Fabricage van een kristallijne nanocellulose ingebedde agarose biomateriaal inkt voor beenmerg-afgeleide mestcelkweek
Summary
Dit protocol benadrukt een methode om snel de biocompatibiliteit van een kristallijne nanocellulose (CNC) / agarose composiet hydrogel biomateriaal inkt met muis beenmerg-afgeleide mestcellen te beoordelen in termen van cel levensvatbaarheid en fenotypische expressie van de celoppervlak receptoren, Kit (CD117) en hoge affiniteit IgE receptor (FcεRI).
Abstract
Driedimensionaal (3D) bioprinten maakt gebruik van op hydrogel gebaseerde composieten (of biomateriaalinkten) die in een patroon worden afgezet en een substraat vormen waarop cellen worden afgezet. Omdat veel biomateriaalinkten potentieel cytotoxisch kunnen zijn voor primaire cellen, is het noodzakelijk om de biocompatibiliteit van deze hydrogelcomposieten te bepalen voordat ze worden gebruikt in kostbare 3D-weefselmanipulatieprocessen. Sommige 3D-kweekmethoden, waaronder bioprinting, vereisen dat cellen worden ingebed in een 3D-matrix, waardoor het moeilijk is om de cellen te extraheren en te analyseren op veranderingen in levensvatbaarheid en biomarkerexpressie zonder mechanische schade uit te lokken. Dit protocol beschrijft als proof of concept, een methode om de biocompatibiliteit van een kristallijne nanocellulose (CNC) ingebed agarosecomposiet te beoordelen, vervaardigd in een 24-well kweeksysteem, met muisbeenmerg-afgeleide mestcellen (BMMCs) met behulp van flowcytometrische assays voor cel levensvatbaarheid en biomarkerexpressie.
Na 18 uur blootstelling aan de CNC/agarose/D-mannitol matrix was de levensvatbaarheid van bmmc ongewijzigd zoals gemeten door propidiumjodide (PI) permeabiliteit. BMMCs gekweekt op het CNC/agarose/D-mannitol substraat bleken echter hun expressie van de hoge-affiniteit IgE receptor (FcεRI) en de stamcelfactor receptor (Kit; CD117), hoewel dit niet afhankelijk lijkt te zijn van de hoeveelheid CNC in het bioinkcomposiet. De levensvatbaarheid van BMMCs werd ook beoordeeld na een tijdsbehandeling met hydrogelsteigers die werden vervaardigd uit een commerciële biomateriaalinkt bestaande uit fibrillaire nanocellulose (FNC) en natriumalginaat met behulp van een 3D-extrusiebioprinter. Gedurende een periode van 6-48 uur hadden de FNC/alginaatsubstraten geen negatieve invloed op de levensvatbaarheid van de BMMCs zoals bepaald door flowcytometrie en microtitertests (XTT en lactaatdehydrogenase). Dit protocol beschrijft een efficiënte methode om snel de biochemische compatibiliteit van kandidaat-biomateriaalinkten te screenen op hun nut als 3D-steigers voor post-print zaaien met mestcellen.
Introduction
De recente interesse in 3D-kweeksystemen en 3D-bioprinting heeft de aandacht gevestigd op hydrogels en hydrogelcomposieten. Deze composieten dienen als viskeuze maar poreuze biomimetica en kunnen worden samengesteld uit maximaal 99% watergehalte in gewicht, wat vergelijkbaar is met biologische weefsels1,2,3. Deze kenmerken van hydrogelcomposieten maken daardoor de groei van cellen mogelijk zonder hun levensvatbaarheid en functie te beïnvloeden. Een van die composieten is kristallijne nanocellulose (CNC), die is gebruikt als versterkend materiaal in hydrogelcomposieten, celsteigers bij de ontwikkeling van biomateriaalimplantaten en in tweedimensionale (2D) en 3D in vitro celcultuur4,5. Voor het grootste deel zijn matrices samengesteld uit CNC niet openlijk cytotoxisch voor menselijke cornea-epitheelcellen6, intestinale epitheelcellen7, van menselijk beenmerg afgeleide mesenchymale stamcellen8 of neuronachtige cellen9. Metabole activiteit en proliferatie van van menselijk beenmerg afgeleide mesenchymale stamcellen neemt echter af in correlatie met de verhoogde viscositeit van op hout gebaseerde nanocellulosecomposieten, wat suggereert dat de samenstelling van de matrix zorgvuldig moet worden getest op zijn schadelijke effecten op celfuncties8.
