Kemik İliği Türevi Mast Hücre Kültürü için Kristal Nanoselüloz Gömülü Agarose Biyomalzeme Mürekkep İmalatı
Summary
Bu protokol, hücre yüzeyi reseptörlerinin, Kit’in (CD117) ve yüksek benzeşimli IgE reseptörlerinin (FcφRI) hücre canlılığı ve fenotipik ekspresyumu açısından fare kemiğinden türetilmiş mast hücreleri ile kristal nanoselüloz (CNC)/agarose kompozit hidrojel biyomalzeme mürekkebinin biyouyumluluğunu hızla değerlendirmek için bir yöntemi vurgulamaktadır.
Abstract
Üç boyutlu (3D) biyobaskı, bir desende biriken hidrojel bazlı kompozitleri (veya biyomalzeme mürekkepleri) kullanır ve hücrelerin biriktirdiği bir substrat oluşturur. Birçok biyomalzeme mürekkede birincil hücreler için potansiyel olarak sitotoksik olabileceğinden, bu hidrojel kompozitlerin maliyetli 3D doku mühendisliği süreçlerinde kullanılmadan önce biyouyumlarını belirlemek gerekir. Biyobaskı da dahil olmak üzere bazı 3D kültür yöntemleri, hücrelerin bir 3D matrise gömülmesini gerektirir, bu da hücrelerin mekanik hasar vermeden canlılık ve biyobelirteç ifadesindeki değişiklikler için çıkarılmasını ve analizini zorlaştırır. Bu protokol, hücre canlılığı ve biyobelirteç ifadesi için akış sitometrik tahlilleri kullanılarak fare kemiğinden türetilmiş mast hücreleri (BMMC’ ler) ile 24 kuyulu bir kültür sistemine üretilen kristal nanoselüloz (CNC) gömülü agarose kompozitin biyouyumluluğunu değerlendirmek için bir yöntem olan kavram kanıtı olarak tanımlanmaktadır.
CNC/agarose/D-mannitol matrisine 18 saat maruz kaldıktan sonra, BMMC canlılığı propidiyum iyodür (PI) geçirgenliği ile ölçüldüğü gibi değiştirilmedi. Bununla birlikte, CNC /agarose/D-mannitol substratında kültürlenen BMMC’lerin, yüksek benzeşimli IgE reseptörü (FcφRI) ve kök hücre faktörü reseptörü (Kit; CD117), biyoink kompozitteki CNC miktarına bağlı görünmese de. BMMC’lerin uygulanabilirliği, fibriller nanoselüloz (FNC) ve sodyum aljinattan oluşan ticari bir biyomalzeme mürekkede 3D ekstrüzyon biyobaskı kullanılarak üretilen hidrojel iskelelere zaman seyri maruziyetinin ardından da değerlendirildi. 6-48 saat süren bir süre boyunca, FNC/aljinat substratları, akış sitometrisi ve mikroter tahlilleri (XTT ve laktat dehidrogenaz) ile belirlenen BMMC’lerin yaşayabilirliğini olumsuz etkilemedi. Bu protokol, aday biyomalzeme mürekkeplerinin yararları için biyokimyasal uyumluluğunu, mast hücreleriyle baskı sonrası tohumlama için 3D iskeleler olarak hızlı bir şekilde taramak için etkili bir yöntem açıklar.
Introduction
Son zamanlarda 3D kültür sistemlerine ve 3D biyobaskıya olan ilgi, hidrojel ve hidrojel kompozitlere odaklanmıştır. Bu kompozitler viskoz ama gözenekli biyomimetik görevi görmekte ve biyolojik dokularla karşılaştırılabilen ağırlık olarak %99’a kadar su içeriğinden oluşabilir1,2,3. Hidrojel kompozitlerin bu özellikleri, hücrelerin canlılıklarını ve işlevlerini etkilemeden büyümesine izin eder. Bu kompozitlerden biri, hidrojel kompozitlerde takviye malzemesi olarak kullanılan kristal nanoselülozdur (CNC), biyomalzeme implantların geliştirilmesinde hücre iskeleleri ve iki boyutlu (2D) ve 3D in vitro hücre kültüründe4,5. Çoğunlukla, CNC’den oluşan matrisler insan kornea epitel hücrelerine aşırı derecede sitotoksik değildir6, bağırsak epitel hücreleri7, insan kemik iliği türevi mezenkimal kök hücreler8 veya nöron benzeri hücreler9. Bununla birlikte, insan kemik iliği türevi mezenkimal kök hücrelerin metabolik aktivitesi ve çoğalması, ahşap bazlı nanoselüloz kompozitlerin artan viskozitesi ile korelasyonda azalır ve matrisin bileşiminin hücre fonksiyonları üzerindeki zararlı etkileri için dikkatlice test edilmesi gerektiğini düşündürmektedir8.
