Fabbricazione di un inchiostro biomateriale di agarosio incorporato in nanocellulosa cristallina per la coltura di mastociti derivati dal midollo osseo
Summary
Questo protocollo evidenzia un metodo per valutare rapidamente la biocompatibilità di un inchiostro biomateriale idrogel composito di nanocellulosa cristallina (CNC)/agarosio con mastociti derivati dal midollo osseo di topo in termini di vitalità cellulare ed espressione fenotipica dei recettori della superficie cellulare, Kit (CD117) e recettore IgE ad alta affinità (FcεRI).
Abstract
La bioprinting tridimensionale (3D) utilizza compositi a base di idrogel (o inchiostri di biomateriali) che si depositano in un modello, formando un substrato su cui vengono depositate le cellule. Poiché molti inchiostri di biomateriali possono essere potenzialmente citotossici per le cellule primarie, è necessario determinare la biocompatibilità di questi compositi idrogel prima del loro utilizzo in costosi processi di ingegneria tissutale 3D. Alcuni metodi di coltura 3D, tra cui il bioprinting, richiedono che le cellule siano incorporate in una matrice 3D, rendendo difficile estrarre e analizzare le cellule per i cambiamenti nella vitalità e nell’espressione dei biomarcatori senza provocare danni meccanici. Questo protocollo descrive come prova di concetto, un metodo per valutare la biocompatibilità di un composito di agarosio incorporato nella nanocellulosa cristallina (CNC), fabbricato in un sistema di coltura a 24 pozzetti, con mastociti derivati dal midollo osseo di topo (BMMC) utilizzando saggi citometrici a flusso per la vitalità cellulare e l’espressione di biomarcatori.
Dopo 18 ore di esposizione alla matrice CNC/agarosio/D-mannitolo, la vitalità del BMMC è rimasta inalterata misurata dalla permeabilità allo ioduro di propidio (PI). Tuttavia, le BMMC coltivate sul substrato CNC/agarosio/D-mannitolo sembravano aumentare leggermente la loro espressione del recettore IgE ad alta affinità (FcεRI) e del recettore del fattore delle cellule staminali (Kit; CD117), anche se questo non sembra dipendere dalla quantità di CNC nel composito bioink. La fattibilità dei BMMC è stata anche valutata a seguito di un’esposizione a intervalli di idrogel fabbricati da un inchiostro di biomateriale commerciale composto da nanocellulosa fibrillare (FNC) e alginato di sodio utilizzando un bioprinter di estrusione 3D. Per un periodo di 6-48 ore, i substrati FNC/alginato non hanno influenzato negativamente la vitalità delle BMMC come determinato mediante citometria a flusso e saggi di microtitolazione (XTT e lattato deidrogenasi). Questo protocollo descrive un metodo efficiente per esaminare rapidamente la compatibilità biochimica degli inchiostri biomateriali candidati per la loro utilità come scaffold 3D per la semina post-stampa con i mastociti.
Introduction
Il recente interesse per i sistemi di coltura 3D e il bioprinting 3D ha focalizzato l’attenzione su idrogel e compositi idrogel. Questi compositi fungono da biomimetica viscosa ma porosa e possono essere composti fino al 99% di contenuto di acqua in peso, che è paragonabile ai tessuti biologici1,2,3. Queste caratteristiche dei compositi idrogel consentono quindi la crescita delle cellule senza influire sulla loro vitalità e funzione. Uno di questi compositi è la nanocellulosa cristallina (CNC), che è stata utilizzata come materiale di rinforzo nei compositi idrogel, negli scaffold cellulari nello sviluppo di impianti di biomateriali e nelle colture cellulari bidimensionali (2D) e 3D in vitro4,5. Per la maggior parte, le matrici composte da CNC non sono apertamente citotossiche per le cellule epiteliali corneali umane6, le cellule epiteliali intestinali7, le cellule staminali mesenchimali derivate dal midollo osseo umano8 o le cellule neuronali9. Tuttavia, l’attività metabolica e la proliferazione delle cellule staminali mesenchimali derivate dal midollo osseo umano diminuiscono in correlazione con l’aumento della viscosità dei compositi nanocellulosici a base di legno, suggerendo che la composizione della matrice deve essere attentamente testata per i suoi effetti deleteri sulle funzioni cellulari8.
