ייצור של דיו ביו-חומרים אגרוז משובץ ננו-תאית לגבישית
Summary
פרוטוקול זה מדגיש שיטה להערכה מהירה של תאימות ביולוגית של ננו-תאי גבישי (CNC)/אגרוז דיו ביו-חומרים מרוכבים הידרוג’ל עם תאי פין שמקורם במח העצם של העכבר במונחים של כדאיות התא וביטוי פנוטיפי של קולטני פני השטח של התא, קיט (CD117) וקולטן IgE בעל זיקה גבוהה (FcεRI).
Abstract
ביו-הדפסה תלת מימדית (תלת-ממדית) משתמשת ברכיבים מרוכבים מבוססי הידרוג’ל (או דיו ביו-חומרי) המופקדים בתבנית ויוצרת מצע שעליו מופקדים תאים. מכיוון שדיו ביו-חומרים רבים יכולים להיות ציטוקסיים פוטנציאליים לתאים ראשוניים, יש צורך לקבוע את תאימות ביולוגית של מרוכבים הידרוג’ל אלה לפני השימוש שלהם בתהליכים יקרים של הנדסת רקמות תלת-ממדיות. כמה שיטות תרבית תלת-ממדית, כולל הדפסה ביולוגית, דורשות שתאים יוטבעו במטריצה תלת-ממדית, מה שמקשה על חילוץ וניתוח התאים לשינויים בכדאיות ובביטוי סמן ביולוגי מבלי לגרום לנזק מכני. פרוטוקול זה מתאר כהוכחה של מושג, שיטה להערכת תאימות ביולוגית של ננו-תאי גבישי (CNC) מוטבע אגרוז מרוכבים, מפוברק לתוך מערכת תרבית 24-well, עם תאי פיטום נגזר מח עצם העכבר (BMMCs) באמצעות תרסיסים ציטומטריים זרימה עבור הכדאיות התא וביטוי סמן ביולוגי.
לאחר 18 שעות של חשיפה למטריקס CNC / אגרוז / D-מניטול, הכדאיות BMMC לא היה ללא כל כפי שנמדד על ידי חמיצות יוד פרופיליום (PI). עם זאת, BMMCs תרבית על CNC / agarose / D-מניטול מצע נראה להגדיל מעט את הביטוי שלהם של קולטן IgE זיקה גבוהה (FcεRI) ואת קולטן גורם תא גזע (ערכה; CD117), למרות שזה לא נראה תלוי בכמות CNC בביוינק מורכב. הכדאיות של BMMCs הוערכה גם בעקבות חשיפה לקורס זמן לפיגומים הידרוג’ל שהיו מפוברקים מדיו ביו-חומרים מסחרי המורכב מננו-תאי פרברילר (FNC) ונתרן אלגינט באמצעות ביו-הדפסה תלת-ממדית. במשך תקופה של 6-48 שעות, מצעים FNC / אלגינט לא השפיעו לרעה על הכדאיות של BMMCs כפי שנקבע על ידי cytometry זרימה ובדיקות microtiter (XTT ו לקטט דהידרוגנאז). פרוטוקול זה מתאר שיטה יעילה לסנן במהירות את התאימות הביוכימית של דיו ביו-חומרים מועמד עבור השירות שלהם כפיגומים תלת-ממדיים לזריעה לאחר ההדפסה עם תאי פין.
Introduction
העניין האחרון במערכות תרבות תלת-ממדית וביו-הדפסה תלת-ממדית מיקד את תשומת הלב בהידרוג’לים ובהידרוג’ל מרוכבים. מרוכבים אלה משמשים צמיג אך נקבובי biomimetics והוא יכול להיות מורכב עד 99% תכולת מים לפי משקל, אשר דומה רקמות ביולוגיות1,2,3. תכונות אלה של מרוכבים הידרוג’ל ובכך לאפשר את הצמיחה של תאים מבלי להשפיע על הכדאיות שלהם ותפקוד. מרוכבים אחד כזה הוא ננו-תאי גבישי (CNC), אשר שימש כחומר חיזוק ב מרוכבים הידרוג’ל, פיגומים תאים בפיתוח של שתלים ביו-חומרים, ובתרבות תאים דו מימדית (2D) ותלת-ממדית במבחנה4,5. על פי רוב, מטריצות המורכבות CNC אינן ציטוטוקסיות גלויות לתאי אפיתל קרנית אנושית6, תאי אפיתל מעיים7, תאי גזע מזנכימליים שמקורם במח העצם האנושי8, או תאים דמויי נוירון9. עם זאת, פעילות מטבולית והתפשטות של תאי גזע מזנכימליים שמקורם במח העצם האנושיים פוחתת בקורלציה עם הצמיגות המוגברת של מרוכבים ננו-תאיים מבוססי עץ, דבר המצביע על כך שיש לבדוק בקפידה את הרכב המטריצה להשפעותיה המזיקות על תפקודי התא8.
