Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

تصنيع بلوري Nanocellulose جزءا لا يتجزأ من الحبر Agarose المواد الحيوية لثقافة الخلايا الصاري نخاع العظام المستمدة

Published: May 11, 2021 doi: 10.3791/62519
Automatic Translation
1, 1, 1, 1,2
1Nanotechnology Research Center, National Research Council Canada, 2Department of Medical Microbiology and Immunology, University of Alberta

Summary

يسلط هذا البروتوكول الضوء على طريقة لتقييم التوافق البيولوجي بسرعة للخلايا النانوية البلورية (CNC) / agarose المركبة هيدروجيل الحبر المواد الحيوية مع خلايا الصاري نخاع العظم الماوس المستمدة من حيث صلاحية الخلية والتعبير الظاهري لمستقبلات سطح الخلية، كيت (CD117) ومستقبلات IgE عالية التقارب (FcεRI).

Abstract

تستخدم الطباعة الحيوية ثلاثية الأبعاد (ثلاثية الأبعاد) المركبات القائمة على الهيدروجيل (أو أحبار المواد الحيوية) التي يتم إيداعها في نمط ، مما يشكل ركيزة تودع عليها الخلايا. لأن العديد من الأحبار المواد الحيوية يمكن أن تكون سامة للخلايا الأولية، فمن الضروري تحديد التوافق البيولوجي لهذه المركبات هيدروجيل قبل استخدامها في عمليات هندسة الأنسجة 3D مكلفة. تتطلب بعض طرق الثقافة ثلاثية الأبعاد، بما في ذلك الطباعة الحيوية، أن يتم تضمين الخلايا في مصفوفة ثلاثية الأبعاد، مما يجعل من الصعب استخراج الخلايا وتحليلها للتغيرات في القدرة على البقاء والتعبير عن العلامات الحيوية دون إحداث ضرر ميكانيكي. يصف هذا البروتوكول بأنه دليل على المفهوم ، وهو طريقة لتقييم التوافق البيولوجي للخلايا النانوية البلورية (CNC) المدمجة مركب agarose ، ملفقة في نظام ثقافة 24 بئرا ، مع خلايا سارية مشتقة من نخاع العظم الماوس (BMMCs) باستخدام المقايسات الخلوية التدفق لرواية الخلية والتعبير عن العلامة الحيوية.

بعد 18 ساعة من التعرض لمصفوفة CNC /agarose/D-mannitol ، لم تتغير قابلية BMMC للحياة كما تقاس نفاذية يوديد البروبيديوم (PI). ومع ذلك، BMMCs مثقف على CNC/agarose/D-مانيتول الركيزة يبدو أن زيادة طفيفة في التعبير عن مستقبلات IgE عالية التقارب (FcεRI) ومستقبلات عامل الخلايا الجذعية (كيت؛ CD117) ، على الرغم من أن هذا لا يبدو أن تعتمد على كمية CNC في مركب bioink. كما تم تقييم صلاحية BMMCs بعد التعرض لدورة زمنية لسقالات الهيدروجيل التي تم تصنيعها من حبر المواد الحيوية التجارية المكونة من نانوسليلوز الرجفان (FNC) وألجينات الصوديوم باستخدام طابعة بيولوجية قذف ثلاثية الأبعاد. على مدى فترة 6-48 ساعة، لم تؤثر ركائز FNC/alginate سلبا على صلاحية BMMCs كما يحددها قياس التدفق الخلوي ومقايسات الميكروتتر (XTT وdhydrogenase اللاكتات). يصف هذا البروتوكول طريقة فعالة لفحص التوافق الكيميائي الحيوي للحبر الحيوية المرشحة بسرعة لفائدة سقالات ثلاثية الأبعاد للبذر بعد الطباعة مع الخلايا الصارية.

Introduction

وقد ركز الاهتمام الأخير في نظم الثقافة ثلاثية الأبعاد والطباعة الحيوية ثلاثية الأبعاد الاهتمام على الهيدروجيلات ومركبات الهيدروجيل. هذه المركبات بمثابة اللزوجة بعد المحاكاة الحيوية المسامية ويمكن أن تتكون من ما يصل إلى 99٪ محتوى المياه من حيث الوزن، وهو ما يماثل الأنسجة البيولوجية1،2،3. هذه السمات من مركبات هيدروجيل وبالتالي تسمح لنمو الخلايا دون التأثير على قدرتها على البقاء ووظيفتها. واحد من هذه المركبة هو نانوسليلوز البلورية (CNC)، والتي تم استخدامها كمادة تعزيز في مركبات الهيدروجيل، سقالات الخلية في تطوير يزرع المواد الحيوية، وفي ثنائي الأبعاد (2D) و 3D في ثقافة الخلايا المختبرية4،5. بالنسبة للجزء الأكبر، المصفوفات المكونة من CNC ليست سامة للخلايا الخلوية علنا إلى الخلايا الظهارية القرنية البشرية6، الخلايا الظهارية المعوية7، الخلايا الجذعية المشتقة من نخاع العظم البشري8، أو الخلايا العصبية الشبيهة9. ومع ذلك ، فإن النشاط الأيضي وانتشار الخلايا الجذعية المتوسطة المشتقة من نخاع العظم البشري يقلل من الارتباط مع زيادة لزوجة مركبات الخلايا النانوية القائمة على الخشب ، مما يشير إلى أنه يجب اختبار تكوين المصفوفة بعناية لآثارها الضارة على وظائف الخلية8.

