuden fordeles over hele hodet og forstyrrer fluorescenssignalet i interesseområdet (her cerebellum). Med larven i denne tilstanden er det ikke mulig å oppnå høyoppløselige bilder av hjernen. Figur 3B viser en larve av samme trans…

Discussion

Den presenterte metoden gir en alternativ tilnærming til hjerneisolasjon eller behandling av sebrafisk larver med legemidler som hemmer pigmentering for registrering av høyoppløselige bilder av nevroner i deres in vivo-miljø. Kvaliteten på bilder som er tatt med denne metoden, kan sammenlignes med bilder fra utplantede hjerner, men under naturlige forhold.

Videre unngås et tap i intensitet av fluorescens, fordi det ikke er behov for behandling med fikseringer^18…

Materials

Calcium chloride	Roth	A119.1
Confocal Laser scanning microscope	Leica	TCS SP8
d-Glucose	Sigma	G8270-1KG
d-Tubocurare	Sigma-Aldrich	T2379-100MG
Glass Capillary type 1	WPI	1B150F-4
Glass Capillary type 2	Harvard Apparatus	GC100F-10
Glass Coverslip	deltalab	D102424
HEPES	Roth	9105.4
Hoechst 33342	Invitrogen (Thermo Fischer)	H3570
Imaging chamber	Ibidi	81156
Potassium chloride	Normapur	26764298
LM-Agarose	Condalab	8050.55
Magnesium chloride (Hexahydrate)	Roth	A537.4
Microscope Camera	Leica	DFC9000 GTC
Needle-Puller type 1	NARISHIGE	Model PC-10
Needle-Puller type 2	Sutter Instruments	Model P-2000
Pasteur-Pipettes 3ml	A.Hartenstein	20170718
Sodium chloride	Roth	P029.2
Sodium hydroxide	Normapur	28244262
Tricain	Sigma-Aldrich	E10521-50G
Waterbath	Phoenix Instrument	WB-12
35 mm petri dish	Sarstedt	833900
90 mm petri dish	Sarstedt	821473001