Fabricação de uma nanocelulose cristalina incorporada tinta biomaterial agarose para cultura de célula de mastro derivada da medula óssea
Summary
Este protocolo destaca um método para avaliar rapidamente a biocompatibilidade de uma nanocelulose cristalina (CNC)/agarose tinta biomaterial de hidrogel composto com células de mastro derivadas da medula óssea em termos de viabilidade celular e expressão fenotípica dos receptores de superfície celular, Kit (CD117) e receptor IgE de alta afinidade (FcεRI).
Abstract
A bioimpressão tridimensional (3D) utiliza compósitos à base de hidrogel (ou tintas biomateriais) que são depositados em um padrão, formando um substrato sobre o qual as células são depositadas. Como muitas tintas biomateriais podem ser potencialmente citotóxias para células primárias, é necessário determinar a biocompatibilidade desses compósitos de hidrogel antes de sua utilização em processos dispendiosos de engenharia de tecidos 3D. Alguns métodos de cultura 3D, incluindo a bioimpressão, exigem que as células sejam incorporadas em uma matriz 3D, dificultando a extração e análise das células para mudanças na viabilidade e expressão biomarcadora sem provocar danos mecânicos. Este protocolo descreve como prova de conceito, um método para avaliar a biocompatibilidade de um composto de agarose incorporado de nanocelulose cristalina (CNC), fabricado em um sistema de cultura de 24 poços, com células de mastro derivadas da medula óssea (BMMCs) usando assins de fluxo citométrico para viabilidade celular e expressão biomarcadora.
Após 18 h de exposição à matriz CNC/agarose/D-mannitol, a viabilidade do BMMC foi inalterada medida pela permeabilidade do iodeto de propídio (PI). No entanto, os BMMCs cultivados no substrato CNC/agarose/D-mannitol pareciam aumentar ligeiramente sua expressão do receptor IgE de alta afinidade (FcεRI) e do receptor de fator de células-tronco (Kit; CD117), embora isso não pareça depender da quantidade de CNC no composto bioink. A viabilidade dos BMMCs também foi avaliada após uma exposição de curso temporal a andaimes de hidrogel que foram fabricados a partir de uma tinta biomaterial comercial composta de nanocelulose fibrilar (FNC) e alginato de sódio utilizando uma bioimpressora de extrusão 3D. Durante um período de 6-48 h, os substratos FNC/alginate não afetaram negativamente a viabilidade dos BMMCs conforme determinado por ensaios de citometria de fluxo e microtiter (XTT e desidrogenase de lactato). Este protocolo descreve um método eficiente para selecionar rapidamente a compatibilidade bioquímica das tintas biomateriais do candidato para sua utilidade como andaimes 3D para semeadura pós-impressão com células de mastro.
Introduction
O recente interesse em sistemas de cultura 3D e bioimpressão 3D tem focado a atenção em hidrogéis e compósitos de hidrogel. Esses compósitos servem como biomimética viscosa, mas porosa, e podem ser compostos de até 99% de teor de água em peso, o que é comparável aos tecidos biológicos1,2,3. Essas características dos compósitos de hidrogel permitem assim o crescimento das células sem afetar sua viabilidade e função. Um desses compostos é a nanocelulose cristalina (CNC), que tem sido usada como material de reforço em compósitos de hidrogel, andaimes celulares no desenvolvimento de implantes biomateriais, e em culturas bidimensionais (2D) e 3D in vitro cell culture4,5. Na maioria das vezes, as matrizes compostas de CNC não são abertamente citotóxicas para células epiteliais córneas humanas6, células epiteliais intestinais7, células-tronco mesenquimais derivadas da medula óssea humana8, ou células semelhantes a neurônios9. No entanto, a atividade metabólica e a proliferação de células-tronco mesenquimais derivadas da medula óssea humana diminuem em correlação com o aumento da viscosidade dos compósitos de nanocelulose à base de madeira, sugerindo que a composição da matriz deve ser cuidadosamente testada para seus efeitos deletérios nas funções celulares8.
