In vivo imaging av fullt aktiv hjärnvävnad i vakna zebrafisk larver och ungdomar genom skalle och hudborttagning
Summary
Här presenterar vi en metod för att avbilda zebrafiskens embryonala hjärna in vivo upp till larv och ungdomsstadier. Detta mikroinvasiva förfarande, anpassat från elektrofysiologiska metoder, ger tillgång till cellulära och subcellulära detaljer om mogen neuron och kan kombineras med optogenetik och neurofarmakologiska studier för karakterisering av hjärnans funktion och läkemedelsintervention.
Abstract
Att förstå de tillfälliga förändringar som uppstår under hjärnans utveckling och mognad kräver detaljerad högupplöst avbildning i tid och rum vid cellulär och subcellulär upplösning. Framsteg inom molekylär och bildteknik har gjort det möjligt för oss att få många detaljerade insikter om cellulära och molekylära mekanismer för hjärnans utveckling i det transparenta zebrafiskembryon. Nyligen har processer för förfining av neuronal anslutning som uppstår vid senare larvstadier flera veckor efter befruktning, som till exempel är kontroll över socialt beteende, beslutsfattande eller motivationsdrivet beteende, flyttats till fokus för forskning. I dessa skeden stör pigmentering av zebrafiskhuden ljuspenetration i hjärnvävnaden, och lösningar för embryonala stadier, t.ex. farmakologisk hämning av pigmentering, är inte längre genomförbara.
Därför tillhandahålls en minimalt invasiv kirurgisk lösning för mikroskopiåtkomst till hjärnan hos vaken zebrafisk som härrör från elektrofysiologiska metoder. I teleoster kan hud och mjuk skallebrosk försiktigt avlägsnas genom att mikroskala dessa lager och exponera underliggande nervceller och axonalområden utan skador. Detta möjliggör registrering av neuronal morfologi, inklusive synaptiska strukturer och deras molekylära innehåll, och observation av fysiologiska förändringar som Ca2 + transienter eller intracellulära transporthändelser. Dessutom är förhör av dessa processer med hjälp av farmakologisk hämning eller optogenetisk manipulering genomförbart. Denna hjärnexponeringsmetod ger information om strukturella och fysiologiska förändringar i nervceller samt korrelationen och det ömsesidiga beroendet av dessa händelser i levande hjärnvävnad inom intervallet minuter eller timmar. Tekniken är lämplig för in vivo hjärnavbildning av zebrafisk larver upp till 30 dagar efter befruktning, det senaste utvecklingsstadiet som testats hittills. Det ger således tillgång till så viktiga frågor som synaptisk förfining och skalning, axonal och dendritisk transport, synaptisk inriktning av cytoskeletal last eller lokalt aktivitetsberoende uttryck. Därför kan en bred användning för denna monterings- och bildbehandlingsmetod förväntas.
Introduction
Under de senaste decennierna har zebrafisken (Danio rerio) utvecklats som en av de mest populära ryggradsdjur modellorganismerna för embryonala och larv utvecklingsstudier. Den stora fecundity av zebrafisk honor i kombination med den snabba ex utero utvecklingen av embryot och dess öppenhet under tidiga embryonala utvecklingsstadier är bara några nyckelfaktorer som gör zebrafisk till en kraftfull modellorganism för att ta itu med utvecklingsfrågor1. Framsteg inom molekylärgenetisk teknik i kombination med högupplösta in vivo-avbildningsstudier som är tillåtna för att ta itu med cellbiologiska mekanismer som ligger till grund förutvecklingsprocesser 2. I synnerhet inom området neuronal differentiering, fysiologi, anslutning och funktion har zebrafisk kastat ljus över samspelet mellan molekylär dynamik, hjärnfunktioner och organismiskt beteende i oöverträffad detalj.
Ändå är de flesta av dessa studier begränsade till embryonala och tidiga larvstadier under den första utvecklingsveckan eftersom transparensen i nervsystemets vävnad gradvis går förlorad. I dessa skeden förhindras hjärnvävnad från åtkomst genom högupplösta mikroskopimetoder som blir avskärmade av skalle differentiering och pigmentering3.
Därför är viktiga frågor om neuronal differentiering, mognad och plasticitet såsom förfining av neuronal anslutning eller synaptisk skalning svåra att studera. Dessa cellulära processer är viktiga för att definiera cellulära mekanismer som driver till exempel socialt beteende, beslutsfattande eller motivationsbaserat beteende, områden till vilka zebrafiskforskning på flera veckors gamla larver nyligen har bidragit med viktiga resultat baserade på beteendestudier4.