Evenzo kan CNC ontstekingsreacties in macrofagen induceren bij internalisatie, wat ernstige gevolgen kan hebben in 3D-immuuncelkweeksystemen10,11. In feite zijn er zeer weinig gegevens beschikbaar over hoe CNC andere immuuncelreacties kan beïnvloeden, met name allergische ontstekingsreacties die worden geïnitieerd door mestcellen. Mestcellen zijn gegranuleerde leukocyten die de IgE-receptor met hoge affiniteit, FceRI, tot expressie brengen, verantwoordelijk voor het activeren van ontstekingsreacties op allergenen. Hun proliferatie en differentiatie zijn afhankelijk van stamcelfactor (SCF), die de tyrosinereceptor Kit bindt. Mestcellen zijn afgeleid van beenmergvoorlopercellen die de circulatie binnenkomen en vervolgens perifeer migreren om zich alomtegenwoordig te verspreiden in alle menselijke weefsels12. Omdat mestcellen functioneren in een 3D-weefselomgeving, zijn ze een ideale immuuncelkandidaat voor het bestuderen van immunologische processen in in vitro 3D-weefselmodellen. Tot op heden is er echter geen levensvatbaar in vitro 3D-weefselmodel dat mestcellen bevat.
Vanwege de zeer gevoelige aard van mestcellen en hun neiging om pro-inflammatoire reacties op externe stimuli uit te lokken, is een zorgvuldige overweging van de 3D-matrixbestanddelen en de bioprintmethode voor het introduceren van mestcellen in de 3D-steiger vereist, zoals verder besproken. Weefselconstructies kunnen worden gebiofabriceerd uit twee brede categorieën biomaterialen, d.w.z. bioinkten en biomateriaalinkten. Het onderscheid ligt in het feit dat bioinks celbeladen hydrogelcomposieten zijn, terwijl biomateriaalinkten hydrogelcomposieten zijn die verstoken zijn van cellen, zoals gedefinieerd door Groll et al.13,14. Vandaar dat 3D-constructies geprint met bioinks cellen bevatten die vooraf zijn ingebed in de hydrogelmatrix, terwijl 3D-constructies die zijn geprint met biomateriaalinkten moeten worden gezaaid met cellen na het printen. De biofabricage van kweeksteigers van op hydrogel gebaseerde bioinkten /biomateriaalinkten wordt meestal uitgevoerd met behulp van extrusie 3D-bioprinters, die de bioink / biomateriaalinkt onder druk extruderen door een mondstuk op microschaal via een pneumatisch of mechanisch aangedreven zuiger14. Extrusiebioprinters fabriceren 3D-steigers door de bioink af te zetten in 2D-dwarsdoorsnedepatronen die achtereenvolgens op elkaar worden gestapeld in een ‘bottom-up’ benadering.
Om compatibel te zijn met extrusiebioprinting, moet de op hydrogel gebaseerde bioink/biomateriaalinkt thixotrope (afschuifverdunning) eigenschappen bezitten, waarbij de samenstellende hydrogelpolymeren van de bioink/biomateriaalinkt als een vloeistof door een microkanaalmondstuk stromen wanneer ze worden blootgesteld aan schuifspanning, maar terugkeren naar een viskeuze, gelachtige toestand bij verwijdering van de schuifspanning15 . Vanwege hun hoge watergehalte moeten de polymeren van op hydrogel gebaseerde bioinks / biomateriaalinkten fysiek of covalent worden verknoopt om de architectuur en structurele integriteit van de 3D-biogeprinte structuur te behouden. In het geval van celbeladen bioinks worden de cellen direct blootgesteld aan chemische spanningen tijdens het crosslinking-proces. Het proces van het extruderen van cellen ingekapseld in de bioink hydrogel matrix onderwerpt de cellen ook aan schuifspanning, wat kan leiden tot verminderde levensvatbaarheid en / of celdood. Zodra het 3D-weefselmodel is gebioprint, is het moeilijk om onderscheid te maken tussen de niveaus van cytotoxiciteit die worden opgewekt door de hydrogelmatrix zelf en de extrusie- en crosslinkingprocessen, respectievelijk. Dit is met name een uitdaging in de context van 3D-steigers waar de cellen vooraf zijn ingebed in de hydrogelmatrix, waardoor het moeilijk wordt om de cellen te verwijderen voor latere analyses, wat schadelijk zou zijn voor de levensvatbaarheid van mestcellen.