Da mesma forma, a CNC pode induzir respostas inflamatórias em macrófagos após a internalização, o que pode ter sérias consequências nos sistemas de cultura de células imunes 3D10,11. Na verdade, há muito poucos dados disponíveis sobre como a CNC pode influenciar outras respostas de células imunes, particularmente respostas inflamatórias alérgicas que são iniciadas por células de mastro. As células de mastro são leucócitos granulados que expressam o receptor IgE de alta afinidade, FceRI, responsável por ativar respostas inflamatórias a alérgenos. Sua proliferação e diferenciação são o fator célula-tronco dependente (SCF), que liga o receptor de tyrosina, Kit. As células de mastro são derivadas de células progenitoras de medula óssea que entram na circulação e, posteriormente, migram periféricamente para dispersar-se onipresentemente em todos os tecidos humanos12. Como as células de mastro funcionam em um ambiente de tecido 3D, elas são uma célula imune ideal para estudar processos imunológicos em modelos in vitro de tecido 3D. No entanto, até o momento, não há nenhum modelo de tecido 3D in vitro viável contendo células de mastro.
Devido à natureza altamente sensível das células de mastro e sua propensão a obter respostas pró-inflamatórias a estímulos externos, é necessária uma consideração cuidadosa dos constituintes da matriz 3D e o método bioimpressora de introduzir células de mastro no andaime 3D, como discutido mais adiante. Construções teciduais podem ser biofabricadas a partir de duas grandes categorias de biomateriais, ou seja, bioinks e tintas biomateriais. A distinção reside no fato de que os bioinks são compostos de hidrogel carregados de células, enquanto as tintas biomateriais são compósitos de hidrogel que são desprovidos de células, como definido por Groll et al.13,14. Assim, construções 3D impressas com bioinks contêm células pré-incorporadas dentro da matriz de hidrogel, enquanto construções 3D impressas com tintas biomateriais precisam ser semeadas com células pós-impressão. A biofabricação de andaimes de cultura de bioinks/tintas biomateriais à base de hidrogel é mais comumente realizada usando bioimpressores 3D de extrusão, que extrusem a tinta bioink/bioma material por meio de um bico de microescala sob pressão através de um pistão pneumaticamente ou mecanicamente conduzido14. Bioimpressoras de extrusão fabricam andaimes 3D depositando o bioink em padrões transversais 2D que são sequencialmente empilhados uns sobre os outros em uma abordagem “de baixo para cima”.
Para ser compatível com a bioimpressão de extrusão, a tinta bioink/biomaterial à base de hidrogel deve possuir propriedades tioxrópicas (desbastação), pelas quais os polímeros de hidrogel constituinte do fluxo de tinta bioink/biomaterial como um fluido através de um bocal de microcanal quando submetido a estresse de cisalhamento, mas revertam para um estado viscoso, semelhante a gel, após a remoção do estresse da tesoura15 . Devido ao seu alto teor de água, os polímeros de bioinks/tintas biomateriais à base de hidrogel devem ser interligados, física ou covalentemente, para manter a arquitetura e a integridade estrutural da estrutura bioimpressora 3D. No caso de bioinks carregados de células, as células são diretamente submetidas a tensões químicas durante o processo de crosslinking. O processo de extrusão de células encapsuladas dentro da matriz de hidrogel bioink também submete as células ao estresse de tesoura, o que pode levar à redução da viabilidade e/ou morte celular. Uma vez que o modelo de tecido 3D tenha sido bioimpresso, é difícil discriminar entre os níveis de citotoxicidade provocados pela própria matriz de hidrogel e os processos de extrusão e crosslinking, respectivamente. Isso é particularmente desafiador no contexto dos andaimes 3D onde as células são pré-incorporadas dentro da matriz de hidrogel, dificultando a remoção das células para análises subsequentes, o que seria prejudicial à viabilidade das células de mastro.