Farmakologiska metoder för att hämma pigmentering i zebrafisklarver i flera veckor är knappt genomförbara eller kan till och med orsaka skadligaeffekter 5,6,7,8. Dubbla eller tredubbla mutantstammar med specifika pigmenteringsdefekter, såsom casper9 eller kristall10, har blivit oerhört värdefulla verktyg, men är mödosamma i avel, ger få avkommor och utgör risken för att ackumulera genetiska missbildningar på grund av överdriven inavel.
Här tillhandahålls ett minimalt invasivt förfarande som ett alternativ som är tillämpligt på alla zebrafiskstammar. Detta förfarande anpassades från elektrofysiologiska studier för att registrera neuronal aktivitet i levande och vakna zebrafisk larver. I teleoster kan hud och mjuk skallebrosk försiktigt avlägsnas genom att mikroskala dessa lager, eftersom de inte är tätt sammanvävda med hjärnans vaskulatur. Detta gör det möjligt att exponera hjärnvävnad som innehåller nervceller och axonal skrifter utan skador och för registrering av neuronal morfologi, inklusive synaptiska strukturer och deras molekylära innehåll, vilket i sin tur inkluderar observation av fysiologiska förändringar som Ca2 + transienter eller intracellulära transporthändelser i upp till flera timmar. Dessutom, utöver beskrivande karakteriseringar, möjliggör den direkta tillgången till hjärnvävnad förhör av mogna neuronala funktioner med hjälp av neurofarmakologiska substans administration och optogenetiska metoder. Därför kan sanna strukturfunktionsrelationer avslöjas i den unga zebrafiskhjärnan med hjälp av denna hjärnexponeringsstrategi.
Protocol
Representative Results
Discussion
Den presenterade metoden ger ett alternativt tillvägagångssätt för hjärnisolering eller behandling av zebrafisklarver med läkemedel som hämmar pigmentering för registrering av högupplösta bilder av nervceller i deras in vivo-miljö. Kvaliteten på bilder som registreras med denna metod är jämförbar med bilder från explanterade hjärnor, men under naturliga förhållanden.
Dessutom undviks en förlust av intensiteten i fluorescens, eftersom det inte finns något behov av …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi tackar särskilt Timo Fritsch för utmärkt djurvård och Hermann Döring, Mohamed Elsaey, Sol Pose-Méndez, Jakob von Trotha, Komali Valishetti och Barbara Winter för deras hjälpsamma stöd. Vi är också tacksamma mot alla andra medlemmar i Kösterlabbet för deras feedback. Projektet finansierades delvis av det tyska forskningsstiftelsen (DFG, KO1949/7-2) projekt 241961032 (till RWK) och Bundesministerium für Bildung und Forschung (BMBF; Era-Net NEURON II CIPRESS projekt 01EW1520 till JCM) bekräftas.
Materials
| Calcium chloride | Roth | A119.1 | |
| Confocal Laser scanning microscope | Leica | TCS SP8 | |
| d-Glucose | Sigma | G8270-1KG | |
| d-Tubocurare | Sigma-Aldrich | T2379-100MG | |
| Glass Capillary type 1 | WPI | 1B150F-4 | |
| Glass Capillary type 2 | Harvard Apparatus | GC100F-10 | |
| Glass Coverslip | deltalab | D102424 | |
| HEPES | Roth | 9105.4 | |
| Hoechst 33342 | Invitrogen (Thermo Fischer) | H3570 | |
| Imaging chamber | Ibidi | 81156 | |
| Potassium chloride | Normapur | 26764298 | |
| LM-Agarose | Condalab | 8050.55 | |
| Magnesium chloride (Hexahydrate) | Roth | A537.4 | |
| Microscope Camera | Leica | DFC9000 GTC | |
| Needle-Puller type 1 | NARISHIGE | Model PC-10 | |
| Needle-Puller type 2 | Sutter Instruments | Model P-2000 | |
| Pasteur-Pipettes 3ml | A.Hartenstein | 20170718 | |
| Sodium chloride | Roth | P029.2 | |
| Sodium hydroxide | Normapur | 28244262 | |
| Tricain | Sigma-Aldrich | E10521-50G | |
| Waterbath | Phoenix Instrument | WB-12 | |
| 35 mm petri dish | Sarstedt | 833900 | |
| 90 mm petri dish | Sarstedt | 821473001 |
References
- Embryology. Zebrafish Development Available from: https://embryology.med.unsw.edu.au/embryology/index.php/Zebrafish_Development (2020)
- Sassen, W. A., Köster, R. W. A molecular toolbox for genetic manipulation of zebrafish. Advances in Genomics and Genetics. Dove Medical Press. 2015 (5), 151-163 (2015).