Benzer şekilde, CNC, 3D immün hücre kültürü sistemlerinde ciddi sonuçlar doğurabilecek içselleştirme üzerine makrofajlarda inflamatuar yanıtlara neden olabilir10,11. Aslında, CNC’nin diğer bağışıklık hücresi yanıtlarını, özellikle mast hücreleri tarafından başlatılan alerjik inflamatuar yanıtları nasıl etkileyebileceğine dair çok az veri vardır. Mast hücreleri, alerjenlere enflamatuar yanıtları aktive etmekten sorumlu yüksek benzeşimli IgE reseptörü FceRI’yi ifade eden granül lökositlerdir. Çoğalmaları ve farklılaşmaları, tirozin reseptörü Kit’i bağlayan kök hücre faktörüne (SCF) bağlıdır. Mast hücreleri dolaşıma giren ve daha sonra tüm insan dokularında her yerde dağılmak için periferik olarak göç eden kemik iliği progenitör hücrelerinden türetilir12. Mast hücreleri 3D doku ortamında işlev görürken, in vitro 3D doku modellerinde immünolojik süreçleri incelemek için ideal bir bağışıklık hücresi adayıdır. Ancak bugüne kadar mast hücrelerini içeren uygulanabilir in vitro 3D doku modeli bulunmamaktadır.
Mast hücrelerinin son derece hassas doğası ve dış uyaranlara pro-enflamatuar yanıtlar verme eğilimleri nedeniyle, daha fazla tartışıldığı gibi, 3D matris bileşenlerinin dikkatli bir şekilde değerlendirilmesi ve mast hücrelerinin 3D iskeleye sokulması için biyobaskı yöntemi gereklidir. Doku yapıları biyomalzemelerin iki geniş kategorisinden yani biyoinks ve biyomalzeme mürekkeplerinden biyofabrik olarak yapılabilir. Biyoinkslerin hücre yüklü hidrojel kompozitler olması, biyomalzeme mürekkeplerin ise Groll ve ark.13,14 tarafından tanımlandığı gibi hücrelerden yoksun hidrojel kompozitler olması ayrımı yatmaktadır. Bu nedenle, biyoinks ile basılan 3B yapılar hidrojel matrisine önceden gömülü hücreler içerirken, biyomalzeme mürekkeplerle basılan 3B yapıların baskı sonrası hücrelerle tohumlandırılması gerekir. Kültür iskelelerinin hidrojel bazlı biyoinks/biyomalzeme mürekkeplerden biyofabrikasyonu en yaygın olarak ekstrüzyon 3D biyobaskı kullanılarak gerçekleştirilir, bu da biyoink/ biyomalzeme mürekkesini pnömatik veya mekanik olarak tahrik edilen bir piston aracılığıyla basınç altında bir mikro ölçekli nozülden ekstrüde eder14. Ekstrüzyon biyobaskıları, biyoink’i ‘aşağıdan yukarıya’ bir yaklaşımla ardışık olarak üst üste yığılmış 2D kesit desenlerine biriktirerek 3D iskeleler üretmektedir.
Ekstrüzyon biyobaskı ile uyumlu olması için, hidrojel bazlı biyoink/ biyomalzeme mürekkede tiksotropik (kesme-inceltme) özelliklerine sahip olması gerekir, böylece biyoink / biyomalzeme mürekkesinin kurucu hidrojel polimerleri, kesme stresine maruz kaldığında bir mikrokanal nozuldan bir sıvı gibi akar, ancak shear stresinin giderilmesi üzerine viskoz, jel benzeri bir duruma geri döner15 . Yüksek su içeriği nedeniyle, 3D biyobaskı yapısının mimarisini ve yapısal bütünlüğünü korumak için hidrojel bazlı biyoinks / biyomalzeme mürekkeplerin polimerleri fiziksel veya tutarlı bir şekilde çapraz bağlanmalıdır. Hücre yüklü biyoinkslerde, hücreler çapraz bağlama işlemi sırasında doğrudan kimyasal streslere maruz kalır. Biyoink hidrojel matrisi içinde kapsüllenen ekstrüzyon hücrelerin ekstrüzyon süreci de hücreleri kesme stresine maruz kalır ve bu da canlılığın azalmasına ve/veya hücre ölümüne yol açabilir. 3D doku modeli biyobaskı yapıldıktan sonra, hidrojel matrisin kendisi tarafından ortaya çıkan sitotoksiklik seviyeleri ile ekstrüzyon ve çapraz bağlama işlemleri arasında ayrım yapmak zordur. Bu, hücrelerin hidrojel matrisine önceden gömüldüğü 3D iskeleler bağlamında özellikle zordur, bu nedenle hücrelerin sonraki analizler için çıkarılmasını zorlaştırır, bu da mast hücrelerinin yaşayabilirliğine zarar verir.