وبالمثل ، يمكن أن تحفز CNC الاستجابات الالتهابية في الضامة عند الاستيعاب ، والتي يمكن أن يكون لها عواقب وخيمة في أنظمة زراعة الخلايا المناعية ثلاثية الأبعاد10،11. في الواقع ، هناك القليل جدا من البيانات المتاحة حول كيفية تأثير CNC على استجابات الخلايا المناعية الأخرى ، وخاصة الاستجابات الالتهابية التحسسية التي تبدأها الخلايا السارية. الخلايا الصارية هي الكريات البيض الحبيبية التي تعبر عن مستقبلات IgE عالية التقارب ، FceRI ، المسؤولة عن تنشيط الاستجابات الالتهابية لمسببات الحساسية. انتشارها والتمايز تعتمد على عامل الخلايا الجذعية (SCF), الذي يربط مستقبلات التيروزين, كيت. الخلايا الصاري مشتقة من خلايا السلف نخاع العظم التي تدخل الدورة الدموية وتهاجر بعد ذلك هامشيا لتفريق في كل مكان في جميع الأنسجة البشرية12. كما تعمل الخلايا الصاري في بيئة الأنسجة 3D، فهي مرشح مثالي للخلايا المناعية لدراسة العمليات المناعية في نماذج الأنسجة ثلاثية الأبعاد في المختبر . ومع ذلك، حتى الآن، لا يوجد نموذج الأنسجة ثلاثية الأبعاد قابلة للحياة في المختبر التي تحتوي على خلايا سارية.

نظرا للطبيعة الحساسة للغاية للخلايا الصاري وميلها إلى الحصول على استجابات مؤيدة للالتهابات للمحفزات الخارجية ، يلزم النظر بعناية في مكونات المصفوفة ثلاثية الأبعاد وطريقة الطباعة الحيوية لإدخال الخلايا السارية في السقالة ثلاثية الأبعاد ، كما نوقش أكثر. يمكن تصنيع الأنسجة من فئتين واسعتين من المواد الحيوية ، أي الدينك الحيوي وحبر المواد الحيوية. ويكمن التمييز في حقيقة أن المركبات البيولوجية هي مركبات هيدروجيل محملة بالخلايا، في حين أن أحبار المواد الحيوية هي مركبات هيدروجيل خالية من الخلايا، على النحو المحدد من قبل Groll et al.13,14. وبالتالي، تحتوي البنى ثلاثية الأبعاد المطبوعة بالأنك الحيوي على خلايا مضمنة مسبقا داخل مصفوفة الهيدروجيل، في حين أن البنى ثلاثية الأبعاد المطبوعة بحبر المواد الحيوية تحتاج إلى بذر بخلايا بعد الطباعة. يتم إجراء التصنيع الحيوي لسقالات الثقافة من الأحبار الحيوية / الأحبار الحيوية القائمة على الهيدروجيل بشكل شائع باستخدام الطابعات الحيوية ثلاثية الأبعاد البثق ، والتي تبرز حبر bioink / biomaterial من خلال فوهة صغيرة تحت الضغط إما عن طريق المكبس الهوائي أو الميكانيكي. تقوم الطابعات الحيوية البثق بتصنيع سقالات ثلاثية الأبعاد عن طريق إيداع المنك الحيوي في أنماط مقطعية ثنائية الأبعاد مكدسة بشكل متسلسل على بعضها البعض في نهج "من أسفل إلى أعلى".

لتكون متوافقة مع الطباعة الحيوية البثق، يجب أن يكون الحبر bioink/biomaterial القائم على الهيدروجيل تمتلك خصائص التكستروبيك (القص رقيق)، حيث البوليمرات هيدروجيل المكونة للتدفق الحبر bioink / المواد الحيوية مثل السائل من خلال فوهة القنوات الدقيقة عندما تتعرض لضغوط القص، ولكن العودة إلى حالة لزجة، هلام مثل عند إزالة الإجهاد القص15 . نظرا لارتفاع محتوى المياه ، يجب ربط البوليمرات من الأحبار الحيوية / المواد الحيوية القائمة على الهيدروجيل ، إما ماديا أو مكافئا ، للحفاظ على الهندسة المعمارية والسلامة الهيكلية للبنية المطبوعة بيولوجيا ثلاثية الأبعاد. في حالة الخلايا المحملة bioinks ، تتعرض الخلايا مباشرة لضغوط كيميائية خلال عملية الربط. عملية الخلايا البثق مغلفة داخل مصفوفة هيدروجيل bioink يخضع أيضا الخلايا لإجهاد القص، والتي يمكن أن تؤدي إلى انخفاض القدرة على البقاء و / أو موت الخلية. وبمجرد طباعة نموذج الأنسجة ثلاثية الأبعاد بيولوجيا، من الصعب التمييز بين مستويات السمية الخلوية التي تثيرها مصفوفة الهيدروجيل نفسها وعمليات البثق والربط المتبادل، على التوالي. وهذا يشكل تحديا خاصا في سياق السقالات ثلاثية الأبعاد حيث تكون الخلايا مضمنة مسبقا داخل مصفوفة الهيدروجيل، مما يجعل من الصعب إزالة الخلايا لإجراء تحليلات لاحقة، مما سيضر بقابلية الخلايا الصارية للحياة.