- Singh, A. P., Nüsslein-Volhard, C. Zebrafish stripes as a model for vertebrate colour pattern formation. Current Biology. 25 (2), 81-92 (2015).
- Kalueff, A. V., et al. Time to recognize zebrafish ‘affective’ behavior. Brill: Behaviour. 149 (10-12), 1019-1036 (2012).
- Karlsson, J., von Hofsten, J., Olsson, P. -. E. Generating transparent zebrafish: a refined method to improve detection of gene expression during embryonic development. Marine Biotechnology. 3, 522-527 (2001).
- Bohnsack, B. L., Gallina, D., Kahana, A. Phenothiourea sensitizes zebrafish cranial neural crest and extraocular muscle development to changes in retinoic acid and IGF signaling. PloS One. 6, 22991 (2011).
- Elsalini, O. A., Rohr, K. B. Phenylthiourea disrupts thyroid function in developing zebrafish. Development Genes and Evolution. 212, 593-598 (2003).
- Baumann, L., Ros, A., Rehberger, K., Neuhauss, S. C. F., Segner, H. Thyroid disruption in zebrafish (Danio rerio) larvae: Different molecular response patterns lead to impaired eye development and visual functions. Aquatic Toxicology. 172, 44-55 (2016).
- White, R., et al. Transparent adult zebrafish as a tool for in vivo transplantation analysis. Cell Stem Cell. 2, 183-189 (2008).
- Antinucci, P., Hindges, R. A crystal-clear zebrafish for in vivo imaging. Scientific Reports. 6, 29490 (2016).
- Burr, S. A., Leung, Y. L. Curare (d-Tubocurarine). Encyclopedia of Toxicology (3rd Edition). , 1088-1089 (2014).
- Gesler, H. M., Hoppe, J. 3,6-bis(3-diethylaminopropoxy) pyridazine bismethiodide, a long-acting neuromuscular blocking agent. The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 118 (4), 395-406 (1956).
- Furman, B. . Alpha Bungarotxin. Reference Module in Biomedical Sciences. , (2018).
- Attili, S., Hughes, S. M. Anaesthetic tricaine acts preferentially on neural voltage-gated sodium channels and fails to block directly evoked muscle contraction. PLoS One. 9 (8), 103751 (2014).
- Namikawa, K., et al. Modeling neurodegenerative spinocerebellar ataxia type 13 in zebrafish using a Purkinje neuron specific tunable coexpression system. Journal of Neuroscience. 39 (20), 3948-3969 (2019).
- Hennig, M. Theoretical models of synaptic short term plasticity. Frontiers in Computational Neuroscience. 7 (45), (2013).
- Wang, Y., et al. Moesin1 and Ve-cadherin are required in endothelial cells during in vivo tubulogenesis. Development. 137, 3119-3128 (2010).
- Hobro, A., Smith, N. An evaluation of fixation methods: Spatial and compositional cellular changes observed by Raman imaging. Vibrational Spectroscopy. 91, 31-45 (2017).
- Knogler, L. D., Kist, A. M., Portugues, R. Motor context dominates output from purkinje cell functional regions during reflexive visuomotor behaviours. eLife. 8, 42138 (2019).
- Hsieh, J., Ulrich, B., Issa, F. A., Wan, J., Papazian, D. M. Rapid development of Purkinje cell excitability, functional cerebellar circuit, and afferent sensory input to cerebellum in zebrafish. Frontier in Neural Circuits. 8 (147), (2014).
- Scalise, K., Shimizu, T., Hibi, M., Sawtell, N. B. Responses of cerebellar Purkinje cells during fictive optomotor behavior in larval zebrafish. Journal of Neurophysiology. 116 (5), 2067-2080 (2016).
- Harmon, T. C., Magaram, U., McLean, D. L., Raman, I. M. Distinct responses of Purkinje neurons and roles of simple spikes during associative motor learning in larval zebrafish. eLife. 6, 22537 (2017).
- Zehendner, C. M., et al. Moderate hypoxia followed by reoxygenation results in blood-brain barrier breakdown via oxidative stress-dependent tight-junction protein disruption. PLoS One. 8 (12), 82823 (2013).
- Dhabhar, F. S. The short-term stress response – mother nature’s mechanism for enhancing protection and performance under conditions of threat, challenge, and opportunity. Frontiers of Neuroendocrinology. 49, 175-192 (2018).