Een zachtere benadering van het genereren van 3D-weefselconstructies die mestcellen bevatten, omvat het zaaien van de cellen in voorgedrukte, poreuze biomateriaalinkt 3D-steigers uit een celcultuursuspensie, die gebruik maakt van het aangeboren vermogen van mestcellen om van de circulatie naar perifere weefsels te migreren. De voordelen van deze celzaaibenadering zijn tweeledig: (i) de mestcellen worden niet onderworpen aan afschuiving en chemische spanningen van respectievelijk de extrusie- en crosslinkingprocessen, en (ii) de cellen kunnen gemakkelijk uit de 3D-steiger worden verwijderd na blootstelling door zacht wassen voor analyse zonder hun levensvatbaarheid nadelig te beïnvloeden. Het extra voordeel van het zaaien en analyseren van de levensvatbaarheid van cellen op 3D-biogeprinte, poreuze hydrogel-steigers in tegenstelling tot 2D-hydrogelschijven is dat de 3D-biogeprinte hydrogelsteigers de topografische kenmerken op microschaal van in vivo weefsels, die niet in bulk aanwezig zijn, 2D-planaire hydrogelschijven recapituleren. Deze aanpak is een geschikte, snelle en kosteneffectieve aanpak om de potentieel catastrofale cytotoxische effecten van kandidaat-bioink hydrogelmatrices op mestcellen en andere immunologische cellen te bepalen voorafgaand aan investeringen in dure 3D-weefselmanipulatie-experimenten.
Protocol
Representative Results
Discussion
De fabricage van 3D-biomimetische weefsels vereist de succesvolle samensmelting van de bioink, die componenten van de extracellulaire matrix nabootst, met de cellulaire component (en) om fysiologische analogen van in vivo weefsels te creëren. Dit vereist het gebruik van primaire cellen, en niet getransformeerde cellen, bij het fabriceren van fysiologische biomimetische weefsels. Primaire immunologische cellen, zoals mestcellen, zijn echter bijzonder gevoelig voor cytotoxische effecten en fenotypische veranderin…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We bedanken Alberta Innovates voor het leveren van de CNC en Ken Harris en Jae-Young Cho voor hun technisch advies bij het voorbereiden van de CNC / agarose / D-mannitol matrix. We bedanken ook Ben Hoffman, Heather Winchell en Nicole Diamantides voor hun technisch advies en ondersteuning bij de installatie en kalibratie van de INKREDIBLE+ 3D bioprinter.