نهج ألطف لتوليد الأنسجة ثلاثية الأبعاد يبني تحتوي على الخلايا الصاري ينطوي على بذر الخلايا في المطبوعة مسبقا، والسقالات الحبر المواد الحيوية المسامية 3D من تعليق ثقافة الخلية، مما يعزز القدرة الفطرية للخلايا الصاري للهجرة من الدورة الدموية إلى الأنسجة الطرفية. فوائد هذا النهج البذر الخلية هي ذات شقين: (1) لا تخضع الخلايا الصاري للقص والضغوط الكيميائية من عمليات البثق والربط المتبادل، على التوالي، و (2) يمكن إزالة الخلايا بسهولة من سقالة 3D بعد التعرض عن طريق غسل لطيف للتحليل دون التأثير سلبا على قدرتها على البقاء. الفائدة الإضافية من البذر وتحليل صلاحية الخلية من الخلايا الصاري على 3D المطبوعة بيولوجيا، والسقالات هيدروجيل مسامية بدلا من أقراص هيدروجيل 2D هو أن السقالات هيدروجيل المطبوعة بيولوجيا 3D تلخص السمات الطوبوغرافية microscale في الأنسجة الحية ، والتي ليست موجودة بكميات كبيرة، 2D أقراص هيدروجيل مخطط. هذا النهج هو نهج مناسب وسريع وفعال من حيث التكلفة لتحديد الآثار السامة للخلايا الكارثية المحتملة لمصفوفات هيدروجيل البيونك المرشحة على الخلايا الصارية ، وكذلك الخلايا المناعية الأخرى ، قبل الاستثمار في التجارب الهندسية مكلفة الأنسجة ثلاثية الأبعاد.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

ملاحظة: يتكون هذا البروتوكول من خمسة أقسام: (1) عزل نخاع عظم الفأر وتمايز الخلايا الصاري المشتقة من نخاع العظم الماوس (BMMCs)، (2) تلفيق CNC/agarose/D-mannitol هيدروجيل الركائز في نظام 24 جيدا وثقافة BMMCs على الركائز، (3) إزالة BMMCs من CNC / agarose / D - mannitol هيدروجيل الركائز وتحليل الجدوى والتعبير العلامات الحيوية باستخدام قياس التدفق الخلوي ، (4) الطباعة الحيوية ثلاثية الأبعاد لسقالات الهيدروجيل من الخلايا النانوية الليفية المتاحة تجاريا (FNC) / حبر المادة الحيوية المركبة الألجينات الصوديوم ، و (5) ثقافة BMMCs على سقالات هيدروجيل alginate FNC / الصوديوم وتحليل الجدوى باستخدام قياس التدفق الخلوي ، XTT ، وdhydrogenase اللاكتات (LDH) المقايسات microtrogenase (LDH).

1. جيل ثقافة BMMC

ملاحظة: تم قتل الفئران عن طريق اختناق ثاني أكسيد الكربون بعد تخدير الأيزوفلوران. تم عزل الساق وعظم الفخذ، وتم حصاد نخاع العظم كله. أجريت جميع الدراسات الحيوانية وفقا للمبادئ التوجيهية والسياسات الخاصة برعاية الحيوان التابعة للمجلس الكندي، بموافقة لجنة العلوم الصحية لرعاية الحيوان واستخدامه في جامعة ألبرتا.