Mast hücreleri içeren 3D doku yapıları oluşturmaya yönelik daha nazik bir yaklaşım, hücrelerin önceden basılmış, gözenekli biyomalzeme mürekkep 3D iskelelere tohumlamayı içerir, bu da mast hücrelerinin dolaşımdan çevre dokulara göç etme yeteneğini arttırır. Bu hücre tohumlama yaklaşımının yararları iki kattır: (i) mast hücreleri sırasıyla ekstrüzyon ve çapraz bağlama işlemlerinden kesme ve kimyasal gerilmelere maruz kalmaz ve (ii) hücreler canlılıklarını olumsuz etkilemeden analiz için hafifçe yıkanarak maruz kaldıktan sonra 3D iskeleden kolayca çıkarılabilir. 2D hidrojel disklerin aksine 3D biyobaskılı, gözenekli hidrojel iskelelerde mast hücrelerinin hücre canlılığının tohumlandırılmasının ve analiz edilebilmesinin ek yararı, 3D biyobaskılı hidrojel iskelelerin, toplu olarak bulunmayan in vivo dokuların mikro ölçekli topografik özelliklerini, 2D düzlemsel hidrojel diskleri rekapitulate etmesidir. Bu yaklaşım, aday biyoink hidrojel matrislerinin, pahalı 3D doku mühendisliği deneylerine yatırım yapmadan önce mast hücreleri ve diğer immünolojik hücreler üzerindeki potansiyel olarak yıkıcı sitotoksik etkilerini belirlemek için uygun, hızlı ve uygun maliyetli bir yaklaşımdır.
Protocol
Representative Results
Discussion
3D biyomimetik dokuların imalatı, in vivo dokuların fizyolojik analoglarını oluşturmak için hücresel bileşenlerle hücresel matrisin bileşenlerini taklit eden biyoink’in başarılı bir şekilde birleştirilmesini gerektirir. Bu, fizyolojik biyomimetik dokular üretilirken dönüştürülmüş hücrelerin değil, birincil hücrelerin kullanılmasını gerektirir. Bununla birlikte, mast hücreleri gibi birincil immünolojik hücreler, özellikle sinoksik etkilere ve biyoink matrisinin kendisi tarafında…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Alberta Innovates’e CNC/agarose/D-mannitol matrisini hazırlarken teknik tavsiyeleri için CNC ve Ken Harris ve Jae-Young Cho’yu sağladıkları için teşekkür ederiz. Ayrıca Ben Hoffman, Heather Winchell ve Nicole Diamantides’e INKREDIBLE+ 3D biyobaskı kurulumu ve kalibrasyonu konusundaki teknik tavsiyeleri ve destekleri için teşekkür ederiz.