באופן דומה, CNC יכול לגרום לתגובות דלקתיות במקרואפגים עם ההפנמה, אשר יכול להיות השלכות חמורות במערכות תרבית תאי החיסון 3D10,11. למעשה, יש מעט מאוד נתונים זמינים על איך CNC עשוי להשפיע על תגובות אחרות של תאי החיסון, במיוחד תגובות דלקתיות אלרגיות כי הם יזם על ידי תאי פין. תאי פיסט הם לויקוציטים מגורענים המבטאים את קולטן IgE בעל הזיקה הגבוהה, FceRI, האחראי להפעלת תגובות דלקתיות לאלרגנים. התפשטותם ובידולם תלויים בגורם תאי הגזע (SCF), הקושר את קולטן טירוזין, קיט. תאי פיסט נגזרים מתאי מח עצם שנכנסים למחזור ולאחר מכן נודדים באופן היקפי כדי להתפזר בכל מקום בכל הרקמות האנושיות12. כמו תאי פין לתפקד בסביבת רקמה 3D, הם מועמד אידיאלי לתאי החיסון לחקר תהליכים אימונולוגיים במודלים של רקמת 3D במבחנה. עם זאת, עד כה, אין מודל רקמה 3D במבחנה המכיל תאי פין.
בשל האופי הרגיש ביותר של תאי פיסט ונטייתם לעורר תגובות פרו דלקתיות לגירויים חיצוניים, נדרשת התחשבות זהירה במרכיבי מטריצת תלת-ממד ושיטת ההדפסה הביולוגית של החדרת תאי פיסט לפיגומים תלת-ממדיים, כפי שנדון בהמשך. מבנים רקמה יכול להיות biofabricated משתי קטגוריות רחבות של biomaterials, כלומר, bioinks ודיו ביו-חומרים. ההבחנה טמונה בעובדה כי bioinks הם מרוכבים הידרוג’ל עמוס תאים, ואילו דיו ביו-חומרים הם מרוכבים הידרוג’ל כי הם נטולי תאים, כפי שהוגדר על ידי Groll et al.13,14. לפיכך, מבנים תלת-ממדיים המודפסים עם ביו-ינקים מכילים תאים המוטבעים מראש במטריצת ההידרוג’ל, בעוד מבנים תלת-ממדיים המודפסים בדיו ביו-חומריים צריכים להיות מוזרעים בתאים לאחר ההדפסה. הביו-פיכחון של פיגומי תרבות מביו-ינקים/דיו ביו-חומרי מבוססי הידרוג’ל מבוצע בדרך כלל באמצעות ביו-הדפסה תלת-ממדית של שחול, המבלטים בדיו הביו-וינק/ביו-חומרים באמצעות זרבובית מיקרו-קשקשים תחת לחץ באמצעות בוכנה פנאומטית או מכנית14. ביו-הדפסה מייצרת פיגומים תלת-ממדיים על ידי הפקדת הביו-ינק בדפוסים חתך בדו-ממדיים שנערמו זה על זה בגישה של “מלמטה למעלה”.
כדי להיות תואם להדפסה ביולוגית של שחול, הדיו הביולוגי/ביו-חומרים מבוסס ההידרוג’ל חייב להיות בעל תכונות טיקסוטרופיות (דילול גחלה), לפיהן פולימרים הידרוג’ל המרכיבים את זרימת הדיו הביו-וינק/ביו-חומרים כמו נוזל דרך זרבובית מיקרו-ערוצית כאשר הם נתונים ללחץ גזוז, אך חוזרים למצב צמיג דמוי ג’ל עם הסרת הלחץ הגועתי15 . בשל תכולת המים הגבוהה שלהם, יש לקשר בין הפולימרים של ביונקים ביולוגיים/דיו ביו-חומרי מבוססי הידרוג’ל, פיזית או קוולנטית, כדי לשמור על הארכיטקטורה והשלמות המבנית של המבנה הביו-מודפס תלת-ממדי. במקרה של ביונקים עמוסי תאים, התאים נתונים ישירות ללחצים כימיים במהלך תהליך ההצלבה. תהליך השולט תאים עטופים בתוך מטריצת הידרוג’ל bioink גם נושא את התאים לגיז לחץ גיזום, אשר יכול להוביל ירידה הכדאיות ו /או מוות תאים. לאחר מודל הרקמה 3D כבר ביוהדפסה, קשה להפלות בין רמות של ציטוטוקסיות המועלה על ידי מטריצת הידרוג’ל עצמה ואת תהליכי שחול וקישור, בהתאמה. זה מאתגר במיוחד בהקשר של פיגומים תלת-ממדיים שבהם התאים מוטבעים מראש בתוך מטריצת ההידרוג’ל, ובכך מקשים על הסרת התאים עבור ניתוחים הבאים, אשר יפגע בכדאיות של תאי פין.