  1. إعداد كامل RPMI-1640 ثقافة المتوسطة بإضافة المكملات المدرجة في الجدول 1 إلى التركيزات النهائية المشار إليها. ضبط درجة الحموضة من المتوسط إلى 7.4-7.6 باستخدام NaOH، تصفية تعقيم باستخدام استخدام واحد، زجاجة أعلى مرشح (0.2 ميكرومتر حجم المسام)، وتخزينها في 4 درجة مئوية في الظلام لمدة تصل إلى 2 أشهر.
  2. الحصول على عظم الفخذ من الفئران وفقا لبروتوكولات وإجراءات لجنة رعاية الحيوان في الجامعة المحلية.
    ملاحظة: في هذه الدراسة، تم عزل عظم الفخذ من الفئران C57BL/6، ولكن يمكن استخدام أي سلالة إذا كانت ذات صلة بالدراسة.
  3. باستخدام مقص، وإزالة الجلد والعضلات من مفصل الورك، ومن ثم سحب عظم الفخذ بلطف عن طريق التواء قليلا من مقبس الورك (الشكل 1). يجب الحرص على عدم قطع رأس الفخذ. قطع الساق بعيدا عن عظم الفخذ في fabella وسيطة باستخدام مقص. إزالة مخلب عن طريق قطع فقط فوق calcaneum وتجاهل.
  4. باستخدام مشرط، وإزالة الجلد والغضاريف من عظم الفخذ والساق القطع. باستخدام مقص، وجعل قطع نظيفة على كل طرف من عظم الفخذ والساق، وفضح نخاع العظام الحمراء داخل. إذا لزم الأمر، قم بإزالة الشظية عند هذه النقطة، ولكن لاحظ أنها قد تساعد في التلاعب في الساق أثناء تنظيف نخاع العظم.
  5. إعداد إبرة 26 G مع حقنة 5 مل luer قفل، وملء مع ما يقرب من 5 مل من وسائل الإعلام كاملة أعدت على النحو المبين أعلاه.
    ملاحظة: عند هذه النقطة، RPMI غير مكتملة بدون إضافات يمكن أيضا استخدامها لحفظ على الكواشف.
  6. عقد عظم الفخذ أو الساق مع ملقط، إدراج الإبرة في نهاية واحدة من العظام واضغط بلطف المحاقن. عقد العظام أكثر من 50 مل أنبوب مخروطي معقم، وحقن بلطف ما يقرب من 5 مل من المتوسطة في العظام، وتطبيق بعض الضغط. مراقبة قطعة من نخاع العظام تسقط الطرف الآخر من العظام وشرائط حمراء رقيقة وفي أنبوب مخروطي.
  7. تدور أسفل أسبيراتس وإعادة الإنفاق في وسط كامل، أو نقل مباشرة إلى قارورة زراعة الأنسجة العقيمة T175 سم2 التي تحتوي على 50 مل من RPMI-1640 المتوسطة كاملة. الحفاظ على أسبيراتس في المتوسط RPMI-1640 كاملة مع 30 نانوغرام / مل فأرة إنترلوكين المؤتلف (IL)-3.
  8. بعد يوم واحد، مراقبة الثقافات تحت المجهر الخفيف. وسوف تتكون الثقافة من مجموعة غير متجانسة من الخلايا ذات الأشكال والأحجام المختلفة وحتى قطع أكبر من نخاع العظام. تغذية ثقافات الخلية بإضافة 15 مل من المتوسط الطازج كل 3-5 أيام باستخدام المتوسطة RPMI-1640 كاملة كما هو موضح أعلاه، وضمان كثافة الخلية لا يتجاوز أبدا 1 × 106 خلايا / مل. مرة واحدة في الأسبوع، تدور أسفل الخلايا في 200 × غرام لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة، وإعادة الإنفاق في RPMI-1640 المتوسطة كاملة جديدة، وتقسيم 1:4 إلى 50 مل من المتوسطة في قوارير T175 الطازجة.
  9. بعد 4 أسابيع، حدد نقاء الخلية عن طريق قياس التعبير السطحي لمستقبلات CD117 (Kit) و FceRI حسب قياس التدفق الخلوي كما هو موضح أدناه (القسم 3.2).
    ملاحظة: بعد 4 أسابيع، يجب أن تكون 99٪ من الخلايا إيجابية مزدوجة ل CD117 (كيت) و FcεRI.
  10. في 4 أسابيع وما بعدها، والحفاظ على BMMCs مع 20 نانوغرام / مل من IL-3 في المتوسط RPMI-1640 كاملة. في حوالي 6 أسابيع، ستتوقف الخلايا عن الانقسام ولن تحتاج بعد الآن إلى تقسيم. تغذية الثقافات كل 3-5 أيام، بيليه الخلايا عن طريق الطرد المركزي مرة واحدة في الأسبوع، وإعادة الإنفاق في RPMI-1640 المتوسطة كاملة جديدة.

2. تصنيع CNC / agarose / D - مانيتول هيدروجيل الركائز والثقافة BMMC

  1. في زجاجة، أضف 0.2 غرام من مسحوق الآغاروز إلى المالحة العازلة بالفوسفات (PBS) (2٪ ث/v) إلى حجم نهائي قدره 10 مل، ويغلي لمدة دقيقة واحدة عند 100 درجة مئوية ليذوب.
  2. حل 2.5 غرام من مسحوق CNC في برنامج تلفزيوني إلى حجم نهائي من 10 مل لإعداد خليط 25٪ ث / الخامس.
  3. حل 2 غرام من مسحوق CNC في برنامج تلفزيوني إلى حجم نهائي من 10 مل لإعداد خليط 20٪ ث / الخامس، وتمييع تسلسلي 20٪ ث / الخامس خليط لإعداد 10، 5، و 2٪ ث / v CNC الخلائط.
  4. سخني خلائط 25 و20 و10 و5 و2٪ ث/v CNC إلى 37 درجة مئوية لمدة 10 دقائق (الشكل 2A).
  5. إضافة 0.46 غرام من D-مانيتول إلى محلول الآغاروز الساخن (4.6٪ ث / v) وتذوب.
  6. مزيج قبل تسخينها 25, 20, 10, 5 و 2٪ ث / v CNC-PBS الخلائط مع محلول الآغاروز الساخن / D-مانيتول في أنابيب مخروطية منفصلة في نسبة 1:1 إلى إنتاج تركيزات CNC النهائي من 12.5, 10, 5, 2.5, و 1٪ ث / الخامس في مخاليط الهيدروجيل.
  7. العمل بسرعة، إضافة 500 ميكرولتر / بئر من الحلول المذكورة أعلاه أعدت في الخطوة 2.6 في أربعة أضعاف إلى لوحة ثقافة 24 جيدا، والسماح للوقوف لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة لتسهيل البلمرة (الشكل 2B).
  8. طبقة بعناية 1000 ميكرولتر من تعليق BMMC في كثافة 1.1 × 106 خلايا / مل على رأس الركائز الهيدروجيل مع micropipettor، وتجنب لمس هلام مع غيض من ماصة لأن هذا سوف يضر سطح هلام وتوليد الجسيمات.
  9. احتضان BMMCs على ركائز الهيدروجيل في حاضنة معقمة (5٪ CO2، الغلاف الجوي المرطب) عند 37 درجة مئوية لمدة 18 ساعة.

