用于骨髓源性肥大细胞培养的结晶纳米纤维素包埋琼脂糖生物材料墨水的制备
Summary
该协议强调了一种快速评估结晶纳米纤维素（CNC）/琼脂糖复合水凝胶生物材料墨水与小鼠骨髓衍生肥大细胞的生物相容性的方法，包括细胞活力和细胞表面受体，试剂盒（CD117）和高亲和力IgE受体（FcεRI）的表型表达。
Abstract
三维（3D）生物打印利用以图案沉积的水凝胶基复合材料（或生物材料油墨），形成细胞沉积在其上的底物。由于许多生物材料油墨可能对原代细胞具有潜在的细胞毒性，因此有必要在昂贵的3D组织工程工艺中使用这些水凝胶复合材料之前确定其生物相容性。一些3D培养方法，包括生物打印，要求将细胞嵌入3D基质中，这使得很难提取和分析细胞的活力和生物标志物表达的变化而不会引起机械损伤。该协议将概念证明描述为概念验证，一种评估结晶纳米纤维素（CNC）嵌入琼脂糖复合材料的生物相容性的方法，该复合物被制造成24孔培养系统，小鼠骨髓衍生肥大细胞（BMMCs）使用流式细胞术测定细胞活力和生物标志物表达。
在暴露于CNC / 琼脂糖/ D-甘露醇基质18小时后，通过碘化丙啶（PI）渗透率测量的BMMC活力保持不变。然而，在 CNC / 琼脂糖/ D-甘露醇 底物上培养的BMMC似乎略微增加了其高亲和力IgE受体（FcεRI）和干细胞因子受体（Kit;CD117），尽管这似乎并不依赖于生物墨水复合材料中CNC的量。在暴露于水凝胶支架后，还评估了BMMC的可行性，这些支架是使用3D挤出生物打印机由原纤维纳米纤维素（FNC）和海藻酸钠组成的商业生物材料墨水制成的。在6-48小时内，FNC / 藻酸盐底物没有对流式细胞术和微量滴定测定（XTT和乳酸脱氢酶）测定的BMMC的活力产生不利影响。该协议描述了一种有效的方法，可以快速筛选候选生物材料油墨的生化相容性，以用作3D支架，用于用肥大细胞进行打印后接种。
Introduction
最近对3D培养系统和3D生物打印的兴趣将注意力集中在水凝胶和水凝胶复合材料上。这些复合材料可用作粘稠但多孔的仿生剂，可由高达99%的重量含水量组成，可与生物组织相媲美1，2，3。因此，水凝胶复合材料的这些特征允许细胞生长，而不会影响其活力和功能。其中一种复合材料是结晶纳米纤维素（CNC），它已被用作水凝胶复合材料，生物材料植入物开发中的细胞支架以及二维（2D）和3D 体外 细胞培养中的增强材料4，5。在大多数情况下，由CNC组成的基质对人角膜上皮细胞6，肠上皮细胞7，人骨髓来源的间充质干细胞8或神经元样细胞9没有明显的细胞毒性。然而，人骨髓来源的间充质干细胞的代谢活性和增殖与木基纳米纤维素复合材料粘度的增加相关，这表明必须仔细测试基质的组成，以确定其对细胞功能的有害影响8。
同样，CNC可以在内化时诱导巨噬细胞中的炎症反应，这可能在3D免疫细胞培养系统中产生严重后果10，11。事实上，关于CNC如何影响其他免疫细胞反应，特别是由肥大细胞引发的过敏性炎症反应，可用的数据很少。肥大细胞是颗粒状白细胞，表达高亲和力IgE受体FCERI，负责激活对过敏原的炎症反应。它们的增殖和分化依赖于干细胞因子（SCF），其结合酪氨酸受体Kit。肥大细胞来源于骨髓祖细胞，这些祖细胞进入循环并随后在外周迁移，在所有人体组织中无处不在12。由于肥大细胞在3D组织环境中起作用，因此它们是研究 体外 3D组织模型中免疫过程的理想免疫细胞候选者。然而，迄今为止，还没有含有肥大细胞的活体 外 3D组织模型。
由于肥大细胞的高度敏感性及其对外部刺激引发促炎反应的倾向，因此需要仔细考虑3D基质成分以及将肥大细胞引入3D支架的生物打印方法，如进一步讨论的那样。组织结构可以从两大类生物材料（即生物墨水和生物材料油墨）中生物制造。区别在于生物墨水是充满细胞的水凝胶复合材料，而生物材料油墨是没有细胞的水凝胶复合材料，如Groll等人13，14所定义。因此，用生物墨水打印的3D构建体包含预先嵌入在水凝胶基质中的细胞，而用生物材料油墨打印的3D构建体需要在打印后接种细胞。来自水凝胶基生物墨水/生物材料墨水的培养支架的生物制造通常使用挤出3D生物打印机进行，该打印机通过气动或机械驱动的活塞在压力下通过微尺度喷嘴挤出生物墨水/生物材料墨水14。挤出生物打印机通过将生物墨水沉积在2D横截面图案中以”自下而上”的方法顺序堆叠在一起来制造3D支架。
为了与挤出生物打印兼容，基于水凝胶的生物墨水/生物材料墨水必须具有触变性（剪切变稀）特性，即生物墨水/生物材料墨水的组成水凝胶聚合物在承受剪切应力时像流体一样流过微通道喷嘴，但在去除剪切应力后恢复到粘稠的凝胶状状态15.由于其高含水量，水凝胶基生物墨水/生物材料油墨的聚合物必须以物理或共价方式交联，以保持3D生物打印结构的结构和结构完整性。在充满细胞的生物墨水的情况下，细胞在交联过程中直接受到化学应力的影响。将细胞封装在生物墨水水凝胶基质中的过程也会使细胞受到剪切应力，这可能导致活力降低和/或细胞死亡。一旦3D组织模型被生物打印，就很难区分水凝胶基质本身引发的细胞毒性水平以及挤出和交联过程。这在3D支架的背景下尤其具有挑战性，其中细胞预先嵌入在水凝胶基质中，因此难以去除细胞以进行后续分析，这将不利于肥大细胞的活力。
生成包含肥大细胞的3D组织结构体的更温和的方法涉及将细胞从细胞培养悬浮液中接种到预打印的多孔生物材料墨水3D支架中，这利用了肥大细胞从循环迁移到外周组织的先天能力。这种细胞接种方法的好处是双重的：（i）肥大细胞不会分别受到挤出和交联过程中的剪切和化学应力，以及（ii）通过温和洗涤进行分析，细胞暴露后可以很容易地从3D支架上取出，而不会对其生存能力产生不利影响。在3D生物打印的多孔水凝胶支架上接种和分析肥大细胞的细胞活力的另一个好处是，3D生物打印的水凝胶支架概括了 体内 组织的微观地形特征，这些特征不存在于散装的2D平面水凝胶盘中。这种方法是一种合适，快速且具有成本效益的方法，可以在投资昂贵的3D组织工程实验之前确定候选bioink水凝胶基质对肥大细胞以及其他免疫细胞的潜在灾难性细胞毒性作用。
Protocol
Representative Results