גישה עדינה יותר ליצירת מבנים של רקמה תלת-ממדית המכילה תאי פיסט כרוכה בזריעת התאים לפיגומים תלת-ממדיים דיו ביו-חומריים מודפסים מראש מהשעיית תרבית התא, הממנפת את היכולת המולדת של תאי פין לנדוד מהמחזור לרקמות היקפיות. היתרונות של גישת זריעת תאים זו הם כפולים: (i) תאי התורן אינם נתונים לגיזום גיזה וכימיקלים מתהליכי השחול וההצלבה, בהתאמה, ו-(ii) ניתן להסיר בקלות את התאים מהפיגומים 3D לאחר החשיפה על ידי כביסה עדינה לניתוח מבלי להשפיע לרעה על הכדאיות שלהם. היתרון הנוסף של זריעה וניתוח הכדאיות של תאי פיסט על פיגומי הידרוג’ל נקבוביים בהדפסה ביולוגית תלת-ממדית לעומת דיסקים הידרוג’ל דו-ממדיים הוא שפיגומי הידרוג’ל תלת-ממדיים מודפסים ביו-הדפסה חוזרים לתכונות טופוגרפיות מיקרו-בקנה מידה זעיר של רקמות ויוו , שאינן קיימות בתפזורת, דיסקים הידרוג’ל פלנאריים דו-ממדיים. גישה זו היא גישה מתאימה, מהירה וחסכונית כדי לקבוע את ההשפעות הציטוטוקסיות שעלולות להיות קטסטרופליות של מטריצות הידרוג’ל ביו-סינק מועמדות על תאי פיטום, כמו גם תאים אימונולוגיים אחרים, לפני השקעה בניסויים יקרים בהנדסת רקמות תלת-ממדיות.
Protocol
Representative Results
Discussion
ייצור של רקמות ביו-מימטיות תלת-ממדיות דורש מיזוג מוצלח של הביו-וינק, המחקה רכיבים של המטריצה החוץ-תאית, עם הרכיבים התאיים ליצירת אנלוגים פיזיולוגיים של רקמות ויוו . זה מחייב שימוש בתאים ראשוניים, ולא תאים שעברו טרנספורמציה, בעת ייצור רקמות ביו-מימטיות פיזיולוגיות. תאים אימונולוגיים ר?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים לאלברטה אינחדשס על שסיפקה ל- CNC וקן האריס וג’ה-יאנג צ’ו על העצה הטכנית שלהם בעת הכנת מטריצת CNC / אגרוז / D-מניטול. אנו מודים גם לבן הופמן, הת’ר וינצ’ל וניקול דיאמנטידס על הייעוץ הטכני והתמיכה שלהם עם ההתקנה וכיול הביו-הדפסה התלת-ממדית INKREDIBLE+ .