3. تحليل التدفق الخلوي

  1. تحليل التدفق الخلوي لقابلية BMMC للحياة عن طريق استبعاد PI
    1. إزالة بعناية المتوسطة الثقافة التي تحتوي على BMMCs من أعلى CNC / agarose / D - mannitol ، وتجنب هلام ، ونقل الخلايا إلى أنبوب الميكروفون 1.5 مل.
    2. غسل BMMCs مرتين مع برنامج تلفزيوني (درجة الحموضة 7.4) التي تحتوي على 0.5٪ ث / الخامس ألبوم مصل البقر في 300 × غرام لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة، وإعادة الإنفاق في 180 ميكروغرام من PBS-0.5٪ ث / v BSA إلى كثافة نهائية من 1.5 × 106 خلايا / مل. نقل الخلايا إلى 96 جيدا جولة أسفل لوحة.
      ملاحظة: تصفية تعقيم جميع PBS-0.5٪ ث / v حلول BSA مرتين باستخدام 0.2 ميكرومتر مسام الحجم مرشح حقنة, وتخزينها في 4 °C.
    3. إضافة 20 ميكرولتر من PBS-0.5٪ ث / v BSA، أو 10x PI (100 ميكروغرام / مل) أعدت في PBS-0.5٪ ث / الخامس جيش الشعب الصيني، إلى الخلايا إلى تركيز نهائي من 10 ميكروغرام / مل، واحتضان إما 1 ساعة في 4 درجة مئوية أو 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة في الظلام. الحصول على بيانات الفلورسينس باستخدام مقياس تدفق الخلايا المجهزة ليزر أيون الأرجون (488-514 نانومتر) ومرشح بانديباس لتمكين الكشف عن انبعاث مضان في 578 نانومتر. الحصول على 20000 حدث لكل عينة بمعدل تدفق 30 ميكرولتر / دقيقة في درجة حرارة الغرفة. تحليل البيانات كما هو موضح أدناه (الأقسام 3.2.7-3.2.10).
  2. تحليل التدفق الخلوي ل BMMCs لل Kit (CD117) وتعبير مستقبلات سطح FcεRI
    1. إزالة بعناية المتوسطة الثقافة التي تحتوي على BMMCs من أعلى CNC / agarose / D - mannitol ، وتجنب هلام ، ونقل الخلايا إلى أنبوب الميكروفون 1.5 مل.
    2. غسل BMMCs مرتين مع PBS-0.5٪ BSA المصفاة في 300 × غرام لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة، وإعادة الإنفاق في 180 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني يحتوي على 0.5٪ ث / الخامس BSA (1.5 × 106 خلية / مل). نقل الخلايا التي أعيد إنفاقها إلى لوحة مستديرة القاع 96 جيدا.
    3. إضافة 20 ميكرولتر من حلول عمل الأجسام المضادة 10x إلى الخلايا لتحقيق تركيز نهائي من 0.06 ميكروغرام / مل من CD117 (ج كيت) - فيكوريثرين (PE) و 0.06 ميكروغرام / مل من FcεRIα-allophycocyanin (APC) ، على التوالي.
      ملاحظة: يجب إعداد حلول عمل الأجسام المضادة 10x في برنامج تلفزيوني معقم بتصفية-0.5٪ ث/v BSA.
    4. إضافة 20 ميكرولتر من حلول التحكم 10x isotype التي تحتوي على إما الفئران IgG2b κ isotype control-PE أو الهامستر الأرمني IgG isotype control-APC لفصل الآبار التي تحتوي على خلايا لم تلطخ بأي من الأجسام المضادة الفلورية المقترنة في الخطوة 3.2.3.
      ملاحظة: عناصر التحكم isotype، الجرذ IgG2b κ isotype التحكم PE والأرمن الهامستر IgG isotype التحكم-APC تعمل على التحكم في مرفق غير محددة من الأجسام المضادة إلى BMMC. وبما أن مركبات BMMCs لا تعبر عن مستويات عالية من FcR ، فنادرا ما يتم اكتشاف مضان خلفية عالية مع أجسام مضادة للتحكم متساوية النوع. إعداد حلول التحكم في 10x isotype العمل في تصفية تعقيم PBS-0.5٪ ث / v BSA.