Discussion
3D仿生组织的制造需要生物墨水的成功融合，其模仿细胞外基质的成分，与细胞成分一起创建 体内 组织的生理类似物。这需要在制造生理仿生组织时使用原代细胞，而不是转化的细胞。然而，原代免疫细胞（例如肥大细胞）特别容易受到生物墨水基质本身可能引发的细胞毒性作用和表型变化的影响，这是不希望的。因此，快速评估候选生物材料墨水对肥大细胞的活力和表型（表面受体表达…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我们感谢Alberta Innovates提供CNC，Ken Harris和Jae-Young Cho在准备CNC / 琼脂糖/ D-甘露醇基质时提供技术建议。我们还感谢Ben Hoffman，Heather Winchell和Nicole Diamantides在INKREDIBLE+ 3D生物打印机的设置和校准方面的技术建议和支持。
Materials
| A | |||
| Acetic Acid (glacial) | Sigma Aldrich | AX0074-6 | |
| Agarose (OmniPur) | EMD Millipore Corporation | 2125-500GM | |
| Armenian Hamster IgG Isotype Control, APC (Clone: eBio299Arm) | Thermo Fisher Scientific | 17-4888-82 | |
| B | |||
| b-Mercaptoethanol | Fisher Scientific | O3446I-100 | |
| b-Nicotinamide adenine dinucleotide sodium salt (NAD) | Sigma Aldrich | N0632-5G | |
| BD 5 mL Syringe (Luer-Lok Tip) | BD | 309646 | |
| BD PrecisionGlide Needle 26G x 1/2 in | BD | 305111 | |
| BioLite 24 Well Multidish | Thermo Fisher Scientific | 930-186 | |
| BioLite 96 Well Multidish | Thermo Fisher Scientific | 130-188 | |
| BioLite 175 cm2 Flask Vented | Thermo Fisher Scientific | 130-191 | |
| Biosafety Cabinet Class II | Microzone Corp., Canada | BK-2-6-B3 | |
| BSA, Fraction V (OmniPur) | EMD Millipore Corporation | 2930-100GM | |
| C | |||
| C57BL/6 mice | The Jackson Laboratory | 000664 | |
| CD117 (c-Kit) Monoclonal Antibody, PE (Clone: 2B8) | Thermo Fisher Scientific | 12-1171-82 | |
| CELLINK BIOINK (3 x 3 mL Cartridge) | CELLINK LLC | IK1020000303 | |
| CELLINK CaCl2 Crosslinking Agent – Sterile Bottle 1 x 60 mL | CELLINK LLC | CL1010006001 | |
| CELLINK Empty Cartridges 3cc with End and Tip Caps | CELLINK LLC | CSC0103000102 | |
| CELLINK HeartWare for PC | CELLINK LLC | Version 2.4.1 | |
| CELLINK INKREDIBLE+ 3D BIOPRINTER | CELLINK LLC | S-10003-001 | |
| CELLINK Sterile Standard Conical Bioprinting Nozzles 22G | CELLINK LLC | NZ4220005001 | |
| CELLINK Sterile Standard Conical Bioprinting Nozzles 25G | CELLINK LLC | NZ4250005001 | |
| CELLINK Sterile Standard Conical Bioprinting Nozzles 27G | CELLINK LLC | NZ4270005001 | |
| Cell Proliferation Kit II (XTT) (Roche) | Sigma Aldrich | 11465015001 | |
| Centrifuge (Benchtop) | Eppendorf | 5804R | |
| Corning Costar 96 Well Clear Flat-Bottom Non-Treated PS Microplate | Sigma Aldrich | CLS3370 | |
| CO2 Incubator | Binder GmbH, Germany | 9040-0113 | |
| CytoFLEX Flow Cytometer | Beckman Coulter | A00-1-1102 | |
| D | |||
| D-mannitol (MilliporeSigma Calbiochem) | Fisher Scientific | 44-390-7100GM | |
| F | |||