Materials
| A | |||
| Acetic Acid (glacial) | Sigma Aldrich | AX0074-6 | |
| Agarose (OmniPur) | EMD Millipore Corporation | 2125-500GM | |
| Armenian Hamster IgG Isotype Control, APC (Clone: eBio299Arm) | Thermo Fisher Scientific | 17-4888-82 | |
| B | |||
| b-Mercaptoethanol | Fisher Scientific | O3446I-100 | |
| b-Nicotinamide adenine dinucleotide sodium salt (NAD) | Sigma Aldrich | N0632-5G | |
| BD 5 mL Syringe (Luer-Lok Tip) | BD | 309646 | |
| BD PrecisionGlide Needle 26G x 1/2 in | BD | 305111 | |
| BioLite 24 Well Multidish | Thermo Fisher Scientific | 930-186 | |
| BioLite 96 Well Multidish | Thermo Fisher Scientific | 130-188 | |
| BioLite 175 cm2 Flask Vented | Thermo Fisher Scientific | 130-191 | |
| Biosafety Cabinet Class II | Microzone Corp., Canada | BK-2-6-B3 | |
| BSA, Fraction V (OmniPur) | EMD Millipore Corporation | 2930-100GM | |
| C | |||
| C57BL/6 mice | The Jackson Laboratory | 000664 | |
| CD117 (c-Kit) Monoclonal Antibody, PE (Clone: 2B8) | Thermo Fisher Scientific | 12-1171-82 | |
| CELLINK BIOINK (3 x 3 mL Cartridge) | CELLINK LLC | IK1020000303 | |
| CELLINK CaCl2 Crosslinking Agent – Sterile Bottle 1 x 60 mL | CELLINK LLC | CL1010006001 | |
| CELLINK Empty Cartridges 3cc with End and Tip Caps | CELLINK LLC | CSC0103000102 | |
| CELLINK HeartWare for PC | CELLINK LLC | Version 2.4.1 | |
| CELLINK INKREDIBLE+ 3D BIOPRINTER | CELLINK LLC | S-10003-001 | |
| CELLINK Sterile Standard Conical Bioprinting Nozzles 22G | CELLINK LLC | NZ4220005001 | |
| CELLINK Sterile Standard Conical Bioprinting Nozzles 25G | CELLINK LLC | NZ4250005001 | |
| CELLINK Sterile Standard Conical Bioprinting Nozzles 27G | CELLINK LLC | NZ4270005001 | |
| Cell Proliferation Kit II (XTT) (Roche) | Sigma Aldrich | 11465015001 | |
| Centrifuge (Benchtop) | Eppendorf | 5804R | |
| Corning Costar 96 Well Clear Flat-Bottom Non-Treated PS Microplate | Sigma Aldrich | CLS3370 | |
| CO2 Incubator | Binder GmbH, Germany | 9040-0113 | |
| CytoFLEX Flow Cytometer | Beckman Coulter | A00-1-1102 | |
| D | |||
| D-mannitol (MilliporeSigma Calbiochem) | Fisher Scientific | 44-390-7100GM | |
| F | |||
| Falcon 15 mL Polystyrene Conical Tubes, Sterile | Corning | 352095 | |
| Falcon 50 mL Polystyrene Conical Tubes, Sterile | Corning | 352070 | |
| FceR1 alpha Monoclonal Antibody, APC (Clone: MAR-1) | Thermo Fisher Scientific | 17-5898-82 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS), qualified, heat inactivated | Thermo Fisher Scientific | 12484028 | |
| FlowJo Software | Becton Dickinson & Co. USA | Version 10.6.2 | |
| G | |||
| GraphPad Prism | GraphPad Software, LLC | Version 8.4.3 | |
| H | |||
| Hemacytometer (Improved Neubauer 0.1 mmm deep levy) | VWR | 15170-208 | |
| HEPES Sodium Salt | Fisher Scientific | BP410-500 | |
| I | |||
| Iodonitrotetrazolium chloride (INT) | Sigma Aldrich | I10406-5G | |
| L | |||
| L-Glutamine 200 mM (Gibco) | Thermo Fisher Scientific | 25030-081 | |
| Lithium L-lactate | Sigma Aldrich | L2250-100G | |
| M | |||
| MEM Non-Essential Amino Acids 100 mL 100x (Gibco) | Thermo Fisher Scientific | 11140-050 | |
| 1-Methoxy-5-methylphenazinium methyl sulfate (MPMS) | Sigma Aldrich | M8640 | |
| Microtubes (1.7 mL clear) | Axygen | MCT-175-C | |
| Microtubes (2.0 mL clear) | Axygen | MCT-200-C | |
| MilliQ Academic (for producing MilliQ ultrapure water) | Millipore | ZMQS60001 | |
| N | |||
| Nalgene Rapid-Flow 90 mm Filter Unit (0.2 mm Pore size, 500 mL) | Thermo Fisher Scientific | 566-0020 | |
| Nalgene Syringe filter (0.2 mm PES, 25 mm) | Thermo Fisher Scientific | 725-2520 | |
| P | |||
| Penicillin Streptomycin 100 mL (Gibco) | Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | |
| PBS pH 7.4, No Calcium/Magnesium, 500 mL (Gibco) | Thermo Fisher Scientific | 10010-023 | |
| Propidium iodide, 1.0 mg/mL (Invitrogen) | Thermo Fisher Scientific | P3566 | |
| R | |||
| Rat IgG2b kappa Isotype Control, PE (Clone: eB149/10H5) | Thermo Fisher Scientific | 12-4031-82 | |
| Recombinant Murine IL-3 | PeproTech, Inc. | 213-13 | |
| RPMI-1640 Medium 1X + 2.05 mM L-Glutamine (HyClone) | GE Healthcare | SH30027.01 | |
| S | |||
| Sarstedt 96 well round base PS transparent micro test plate (82.1582.001) | Fisher Scientific | NC9913213 | |
| Sodium Azide, 500 g | Fisher Scientific | BP922I-500 | |
| Sodium Pyruvate (100 mM) 100X (Gibco) | Thermo Fisher Scientific | 11360-070 | |
| T | |||
| Tris Base (2-amino-2(hydroxymethyl)-1,3-propanediol) | Sigma Aldrich | 252859 | |
| Trypan Blue solution (0.4%, for microscopy) | Sigma Aldrich | 93595 | |
| V | |||
| VARIOSKAN LUX Microplate Spectrophotometer (Type: 3020) | Thermo Fisher Scientific | VLBL00D0 |
References
- Tibbitt, M. W., Anseth, K. S. Hydrogels as extracellular matrix mimics for 3D cell culture. Biotechnology and Bioengineering. 103 (4), 655-663 (2009).
- Drury, J. L., Mooney, D. J. Hydrogels for tissue engineering: Scaffold design variables and applications. Biomaterials. 24 (24), 4337-4351 (2003).
- Lee, K. Y., Mooney, D. J. Hydrogels for tissue engineering. Chemical Reviews. 101 (7), 1869-1879 (2001).
- Halib, N., Ahmad, I. Nanocellulose: Insight into health and medical applications. Handbook of Ecomaterials. , 1345-1363 (2019).
- Alonso-Lerma, B., et al. High performance crystalline nanocellulose using an ancestral endoglucanase. Communications Materials. 1 (1), 57 (2020).
- Tummala, G. K., Lopes, V. R., Mihranyan, A., Ferraz, N. Biocompatibility of nanocellulose-reinforced PVA hydrogel with human corneal epithelial cells for ophthalmic applications. Journal of Functional Biomaterials. 10 (3), 35 (2019).
- Fey, C., et al. Bacterial nanocellulose as novel carrier for intestinal epithelial cells in drug delivery studies. Materials Science and Engineering: C. 109, 110613 (2020).
- Ojansivu, M., et al. Wood-based nanocellulose and bioactive glass modified gelatin-alginate bioinks for 3D bioprinting of bone cells. Biofabrication. 11 (3), 035010 (2019).
- Jonsson, M., et al. Neuronal networks on nanocellulose scaffolds. Tissue Engineering Part C: Methods. 21 (11), 1162-1170 (2015).
- Samulin Erdem, J., et al. Cellulose nanocrystals modulate alveolar macrophage phenotype and phagocytic function. Biomaterials. 203, 31-42 (2019).
- Menas, A. L., et al. Fibrillar vs crystalline nanocellulose pulmonary epithelial cell responses: Cytotoxicity or inflammation. Chemosphere. 171, 671-680 (2017).
- Halova, I., Draberova, L., Draber, P. Mast cell chemotaxis chemoattractants and signaling pathways. Frontiers in Immunology. 3, 1-19 (2012).
- Groll, J., et al. A definition of bioinks and their distinction from biomaterial inks. Biofabrication. 11 (1), 013001 (2019).
- Schwab, A., et al. Printability and shape fidelity of bioinks in 3D bioprinting. Chemical Reviews. 120 (19), 11028-11055 (2020).
- Jungst, T., Smolan, W., Schacht, K., Scheibel, T., Groll, J. Strategies and molecular design criteria for 3D printable hydrogels. Chemical reviews. 116 (3), 1496-1539 (2016).
- Sasaki, D. T., Dumas, S. E., Engleman, E. G. Discrimination of viable and non-viable cells using propidium iodide in two color immunofluorescence. Cytometry. 8 (4), 413-420 (1987).
- Usov, I., et al. Understanding nanocellulose chirality and structure-properties relationship at the single fibril level. Nature Communications. 6 (1), 7564 (2015).