Allo stesso modo, il CNC può indurre risposte infiammatorie nei macrofagi dopo l’internalizzazione, che potrebbero avere gravi conseguenze nei sistemi di coltura cellulare immunitaria 3D10,11. In effetti, ci sono pochissimi dati disponibili su come il CNC può influenzare altre risposte delle cellule immunitarie, in particolare le risposte infiammatorie allergiche che vengono avviate dai mastociti. I mastociti sono leucociti granulati che esprimono il recettore delle IgE ad alta affinità, FceRI, responsabile dell’attivazione delle risposte infiammatorie agli allergeni. La loro proliferazione e differenziazione dipendono dal fattore delle cellule staminali (SCF), che lega il recettore della tirosina, Kit. I mastociti sono derivati da cellule progenitrici del midollo osseo che entrano in circolazione e successivamente migrano perifericamente per disperdersi ubiquitariamente in tutti i tessuti umani12. Poiché i mastociti funzionano in un ambiente tissutale 3D, sono un candidato immunocellulare ideale per lo studio dei processi immunologici in modelli tissutali 3D in vitro. Tuttavia, ad oggi, non esiste un modello di tessuto 3D in vitro praticabile contenente mastociti.
A causa della natura altamente sensibile dei mastociti e della loro propensione a suscitare risposte pro-infiammatorie a stimoli esterni, è necessaria un’attenta considerazione dei costituenti della matrice 3D e del metodo di bioprinting per introdurre i mastociti nello scaffold 3D, come discusso ulteriormente. I costrutti tissutali possono essere biofabbricati da due grandi categorie di biomateriali, vale a dire, bioink e inchiostri biomateriali. La distinzione sta nel fatto che i bioink sono compositi di idrogel carichi di cellule, mentre gli inchiostri di biomateriali sono compositi di idrogel privi di cellule, come definito da Groll et al.13,14. Quindi, i costrutti 3D stampati con bioink contengono cellule pre-incorporate all’interno della matrice idrogel, mentre i costrutti 3D stampati con inchiostri biomateriali devono essere seminati con cellule post-stampa. La biofabbricazione di scaffold di coltura da bioink / inchiostri biomateriali a base di idrogel viene eseguita più comunemente utilizzando bioprinter 3D di estrusione, che estrudono l’inchiostro bioink / biomateriale attraverso un ugello su microscala sotto pressione tramite un pistone pneumatico o meccanico14. Le biostampanti di estrusione fabbricano scaffold 3D depositando il bioink in modelli di sezione trasversale 2D che sono impilati sequenzialmente l’uno sull’altro in un approccio “bottom-up”.
Per essere compatibile con la bioprinting per estrusione, l’inchiostro bioink/biomateriale a base di idrogel deve possedere proprietà tissotropiche (diradamento del taglio), per cui i polimeri idrogel costituenti dell’inchiostro bioink/biomateriale fluiscono come un fluido attraverso un ugello a microcanale quando sottoposti a sforzo di taglio, ma ritornano a uno stato viscoso e gelatinoso dopo la rimozione dello stress di taglio15 . A causa del loro elevato contenuto di acqua, i polimeri di bioink a base di idrogel / inchiostri biomateriali devono essere reticolati, fisicamente o covalentemente, per mantenere l’architettura e l’integrità strutturale della struttura biostampata 3D. Nel caso di bioink carichi di cellule, le cellule sono direttamente sottoposte a sollecitazioni chimiche durante il processo di reticolazione. Il processo di estrusione delle cellule incapsulate all’interno della matrice di idrogel bioink sottopone anche le cellule a stress di taglio, che può portare a una ridotta vitalità e / o morte cellulare. Una volta che il modello tissutale 3D è stato biostampato, è difficile discriminare tra i livelli di citotossicità suscitati dalla matrice idrogel stessa e i processi di estrusione e reticolazione, rispettivamente. Ciò è particolarmente impegnativo nel contesto di scaffold 3D in cui le cellule sono pre-incorporate all’interno della matrice di idrogel, rendendo così difficile rimuovere le cellule per le analisi successive, il che sarebbe dannoso per la vitalità dei mastociti.