Uma abordagem mais suave para gerar construções de tecido 3D contendo células de mastro envolve a semeadura das células em andaimes de tinta biomaterial porosa pré-impressos a partir de uma suspensão de cultura celular, o que aproveita a capacidade inata das células de mastro de migrar da circulação para tecidos periféricos. Os benefícios dessa abordagem de semeadura celular são duas vezes: (i) as células de mastro não são submetidas a tensões de tesoura e químicas dos processos de extrusão e crosslinking, respectivamente, e (ii) as células podem ser facilmente removidas do andaime 3D após a exposição por lavagem suave para análise sem afetar negativamente sua viabilidade. O benefício adicional de semear e analisar a viabilidade celular das células de mastro em andaimes de hidrogel bioimpresso 3D, em oposição aos discos de hidrogel 2D é que os andaimes hidrogel bioimpressores 3D recapitulam características topográficas microescalas de tecidos in vivo , que não estão presentes em discos hidrogel 2D a granel. Esta abordagem é uma abordagem adequada, rápida e econômica para determinar os efeitos citotóxicos potencialmente catastróficos das matrizes de hidrogel bioink candidatas em células de mastro, bem como outras células imunológicas, antes do investimento em experimentos dispendiosos de engenharia de tecidos 3D.
Protocol
Representative Results
Discussion
A fabricação de tecidos biomiméticos 3D requer a amálgama bem sucedida do bioink, que imita componentes da matriz extracelular, com o componente celular para criar análogos fisiológicos de tecidos in vivo . Isso requer o uso de células primárias, e não células transformadas, ao fabricar tecidos biomiméticos fisiológicos. As células imunológicas primárias, como as células de mastro, no entanto, são particularmente suscetíveis a efeitos citotóxicos e alterações fenotípicas que podem ser provo…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos à Alberta Innovates por fornecer à CNC e Ken Harris e Jae-Young Cho por seus conselhos técnicos ao preparar a matriz CNC/Agarose/D-mannitol. Agradecemos também a Ben Hoffman, Heather Winchell e Nicole Diamantides por seus conselhos técnicos e suporte com a configuração e calibração da bioimpressora INKREDIBLE+ 3D.
Materials
| A | |||
| Acetic Acid (glacial) | Sigma Aldrich | AX0074-6 | |
| Agarose (OmniPur) | EMD Millipore Corporation | 2125-500GM | |
| Armenian Hamster IgG Isotype Control, APC (Clone: eBio299Arm) | Thermo Fisher Scientific | 17-4888-82 | |
| B | |||
| b-Mercaptoethanol | Fisher Scientific | O3446I-100 | |
| b-Nicotinamide adenine dinucleotide sodium salt (NAD) | Sigma Aldrich | N0632-5G | |
| BD 5 mL Syringe (Luer-Lok Tip) | BD | 309646 | |
| BD PrecisionGlide Needle 26G x 1/2 in | BD | 305111 | |
| BioLite 24 Well Multidish | Thermo Fisher Scientific | 930-186 | |
| BioLite 96 Well Multidish | Thermo Fisher Scientific | 130-188 | |
| BioLite 175 cm2 Flask Vented | Thermo Fisher Scientific | 130-191 | |
| Biosafety Cabinet Class II | Microzone Corp., Canada | BK-2-6-B3 | |
| BSA, Fraction V (OmniPur) | EMD Millipore Corporation | 2930-100GM | |
| C | |||
| C57BL/6 mice | The Jackson Laboratory | 000664 | |
| CD117 (c-Kit) Monoclonal Antibody, PE (Clone: 2B8) | Thermo Fisher Scientific | 12-1171-82 | |
| CELLINK BIOINK (3 x 3 mL Cartridge) | CELLINK LLC | IK1020000303 | |
| CELLINK CaCl2 Crosslinking Agent – Sterile Bottle 1 x 60 mL | CELLINK LLC | CL1010006001 | |
| CELLINK Empty Cartridges 3cc with End and Tip Caps | CELLINK LLC | CSC0103000102 | |