    5. احتضان لوحة 96 جيدا الجولة القاع لمدة 1 ساعة في 4 درجة مئوية في الظلام.
    6. غسل الخلايا بإضافة 200 ميكرولتر من جديد PBS-0.5٪ ث / v BSA العازلة لكل بئر, والطرد المركزي في 300 × غرام لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. كرر خطوة الغسيل مرة أخرى. إزالة supernatant بعناية دون لمس بيليه الخلية; ترك وراءها بعض supernatant لضمان أن بيليه الخلية لا يزال دون عائق.
    7. بعد الغسيل، إعادة تأمين الخلايا في 100 ميكرولتر من 0.5٪ ث / v BSA، 0.05٪ ث / الخامس azide الصوديوم في برنامج تلفزيوني (درجة الحموضة 7.4) التي تم تصفيتها معقمة مرتين مع مرشح حقنة 0.2 ميكرومتر المسام الحجم. الحصول على بيانات الفلورسينس في قنوات الكشف PE و APC باستخدام مقياس تدفق الخلايا، كما هو موضح أعلاه في الخطوة 3.1.3.
    8. تحليل البيانات باستخدام برامج قادرة على عرض وتحليل تدفق ملفات البيانات الخلوية مع التمديد ".fcs".
    9. ابدأ التحليل برسم مبعثر أمامي (FSC) على طول المحور x والمبعثر الجانبي (SSC) على طول المحور ص، وبوابة لمحتوى الخلية المحفوظة مع نطاق FSC من log10 1.5-5.0 ونطاق SSC من log10 0.75-3.25 في الخلايا غير المعالجة وغير الملطخة كما هو موضح في الشكل 3A(i)(ii)".
      ملاحظة: يعمل هذا على ضمان إزالة حطام الخلية ذات قيم FSC وSSC المنخفضة من التحليل. الخلايا الصارية عادة ما تكون خلايا محببة جدا (عالية SSC) وكبيرة (FSC عالية) بالمقارنة مع أنواع الخلايا المناعية الأخرى، مثل الخلايا الأحادية والخلايا الليمفاوية.
    10. بعد ذلك ، قم بتوليد مؤامرات نقطة FSC مقابل SSC وملامح المدرج التكراري للعينات غير المعالجة التي تم تلطيخها بالصبغة أو الأجسام المضادة أو عناصر التحكم متساوية النمط ، والحصول على متوسط كثافة الفلورسينس (MFI) في قنوات PE أو APC وفقا لطيف الانبعاثات الخاص بالأجسام المضادة المحددة ذات الفلوروفورية المقترنة أو الصبغة المستخدمة. تطبيق نفس المجموعة من البوابات والمعلمات لجميع عينات BMMC المحتضنة مع مختلف CNC / agarose / D - mannitol الركائز وملطخة مع الضوابط isotype المقابلة ، والأجسام المضادة ، أو صبغة ؛ الحصول على مؤسسات التمويل الأصغر.
      ملاحظة: أساسا، يجب أن تكون قطع النقاط FSC مقابل SSC من العينات الملطخة غير المعالجة لا يمكن تمييزها عن العينات غير المعالجة/غير الملطخة، التي تم الحصول عليها في الخطوة 3.2.9، لضمان عدم تغيير إجراء التلطيخ لحجم الخلية (مقاسا ب FSC) أو الحبيبية (مقاسة ب SSC) (الشكل 3A(i)(ii)).
    11. حساب متوسط مؤسسات التمويل الأصغر والخطأ القياسي في المتوسط (SEM) لكل عينة من 4 تجارب مستقلة يتبعها إنشاء رسوم بيانية باستخدام حزمة برامج التحليل الإحصائي.
    12. إعداد تراكبات المدرج التكراري في برنامج تحليل البيانات الخلوية التدفق (الشكل 3B، 4A(ii)، B(ii)).