Un approccio più delicato alla generazione di costrutti tissutali 3D contenenti mastociti comporta la semina delle cellule in scaffold 3D a inchiostro biomateriale poroso prestampato da una sospensione di coltura cellulare, che sfrutta la capacità innata dei mastociti di migrare dalla circolazione ai tessuti periferici. I vantaggi di questo approccio di semina cellulare sono duplici: (i) i mastociti non sono sottoposti a sollecitazioni di taglio e chimiche dai processi di estrusione e reticolazione, rispettivamente, e (ii) le cellule possono essere facilmente rimosse dall’impalcatura 3D dopo l’esposizione mediante lavaggio delicato per l’analisi senza influire negativamente sulla loro vitalità. L’ulteriore vantaggio di seminare e analizzare la vitalità cellulare dei mastociti su scaffold di idrogel porosi biostampati in 3D rispetto ai dischi di idrogel 2D è che gli scaffold di idrogel biostampati in 3D ricapitolano le caratteristiche topografiche su microscala dei tessuti in vivo , che non sono presenti nei dischi idrogel planari 2D alla rinfusa. Questo approccio è un approccio adatto, rapido ed economico per determinare gli effetti citotossici potenzialmente catastrofici delle matrici di idrogel bioink candidate sui mastociti, così come su altre cellule immunologiche, prima di investire in costosi esperimenti di ingegneria tissutale 3D.
Protocol
Representative Results
Discussion
La fabbricazione di tessuti biomimetici 3D richiede la riuscita fusione del bioink, che imita i componenti della matrice extracellulare, con i componenti cellulari per creare analoghi fisiologici dei tessuti in vivo . Ciò richiede l’uso di cellule primarie, e non di cellule trasformate, quando si fabbricano tessuti biomimetici fisiologici. Le cellule immunologiche primarie, come i mastociti, tuttavia, sono particolarmente suscettibili agli effetti citotossici e ai cambiamenti fenotipici che possono essere provo…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo Alberta Innovates per aver fornito il CNC e Ken Harris e Jae-Young Cho per la loro consulenza tecnica durante la preparazione della matrice CNC / agarosio / D-mannitolo. Ringraziamo anche Ben Hoffman, Heather Winchell e Nicole Diamantides per la loro consulenza tecnica e supporto con la configurazione e la calibrazione della bioprinter 3D INKREDIBLE+.
Materials
| A | |||
| Acetic Acid (glacial) | Sigma Aldrich | AX0074-6 | |
| Agarose (OmniPur) | EMD Millipore Corporation | 2125-500GM | |
| Armenian Hamster IgG Isotype Control, APC (Clone: eBio299Arm) | Thermo Fisher Scientific | 17-4888-82 | |
| B | |||
| b-Mercaptoethanol | Fisher Scientific | O3446I-100 | |
| b-Nicotinamide adenine dinucleotide sodium salt (NAD) | Sigma Aldrich | N0632-5G | |
| BD 5 mL Syringe (Luer-Lok Tip) | BD | 309646 | |
| BD PrecisionGlide Needle 26G x 1/2 in | BD | 305111 | |
| BioLite 24 Well Multidish | Thermo Fisher Scientific | 930-186 | |
| BioLite 96 Well Multidish | Thermo Fisher Scientific | 130-188 | |
| BioLite 175 cm2 Flask Vented | Thermo Fisher Scientific | 130-191 | |
| Biosafety Cabinet Class II | Microzone Corp., Canada | BK-2-6-B3 | |
| BSA, Fraction V (OmniPur) | EMD Millipore Corporation | 2930-100GM | |
| C | |||
| C57BL/6 mice | The Jackson Laboratory | 000664 | |
| CD117 (c-Kit) Monoclonal Antibody, PE (Clone: 2B8) | Thermo Fisher Scientific | 12-1171-82 | |
| CELLINK BIOINK (3 x 3 mL Cartridge) | CELLINK LLC | IK1020000303 | |
| CELLINK CaCl2 Crosslinking Agent – Sterile Bottle 1 x 60 mL | CELLINK LLC | CL1010006001 | |