| CELLINK HeartWare for PC | CELLINK LLC | Version 2.4.1 | |
| CELLINK INKREDIBLE+ 3D BIOPRINTER | CELLINK LLC | S-10003-001 | |
| CELLINK Sterile Standard Conical Bioprinting Nozzles 22G | CELLINK LLC | NZ4220005001 | |
| CELLINK Sterile Standard Conical Bioprinting Nozzles 25G | CELLINK LLC | NZ4250005001 | |
| CELLINK Sterile Standard Conical Bioprinting Nozzles 27G | CELLINK LLC | NZ4270005001 | |
| Cell Proliferation Kit II (XTT) (Roche) | Sigma Aldrich | 11465015001 | |
| Centrifuge (Benchtop) | Eppendorf | 5804R | |
| Corning Costar 96 Well Clear Flat-Bottom Non-Treated PS Microplate | Sigma Aldrich | CLS3370 | |
| CO2 Incubator | Binder GmbH, Germany | 9040-0113 | |
| CytoFLEX Flow Cytometer | Beckman Coulter | A00-1-1102 | |
| D | |||
| D-mannitol (MilliporeSigma Calbiochem) | Fisher Scientific | 44-390-7100GM | |
| F | |||
| Falcon 15 mL Polystyrene Conical Tubes, Sterile | Corning | 352095 | |
| Falcon 50 mL Polystyrene Conical Tubes, Sterile | Corning | 352070 | |
| FceR1 alpha Monoclonal Antibody, APC (Clone: MAR-1) | Thermo Fisher Scientific | 17-5898-82 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS), qualified, heat inactivated | Thermo Fisher Scientific | 12484028 | |
| FlowJo Software | Becton Dickinson & Co. USA | Version 10.6.2 | |
| G | |||
| GraphPad Prism | GraphPad Software, LLC | Version 8.4.3 | |
| H | |||
| Hemacytometer (Improved Neubauer 0.1 mmm deep levy) | VWR | 15170-208 | |
| HEPES Sodium Salt | Fisher Scientific | BP410-500 | |
| I | |||
| Iodonitrotetrazolium chloride (INT) | Sigma Aldrich | I10406-5G | |
| L | |||
| L-Glutamine 200 mM (Gibco) | Thermo Fisher Scientific | 25030-081 | |
| Lithium L-lactate | Sigma Aldrich | L2250-100G | |
| M | |||
| MEM Non-Essential Amino Acids 100 mL 100x (Gibco) | Thermo Fisher Scientific | 11140-050 | |
| 1-Methoxy-5-methylphenazinium methyl sulfate (MPMS) | Sigma Aldrich | M8640 | |
| Microtubes (1.7 mL clear) | Axygen | MCT-175-C | |
| Microtubes (2.0 mL clear) | Axygen | MCT-200-C | |
| MilliQ Academic (for producing MilliQ ultrapure water) | Millipore | ZMQS60001 | |
| N | |||
| Nalgene Rapid-Flow 90 mm Filter Unit (0.2 mm Pore size, 500 mL) | Thermo Fisher Scientific | 566-0020 | |
| Nalgene Syringe filter (0.2 mm PES, 25 mm) | Thermo Fisher Scientific | 725-2520 | |
| P | |||
| Penicillin Streptomycin 100 mL (Gibco) | Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | |
| PBS pH 7.4, No Calcium/Magnesium, 500 mL (Gibco) | Thermo Fisher Scientific | 10010-023 | |
| Propidium iodide, 1.0 mg/mL (Invitrogen) | Thermo Fisher Scientific | P3566 | |
| R | |||
| Rat IgG2b kappa Isotype Control, PE (Clone: eB149/10H5) | Thermo Fisher Scientific | 12-4031-82 | |
| Recombinant Murine IL-3 | PeproTech, Inc. | 213-13 | |
| RPMI-1640 Medium 1X + 2.05 mM L-Glutamine (HyClone) | GE Healthcare | SH30027.01 | |
| S | |||
| Sarstedt 96 well round base PS transparent micro test plate (82.1582.001) | Fisher Scientific | NC9913213 | |
| Sodium Azide, 500 g | Fisher Scientific | BP922I-500 | |
| Sodium Pyruvate (100 mM) 100X (Gibco) | Thermo Fisher Scientific | 11360-070 | |
| T | |||
| Tris Base (2-amino-2(hydroxymethyl)-1,3-propanediol) | Sigma Aldrich | 252859 | |
| Trypan Blue solution (0.4%, for microscopy) | Sigma Aldrich | 93595 | |
| V | |||
| VARIOSKAN LUX Microplate Spectrophotometer (Type: 3020) | Thermo Fisher Scientific | VLBL00D0 |
References
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