| Falcon 15 mL Polystyrene Conical Tubes, Sterile | Corning | 352095 | |
| Falcon 50 mL Polystyrene Conical Tubes, Sterile | Corning | 352070 | |
| FceR1 alpha Monoclonal Antibody, APC (Clone: MAR-1) | Thermo Fisher Scientific | 17-5898-82 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS), qualified, heat inactivated | Thermo Fisher Scientific | 12484028 | |
| FlowJo Software | Becton Dickinson & Co. USA | Version 10.6.2 | |
| G | |||
| GraphPad Prism | GraphPad Software, LLC | Version 8.4.3 | |
| H | |||
| Hemacytometer (Improved Neubauer 0.1 mmm deep levy) | VWR | 15170-208 | |
| HEPES Sodium Salt | Fisher Scientific | BP410-500 | |
| I | |||
| Iodonitrotetrazolium chloride (INT) | Sigma Aldrich | I10406-5G | |
| L | |||
| L-Glutamine 200 mM (Gibco) | Thermo Fisher Scientific | 25030-081 | |
| Lithium L-lactate | Sigma Aldrich | L2250-100G | |
| M | |||
| MEM Non-Essential Amino Acids 100 mL 100x (Gibco) | Thermo Fisher Scientific | 11140-050 | |
| 1-Methoxy-5-methylphenazinium methyl sulfate (MPMS) | Sigma Aldrich | M8640 | |
| Microtubes (1.7 mL clear) | Axygen | MCT-175-C | |
| Microtubes (2.0 mL clear) | Axygen | MCT-200-C | |
| MilliQ Academic (for producing MilliQ ultrapure water) | Millipore | ZMQS60001 | |
| N | |||
| Nalgene Rapid-Flow 90 mm Filter Unit (0.2 mm Pore size, 500 mL) | Thermo Fisher Scientific | 566-0020 | |
| Nalgene Syringe filter (0.2 mm PES, 25 mm) | Thermo Fisher Scientific | 725-2520 | |
| P | |||
| Penicillin Streptomycin 100 mL (Gibco) | Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | |
| PBS pH 7.4, No Calcium/Magnesium, 500 mL (Gibco) | Thermo Fisher Scientific | 10010-023 | |
| Propidium iodide, 1.0 mg/mL (Invitrogen) | Thermo Fisher Scientific | P3566 | |
| R | |||
| Rat IgG2b kappa Isotype Control, PE (Clone: eB149/10H5) | Thermo Fisher Scientific | 12-4031-82 | |
| Recombinant Murine IL-3 | PeproTech, Inc. | 213-13 | |
| RPMI-1640 Medium 1X + 2.05 mM L-Glutamine (HyClone) | GE Healthcare | SH30027.01 | |
| S | |||
| Sarstedt 96 well round base PS transparent micro test plate (82.1582.001) | Fisher Scientific | NC9913213 | |
| Sodium Azide, 500 g | Fisher Scientific | BP922I-500 | |
| Sodium Pyruvate (100 mM) 100X (Gibco) | Thermo Fisher Scientific | 11360-070 | |
| T | |||
| Tris Base (2-amino-2(hydroxymethyl)-1,3-propanediol) | Sigma Aldrich | 252859 | |
| Trypan Blue solution (0.4%, for microscopy) | Sigma Aldrich | 93595 | |
| V | |||
| VARIOSKAN LUX Microplate Spectrophotometer (Type: 3020) | Thermo Fisher Scientific | VLBL00D0 |
References
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