| CELLINK Empty Cartridges 3cc with End and Tip Caps | CELLINK LLC | CSC0103000102 | |
| CELLINK HeartWare for PC | CELLINK LLC | Version 2.4.1 | |
| CELLINK INKREDIBLE+ 3D BIOPRINTER | CELLINK LLC | S-10003-001 | |
| CELLINK Sterile Standard Conical Bioprinting Nozzles 22G | CELLINK LLC | NZ4220005001 | |
| CELLINK Sterile Standard Conical Bioprinting Nozzles 25G | CELLINK LLC | NZ4250005001 | |
| CELLINK Sterile Standard Conical Bioprinting Nozzles 27G | CELLINK LLC | NZ4270005001 | |
| Cell Proliferation Kit II (XTT) (Roche) | Sigma Aldrich | 11465015001 | |
| Centrifuge (Benchtop) | Eppendorf | 5804R | |
| Corning Costar 96 Well Clear Flat-Bottom Non-Treated PS Microplate | Sigma Aldrich | CLS3370 | |
| CO2 Incubator | Binder GmbH, Germany | 9040-0113 | |
| CytoFLEX Flow Cytometer | Beckman Coulter | A00-1-1102 | |
| D | |||
| D-mannitol (MilliporeSigma Calbiochem) | Fisher Scientific | 44-390-7100GM | |
| F | |||
| Falcon 15 mL Polystyrene Conical Tubes, Sterile | Corning | 352095 | |
| Falcon 50 mL Polystyrene Conical Tubes, Sterile | Corning | 352070 | |
| FceR1 alpha Monoclonal Antibody, APC (Clone: MAR-1) | Thermo Fisher Scientific | 17-5898-82 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS), qualified, heat inactivated | Thermo Fisher Scientific | 12484028 | |
| FlowJo Software | Becton Dickinson & Co. USA | Version 10.6.2 | |
| G | |||
| GraphPad Prism | GraphPad Software, LLC | Version 8.4.3 | |
| H | |||
| Hemacytometer (Improved Neubauer 0.1 mmm deep levy) | VWR | 15170-208 | |
| HEPES Sodium Salt | Fisher Scientific | BP410-500 | |
| I | |||
| Iodonitrotetrazolium chloride (INT) | Sigma Aldrich | I10406-5G | |
| L | |||
| L-Glutamine 200 mM (Gibco) | Thermo Fisher Scientific | 25030-081 | |
| Lithium L-lactate | Sigma Aldrich | L2250-100G | |
| M | |||
| MEM Non-Essential Amino Acids 100 mL 100x (Gibco) | Thermo Fisher Scientific | 11140-050 | |
| 1-Methoxy-5-methylphenazinium methyl sulfate (MPMS) | Sigma Aldrich | M8640 | |
| Microtubes (1.7 mL clear) | Axygen | MCT-175-C | |
| Microtubes (2.0 mL clear) | Axygen | MCT-200-C | |
| MilliQ Academic (for producing MilliQ ultrapure water) | Millipore | ZMQS60001 | |
| N | |||
| Nalgene Rapid-Flow 90 mm Filter Unit (0.2 mm Pore size, 500 mL) | Thermo Fisher Scientific | 566-0020 | |
| Nalgene Syringe filter (0.2 mm PES, 25 mm) | Thermo Fisher Scientific | 725-2520 | |
| P | |||
| Penicillin Streptomycin 100 mL (Gibco) | Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | |
| PBS pH 7.4, No Calcium/Magnesium, 500 mL (Gibco) | Thermo Fisher Scientific | 10010-023 | |
| Propidium iodide, 1.0 mg/mL (Invitrogen) | Thermo Fisher Scientific | P3566 | |
| R | |||
| Rat IgG2b kappa Isotype Control, PE (Clone: eB149/10H5) | Thermo Fisher Scientific | 12-4031-82 | |
| Recombinant Murine IL-3 | PeproTech, Inc. | 213-13 | |
| RPMI-1640 Medium 1X + 2.05 mM L-Glutamine (HyClone) | GE Healthcare | SH30027.01 | |
| S | |||
| Sarstedt 96 well round base PS transparent micro test plate (82.1582.001) | Fisher Scientific | NC9913213 | |
| Sodium Azide, 500 g | Fisher Scientific | BP922I-500 | |
| Sodium Pyruvate (100 mM) 100X (Gibco) | Thermo Fisher Scientific | 11360-070 | |
| T | |||
| Tris Base (2-amino-2(hydroxymethyl)-1,3-propanediol) | Sigma Aldrich | 252859 | |
| Trypan Blue solution (0.4%, for microscopy) | Sigma Aldrich | 93595 | |
| V | |||
| VARIOSKAN LUX Microplate Spectrophotometer (Type: 3020) | Thermo Fisher Scientific | VLBL00D0 |
References
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