4.3D الطباعة الحيوية لركائز الهيدروجيل الألجينات في المجلس الوطني الاتحادي/الصوديوم

ملاحظة: الطابعة الحيوية ثلاثية الأبعاد المستخدمة في هذه الدراسة هي نظام قذف هوائي مجهز برأسي طباعة مستقلين يتم التحكم في درجة حرارةهما. الحبر الحيوي المستخدمة في الطباعة الحيوية ثلاثية الأبعاد هي سقالات هيدروجيل وضعت من (أ) نانوسليلوز الرجفان رطب للغاية (FNC)، وهو مشابه شكليا للكولاجين، (ب) الصوديوم الجينات، و (ج) د-مانيتول. يتم توفيره كارت وتعليق هيدروجيل معقم في خراطيش 3 مل يمكن توصيل فوهات الطباعة الحيوية المخروطية المعقمة للوير قفل (22 أو 25 أو 27 G).

  1. استخدم هذا البروتوكول مع رؤوس الطباعة وطباعتها في درجة حرارة الغرفة، حيث درجة حرارة الغرفة 20-25 درجة مئوية.
  2. تخزين خراطيش الحبر المواد الحيوية في 4 درجة مئوية للحفاظ على استقرار مركب هيدروجيل. قبل البدء في الطباعة الحيوية ثلاثية الأبعاد، قم بإزالة خرطوشة (3 مل) من الثلاجة والسماح لها بالتوازن إلى درجة حرارة الغرفة.
  3. تركيب خرطوشة Bioink على الطابعة الحيوية INKREDIBLE + 3D
    1. قم بإزالة القبعات ذات النهاية الزرقاء من خرطوشة حبر المواد الحيوية سعة 3 مل (الشكل 5B(i))، وألصق فوهة طباعة بيولوجية مخروطية معقمة سعة 22 جم (زرقاء) إلى نهاية قفل luer لخرطوشة Bioink.
      ملاحظة: من الضروري لصق فوهة الطباعة الحيوية المخروطية المطلوبة على خرطوشة bioink قبل تثبيت الخرطوشة وتنفيذ خطوات المعايرة اللاحقة ، حيث سيؤدي عدم القيام بذلك إلى معايرة غير سليمة لمحور z للطباعة الحيوية ثلاثية الأبعاد.
    2. قم بتوصيل أنابيب إمداد ضغط الهواء ل printhead 1 (PH1، إلى اليسار) بالطرف المقابل للخرطوشة، وأدخل الخرطوشة مع فوهة الطباعة الحيوية المخروطية المرفقة في الفتحة الرأسية ل PH1 (الشكل 5A(ii)).
    3. مقعد ثابت خرطوشة في PH1 مع فوهة الطباعة الحيوية مخروطية تمتد تحت رأس الطباعة. شد المسمار على PH1 في اتجاه عقارب الساعة حتى إصبع ضيق لقفل خرطوشة Bioink في مكان. لاحظ أنه يمكن إجراء الطباعة الحيوية ثلاثية الأبعاد مع ترك PH2 فارغا.
  4. معايرة محاور x-y-z للطباعة الحيوية ثلاثية الأبعاد
    1. الطاقة على الطابعة الحيوية ثلاثية الأبعاد، وإطلاق برنامج الطباعة الحيوية على جهاز كمبيوتر متصل بالطباعة الحيوية ثلاثية الأبعاد عبر كابل USB 2.0.
    2. في البرنامج، انقر فوق الزر CONNECT لمزامنة البرنامج مع الطابعة الحيوية ثلاثية الأبعاد.
      ملاحظة: تكون المزامنة ناجحة عند تشغيل وإيقاف تشغيل أضواء الصمام الثنائي الباعث للضوء فوق البنفسجي ذات رأس الطباعة، وتقوم مروحة فلتر HEPA بإيقاف تشغيلها ومرة أخرى. يجب مزامنة البرنامج مع الطابعة الحيوية ثلاثية الأبعاد قبل توجيه محاور الطابعة الحيوية ومعايرة نقطة البداية ، كما هو موضح في الخطوات اللاحقة.
    3. لاحظ أربعة خيارات في قائمة التحكم الرئيسية للطباعة الحيوية ثلاثية الأبعاد: (1) إعداد BIOPRINT، (2) BIOPRINT، (3) قائمة المرافق، و (4) شاشة الحالة. حدد الخيار تحضير BIOPRINT ، ثم مرر لأسفل إلى وحدد خيار HOME AXES .
      ملاحظة: ثم سيقوم الطابعة الحيوية ثلاثية الأبعاد بتحريك تجميع رأس الطباعة للخلف واليسار لمعايرة المحاور ص و س، على التوالي. بعد ذلك، مع توقف رؤوس الطباعة مؤقتا في أقصى الموضع الأيسر، ستقوم الطابعة الحيوية برفع الطباعة حتى يقوم مفتاح معايرة المحور z (الموجود على المطبوعة) بالاتصال بموهية الطباعة الحيوية المخروطية المثبتة على رأس الطباعة 1
    4. بعد المعايرة الناجحة لمحاور x-y-z ، لاحظ الخفض الطفيف للطباعة ونقل رؤوس الطباعة إلى أعلى النقطة الوسطى للطباعة (الشكل 5A(i)).
  5. معايرة نقطة البداية للطباعة الحيوية للطباعة الحيوية في 24 لوحة بئر
    1. إزالة لوحة ثقافة 24 بئر معقمة من غلافها البلاستيكي المختوم ، ووضع علامة على نقطة في النقطة المركزية من D1 جيدا على الجانب السفلي من لوحة مع علامة دائمة. قم بإزالة غطاء اللوحة، وضع لوحة الثقافة ذات ال 24 بئرا على المطبوعة مع D1 جيدا الموجود في الزاوية اليسرى الأمامية من المطبوعة.
    2. في قائمة التحكم الرئيسية، حدد UTILITIES MENU ثم حدد MOVE AXIS. حرك رؤوس الطباعة بزيادات 1 مم على طول المحورين x و y حتى تكون فوهة الطباعة الحيوية المخروطية ل PH1 فوق النقطة التي تم وضع علامة عليها تحت D1 جيدا. إذا لزم الأمر، قم بضبط موضع فوهة الطباعة الحيوية المخروطية فوق النقطة عن طريق تحريك رؤوس الطباعة بزيادات 0.1 مم.