Materials
| A | |||
| Acetic Acid (glacial) | Sigma Aldrich | AX0074-6 | |
| Agarose (OmniPur) | EMD Millipore Corporation | 2125-500GM | |
| Armenian Hamster IgG Isotype Control, APC (Clone: eBio299Arm) | Thermo Fisher Scientific | 17-4888-82 | |
| B | |||
| b-Mercaptoethanol | Fisher Scientific | O3446I-100 | |
| b-Nicotinamide adenine dinucleotide sodium salt (NAD) | Sigma Aldrich | N0632-5G | |
| BD 5 mL Syringe (Luer-Lok Tip) | BD | 309646 | |
| BD PrecisionGlide Needle 26G x 1/2 in | BD | 305111 | |
| BioLite 24 Well Multidish | Thermo Fisher Scientific | 930-186 | |
| BioLite 96 Well Multidish | Thermo Fisher Scientific | 130-188 | |
| BioLite 175 cm2 Flask Vented | Thermo Fisher Scientific | 130-191 | |
| Biosafety Cabinet Class II | Microzone Corp., Canada | BK-2-6-B3 | |
| BSA, Fraction V (OmniPur) | EMD Millipore Corporation | 2930-100GM | |
| C | |||
| C57BL/6 mice | The Jackson Laboratory | 000664 | |
| CD117 (c-Kit) Monoclonal Antibody, PE (Clone: 2B8) | Thermo Fisher Scientific | 12-1171-82 | |
| CELLINK BIOINK (3 x 3 mL Cartridge) | CELLINK LLC | IK1020000303 | |
| CELLINK CaCl2 Crosslinking Agent – Sterile Bottle 1 x 60 mL | CELLINK LLC | CL1010006001 | |
| CELLINK Empty Cartridges 3cc with End and Tip Caps | CELLINK LLC | CSC0103000102 | |
| CELLINK HeartWare for PC | CELLINK LLC | Version 2.4.1 | |
| CELLINK INKREDIBLE+ 3D BIOPRINTER | CELLINK LLC | S-10003-001 | |
| CELLINK Sterile Standard Conical Bioprinting Nozzles 22G | CELLINK LLC | NZ4220005001 | |
| CELLINK Sterile Standard Conical Bioprinting Nozzles 25G | CELLINK LLC | NZ4250005001 | |
| CELLINK Sterile Standard Conical Bioprinting Nozzles 27G | CELLINK LLC | NZ4270005001 | |
| Cell Proliferation Kit II (XTT) (Roche) | Sigma Aldrich | 11465015001 | |
| Centrifuge (Benchtop) | Eppendorf | 5804R | |
| Corning Costar 96 Well Clear Flat-Bottom Non-Treated PS Microplate | Sigma Aldrich | CLS3370 | |
| CO2 Incubator | Binder GmbH, Germany | 9040-0113 | |
| CytoFLEX Flow Cytometer | Beckman Coulter | A00-1-1102 | |
| D | |||
| D-mannitol (MilliporeSigma Calbiochem) | Fisher Scientific | 44-390-7100GM | |
| F | |||
| Falcon 15 mL Polystyrene Conical Tubes, Sterile | Corning | 352095 | |
| Falcon 50 mL Polystyrene Conical Tubes, Sterile | Corning | 352070 | |
| FceR1 alpha Monoclonal Antibody, APC (Clone: MAR-1) | Thermo Fisher Scientific | 17-5898-82 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS), qualified, heat inactivated | Thermo Fisher Scientific | 12484028 | |
| FlowJo Software | Becton Dickinson & Co. USA | Version 10.6.2 | |
| G | |||
| GraphPad Prism | GraphPad Software, LLC | Version 8.4.3 | |
| H | |||
| Hemacytometer (Improved Neubauer 0.1 mmm deep levy) | VWR | 15170-208 | |
| HEPES Sodium Salt | Fisher Scientific | BP410-500 | |
| I | |||
| Iodonitrotetrazolium chloride (INT) | Sigma Aldrich | I10406-5G | |
| L | |||
| L-Glutamine 200 mM (Gibco) | Thermo Fisher Scientific | 25030-081 | |
| Lithium L-lactate | Sigma Aldrich | L2250-100G | |
| M | |||
| MEM Non-Essential Amino Acids 100 mL 100x (Gibco) | Thermo Fisher Scientific | 11140-050 | |
| 1-Methoxy-5-methylphenazinium methyl sulfate (MPMS) | Sigma Aldrich | M8640 | |
| Microtubes (1.7 mL clear) | Axygen | MCT-175-C | |
| Microtubes (2.0 mL clear) | Axygen | MCT-200-C | |
| MilliQ Academic (for producing MilliQ ultrapure water) | Millipore | ZMQS60001 | |
| N | |||
| Nalgene Rapid-Flow 90 mm Filter Unit (0.2 mm Pore size, 500 mL) | Thermo Fisher Scientific | 566-0020 | |
| Nalgene Syringe filter (0.2 mm PES, 25 mm) | Thermo Fisher Scientific | 725-2520 | |
| P | |||
| Penicillin Streptomycin 100 mL (Gibco) | Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | |
| PBS pH 7.4, No Calcium/Magnesium, 500 mL (Gibco) | Thermo Fisher Scientific | 10010-023 | |
| Propidium iodide, 1.0 mg/mL (Invitrogen) | Thermo Fisher Scientific | P3566 | |
| R | |||
| Rat IgG2b kappa Isotype Control, PE (Clone: eB149/10H5) | Thermo Fisher Scientific | 12-4031-82 | |
| Recombinant Murine IL-3 | PeproTech, Inc. | 213-13 | |
| RPMI-1640 Medium 1X + 2.05 mM L-Glutamine (HyClone) | GE Healthcare | SH30027.01 | |
| S | |||
| Sarstedt 96 well round base PS transparent micro test plate (82.1582.001) | Fisher Scientific | NC9913213 | |
| Sodium Azide, 500 g | Fisher Scientific | BP922I-500 | |
| Sodium Pyruvate (100 mM) 100X (Gibco) | Thermo Fisher Scientific | 11360-070 | |
| T | |||
| Tris Base (2-amino-2(hydroxymethyl)-1,3-propanediol) | Sigma Aldrich | 252859 | |
| Trypan Blue solution (0.4%, for microscopy) | Sigma Aldrich | 93595 | |
| V | |||
| VARIOSKAN LUX Microplate Spectrophotometer (Type: 3020) | Thermo Fisher Scientific | VLBL00D0 |
References
- Tibbitt, M. W., Anseth, K. S. Hydrogels as extracellular matrix mimics for 3D cell culture. Biotechnology and Bioengineering. 103 (4), 655-663 (2009).
- Drury, J. L., Mooney, D. J. Hydrogels for tissue engineering: Scaffold design variables and applications. Biomaterials. 24 (24), 4337-4351 (2003).
- Lee, K. Y., Mooney, D. J. Hydrogels for tissue engineering. Chemical Reviews. 101 (7), 1869-1879 (2001).
- Halib, N., Ahmad, I. Nanocellulose: Insight into health and medical applications. Handbook of Ecomaterials. , 1345-1363 (2019).
- Alonso-Lerma, B., et al. High performance crystalline nanocellulose using an ancestral endoglucanase. Communications Materials. 1 (1), 57 (2020).
- Tummala, G. K., Lopes, V. R., Mihranyan, A., Ferraz, N. Biocompatibility of nanocellulose-reinforced PVA hydrogel with human corneal epithelial cells for ophthalmic applications. Journal of Functional Biomaterials. 10 (3), 35 (2019).
- Fey, C., et al. Bacterial nanocellulose as novel carrier for intestinal epithelial cells in drug delivery studies. Materials Science and Engineering: C. 109, 110613 (2020).
- Ojansivu, M., et al. Wood-based nanocellulose and bioactive glass modified gelatin-alginate bioinks for 3D bioprinting of bone cells. Biofabrication. 11 (3), 035010 (2019).
- Jonsson, M., et al. Neuronal networks on nanocellulose scaffolds. Tissue Engineering Part C: Methods. 21 (11), 1162-1170 (2015).
- Samulin Erdem, J., et al. Cellulose nanocrystals modulate alveolar macrophage phenotype and phagocytic function. Biomaterials. 203, 31-42 (2019).
- Menas, A. L., et al. Fibrillar vs crystalline nanocellulose pulmonary epithelial cell responses: Cytotoxicity or inflammation. Chemosphere. 171, 671-680 (2017).
- Halova, I., Draberova, L., Draber, P. Mast cell chemotaxis chemoattractants and signaling pathways. Frontiers in Immunology. 3, 1-19 (2012).
- Groll, J., et al. A definition of bioinks and their distinction from biomaterial inks. Biofabrication. 11 (1), 013001 (2019).
- Schwab, A., et al. Printability and shape fidelity of bioinks in 3D bioprinting. Chemical Reviews. 120 (19), 11028-11055 (2020).
- Jungst, T., Smolan, W., Schacht, K., Scheibel, T., Groll, J. Strategies and molecular design criteria for 3D printable hydrogels. Chemical reviews. 116 (3), 1496-1539 (2016).
- Sasaki, D. T., Dumas, S. E., Engleman, E. G. Discrimination of viable and non-viable cells using propidium iodide in two color immunofluorescence. Cytometry. 8 (4), 413-420 (1987).
- Usov, I., et al. Understanding nanocellulose chirality and structure-properties relationship at the single fibril level. Nature Communications. 6 (1), 7564 (2015).