Materials
| A | |||
| Acetic Acid (glacial) | Sigma Aldrich | AX0074-6 | |
| Agarose (OmniPur) | EMD Millipore Corporation | 2125-500GM | |
| Armenian Hamster IgG Isotype Control, APC (Clone: eBio299Arm) | Thermo Fisher Scientific | 17-4888-82 | |
| B | |||
| b-Mercaptoethanol | Fisher Scientific | O3446I-100 | |
| b-Nicotinamide adenine dinucleotide sodium salt (NAD) | Sigma Aldrich | N0632-5G | |
| BD 5 mL Syringe (Luer-Lok Tip) | BD | 309646 | |
| BD PrecisionGlide Needle 26G x 1/2 in | BD | 305111 | |
| BioLite 24 Well Multidish | Thermo Fisher Scientific | 930-186 | |
| BioLite 96 Well Multidish | Thermo Fisher Scientific | 130-188 | |
| BioLite 175 cm2 Flask Vented | Thermo Fisher Scientific | 130-191 | |
| Biosafety Cabinet Class II | Microzone Corp., Canada | BK-2-6-B3 | |
| BSA, Fraction V (OmniPur) | EMD Millipore Corporation | 2930-100GM | |
| C | |||
| C57BL/6 mice | The Jackson Laboratory | 000664 | |
| CD117 (c-Kit) Monoclonal Antibody, PE (Clone: 2B8) | Thermo Fisher Scientific | 12-1171-82 | |
| CELLINK BIOINK (3 x 3 mL Cartridge) | CELLINK LLC | IK1020000303 | |
| CELLINK CaCl2 Crosslinking Agent – Sterile Bottle 1 x 60 mL | CELLINK LLC | CL1010006001 | |
| CELLINK Empty Cartridges 3cc with End and Tip Caps | CELLINK LLC | CSC0103000102 | |
| CELLINK HeartWare for PC | CELLINK LLC | Version 2.4.1 | |
| CELLINK INKREDIBLE+ 3D BIOPRINTER | CELLINK LLC | S-10003-001 | |
| CELLINK Sterile Standard Conical Bioprinting Nozzles 22G | CELLINK LLC | NZ4220005001 | |
| CELLINK Sterile Standard Conical Bioprinting Nozzles 25G | CELLINK LLC | NZ4250005001 | |
| CELLINK Sterile Standard Conical Bioprinting Nozzles 27G | CELLINK LLC | NZ4270005001 | |
| Cell Proliferation Kit II (XTT) (Roche) | Sigma Aldrich | 11465015001 | |
| Centrifuge (Benchtop) | Eppendorf | 5804R | |
| Corning Costar 96 Well Clear Flat-Bottom Non-Treated PS Microplate | Sigma Aldrich | CLS3370 | |
| CO2 Incubator | Binder GmbH, Germany | 9040-0113 | |
| CytoFLEX Flow Cytometer | Beckman Coulter | A00-1-1102 | |
| D | |||
| D-mannitol (MilliporeSigma Calbiochem) | Fisher Scientific | 44-390-7100GM | |
| F | |||
| Falcon 15 mL Polystyrene Conical Tubes, Sterile | Corning | 352095 | |
| Falcon 50 mL Polystyrene Conical Tubes, Sterile | Corning | 352070 | |
| FceR1 alpha Monoclonal Antibody, APC (Clone: MAR-1) | Thermo Fisher Scientific | 17-5898-82 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS), qualified, heat inactivated | Thermo Fisher Scientific | 12484028 | |
| FlowJo Software | Becton Dickinson & Co. USA | Version 10.6.2 | |
| G | |||
| GraphPad Prism | GraphPad Software, LLC | Version 8.4.3 | |
| H | |||
| Hemacytometer (Improved Neubauer 0.1 mmm deep levy) | VWR | 15170-208 | |
| HEPES Sodium Salt | Fisher Scientific | BP410-500 | |
| I | |||
| Iodonitrotetrazolium chloride (INT) | Sigma Aldrich | I10406-5G | |
| L | |||
| L-Glutamine 200 mM (Gibco) | Thermo Fisher Scientific | 25030-081 | |
| Lithium L-lactate | Sigma Aldrich | L2250-100G | |
| M | |||
| MEM Non-Essential Amino Acids 100 mL 100x (Gibco) | Thermo Fisher Scientific | 11140-050 | |
| 1-Methoxy-5-methylphenazinium methyl sulfate (MPMS) | Sigma Aldrich | M8640 | |
| Microtubes (1.7 mL clear) | Axygen | MCT-175-C | |
| Microtubes (2.0 mL clear) | Axygen | MCT-200-C | |
| MilliQ Academic (for producing MilliQ ultrapure water) | Millipore | ZMQS60001 | |
| N | |||
| Nalgene Rapid-Flow 90 mm Filter Unit (0.2 mm Pore size, 500 mL) | Thermo Fisher Scientific | 566-0020 | |
| Nalgene Syringe filter (0.2 mm PES, 25 mm) | Thermo Fisher Scientific | 725-2520 | |
| P | |||
| Penicillin Streptomycin 100 mL (Gibco) | Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | |
| PBS pH 7.4, No Calcium/Magnesium, 500 mL (Gibco) | Thermo Fisher Scientific | 10010-023 | |
| Propidium iodide, 1.0 mg/mL (Invitrogen) | Thermo Fisher Scientific | P3566 | |
| R | |||
| Rat IgG2b kappa Isotype Control, PE (Clone: eB149/10H5) | Thermo Fisher Scientific | 12-4031-82 | |
| Recombinant Murine IL-3 | PeproTech, Inc. | 213-13 | |
| RPMI-1640 Medium 1X + 2.05 mM L-Glutamine (HyClone) | GE Healthcare | SH30027.01 | |
| S | |||
| Sarstedt 96 well round base PS transparent micro test plate (82.1582.001) | Fisher Scientific | NC9913213 | |
| Sodium Azide, 500 g | Fisher Scientific | BP922I-500 | |
| Sodium Pyruvate (100 mM) 100X (Gibco) | Thermo Fisher Scientific | 11360-070 | |
| T | |||
| Tris Base (2-amino-2(hydroxymethyl)-1,3-propanediol) | Sigma Aldrich | 252859 | |
| Trypan Blue solution (0.4%, for microscopy) | Sigma Aldrich | 93595 | |
| V | |||
| VARIOSKAN LUX Microplate Spectrophotometer (Type: 3020) | Thermo Fisher Scientific | VLBL00D0 |
References
- Tibbitt, M. W., Anseth, K. S. Hydrogels as extracellular matrix mimics for 3D cell culture. Biotechnology and Bioengineering. 103 (4), 655-663 (2009).
- Drury, J. L., Mooney, D. J. Hydrogels for tissue engineering: Scaffold design variables and applications. Biomaterials. 24 (24), 4337-4351 (2003).
- Lee, K. Y., Mooney, D. J. Hydrogels for tissue engineering. Chemical Reviews. 101 (7), 1869-1879 (2001).
- Halib, N., Ahmad, I. Nanocellulose: Insight into health and medical applications. Handbook of Ecomaterials. , 1345-1363 (2019).
- Alonso-Lerma, B., et al. High performance crystalline nanocellulose using an ancestral endoglucanase. Communications Materials. 1 (1), 57 (2020).
- Tummala, G. K., Lopes, V. R., Mihranyan, A., Ferraz, N. Biocompatibility of nanocellulose-reinforced PVA hydrogel with human corneal epithelial cells for ophthalmic applications. Journal of Functional Biomaterials. 10 (3), 35 (2019).
- Fey, C., et al. Bacterial nanocellulose as novel carrier for intestinal epithelial cells in drug delivery studies. Materials Science and Engineering: C. 109, 110613 (2020).
- Ojansivu, M., et al. Wood-based nanocellulose and bioactive glass modified gelatin-alginate bioinks for 3D bioprinting of bone cells. Biofabrication. 11 (3), 035010 (2019).
- Jonsson, M., et al. Neuronal networks on nanocellulose scaffolds. Tissue Engineering Part C: Methods. 21 (11), 1162-1170 (2015).
- Samulin Erdem, J., et al. Cellulose nanocrystals modulate alveolar macrophage phenotype and phagocytic function. Biomaterials. 203, 31-42 (2019).
- Menas, A. L., et al. Fibrillar vs crystalline nanocellulose pulmonary epithelial cell responses: Cytotoxicity or inflammation. Chemosphere. 171, 671-680 (2017).
- Halova, I., Draberova, L., Draber, P. Mast cell chemotaxis chemoattractants and signaling pathways. Frontiers in Immunology. 3, 1-19 (2012).
- Groll, J., et al. A definition of bioinks and their distinction from biomaterial inks. Biofabrication. 11 (1), 013001 (2019).
- Schwab, A., et al. Printability and shape fidelity of bioinks in 3D bioprinting. Chemical Reviews. 120 (19), 11028-11055 (2020).
- Jungst, T., Smolan, W., Schacht, K., Scheibel, T., Groll, J. Strategies and molecular design criteria for 3D printable hydrogels. Chemical reviews. 116 (3), 1496-1539 (2016).
- Sasaki, D. T., Dumas, S. E., Engleman, E. G. Discrimination of viable and non-viable cells using propidium iodide in two color immunofluorescence. Cytometry. 8 (4), 413-420 (1987).
- Usov, I., et al. Understanding nanocellulose chirality and structure-properties relationship at the single fibril level. Nature Communications. 6 (1), 7564 (2015).