    3. سجل x-و-y-إحداثيات فوهة الطباعة الحيوية المخروطية عندما مباشرة فوق مركز D1 جيدا، كما هو مبين على شاشة لوحة التحكم للطباعة الحيوية ثلاثية الأبعاد.
      ملاحظة: في حالة الطابعة الحيوية INKREDIBLE + 3D المستخدمة هنا، تكون إحداثيات x و y كما يلي: x : -46.5 و y : -27.5. هذه الإحداثيات بمثابة نقطة انطلاق في مركز D1 جيدا للطباعة الحيوية في لوحة من 24 بئرا.
    4. بعد ذلك، ارفع الطباعة بزيادات 1 مم حتى يلمس الجزء السفلي من البئر D1 فوهة الطباعة الحيوية المخروطية المثبتة في رأس الطباعة 1 تقريبا. ضبط حركة الطباعة بزيادات 0.1 مم إذا لزم الأمر (الشكل 5A(ii)). ثم، من قائمة الأدوات المساعدة، حدد الخيار معايرة Z-AXIS ، وحدد وأكد خيار "معايرة STORE Z ".
    5. العودة إلى القائمة الرئيسية، وحدد الخيار تحضير BIOPRINT . مرر لأسفل إلى وحدد خيار CALIBRATE Z .
      ملاحظة: الطابعة الحيوية ثلاثية الأبعاد الآن خفض printbed عند تنفيذ معايرة المحور z بنجاح (الشكل 5A(iii)).
  6. تحديث ملف G-code ذو 24 لوحة بشكل جيد مع إحداثيات نقطة البداية الصحيحة
    1. افتح ملف التعليمات البرمجية الهندسية للوحات 24 جيدا (G-code) في برنامج الطابعة الحيوية (الملف التكميلي 1).
      ملاحظة: هذا الملف G-code 24-well يشفر طباعة 2-طبقة 5 × 5 × 1 مم بنيات مستقيمية في كل بئر (الشكل 5C(i)(iii)). يمكن استخدام ملفات G-code المتوفرة مع أي برنامج طباعة حيوية ثلاثي الأبعاد.
    2. لاحظ أن سطر 1 من ملف G-code يقرأ G0 X-50.0 Y-33.5 ; مركز موقف D1 جيدا. تحديث إحداثيات س ص على الخط 1 مع القيم التي تم الحصول عليها في الخطوة 4.5.3، أي، يجب الآن قراءة السطر 1 G0 X-46.5 Y-27.5 ; مركز موقف D1 جيدا. حفظ الملف تحت اسم جديد.
      ملاحظة: يعمل هذا الإجراء على معايرة ملف G-code بحيث تبدأ الطباعة في وسط بئر D1 استنادا إلى إحداثيات x,y للطباعة الحيوية ثلاثية الأبعاد المحددة المستخدمة. يمكن استخدام هذا النهج لمعايرة ملف G-code ذو 24 بئرا للطباعة باستخدام أي طابعة بيولوجية ثلاثية الأبعاد. ولأغراض هذه الدراسة، لم يطبع سوى النصف الأيسر من اللوحة ذات ال 24 بئرا، أي الآبار A1-3 وB1-3 وC1-3 وD1-3. كما يتم توفير ملف G-code منفصل يقوم بترميز طباعة بنية مستقيمية من طبقتين 5 × 5 × 1 مم في شبكة 3 × 4 (ملف إضافي 2، الشكل 5C(ii)).
  7. تعديل ضغط البثق ل Printhead 1 (PH1)
    1. تأكد من أن المضخة الهوائية متصلة بإحكام بمنفذ كمية الهواء الخلفي للطباعة الحيوية INKREDIBLE+ ثلاثية الأبعاد، ثم قم بتشغيل المضخة الهوائية.
    2. اسحب مقبض التحكم الأمامي الموجود على الجانب الأيمن من الطابعة الحيوية INKREDIBLE+ ثلاثية الأبعاد.
      ملاحظة: يقوم مقبض التحكم الأمامي بضبط الضغط للحصول على PH1، بينما يضبط مقبض التحكم الخلفي الضغط ل PH2.
    3. مراقبة مقاييس الضغط الرقمي لPH1 و PH2 تقع على الجزء الأمامي من الطابعة الحيوية كل قراءة ما يقرب من 0 كيلو باسكال. تدوير مقبض التحكم الأمامي ببطء باتجاه عقارب الساعة حتى يصل الضغط المشار إليه على المقياس الأيسر ل PH1 إلى 12 كيلو باسكال (الشكل 5A(iii)).
    4. ضع ورق نسيج مطوي أو قطعة من فيلم الختم المقاوم للماء تحت فوهة الطباعة للخرطوشة المثبتة، مع الحرص على عدم لمس فوهة الطباعة.
    5. من قائمة التحكم الرئيسية في الطابعة الحيوية ثلاثية الأبعاد، حدد إعداد BIOPRINT.
    6. انتقل إلى وحدد تشغيل PH1. لاحظ أن الحبر الحيوي يبدأ في البثق من فوهة الطباعة. إذا لزم الأمر، قم بزيادة ضغط البثق عن طريق تدوير مقبض التحكم في اتجاه عقارب الساعة حتى يتم قذف حبر المادة الحيوية في خيوط مستمرة، وتسجيل إعداد الضغط الجديد. العمل بسرعة لتجنب إهدار الحبر المواد الحيوية.
    7. حدد إيقاف تشغيل PH1 لإيقاف قذف حبر المادة الحيوية، وإزالة ورق الأنسجة أو الفيلم الذي يحتوي على حبر المواد الحيوية مقذوف من المطبوعة، وإغلاق باب الطابعة الحيوية.
      ملاحظة: الطابعة الحيوية ثلاثية الأبعاد سيتم تشغيل العرض ضغط الهواء إلى PH1 أثناء الطباعة كما هو تعليمات من قبل ملف G-code تلقائيا.
  8. الطباعة الحيوية ثلاثية الأبعاد للركائز الهيدروجيل المستقيمة في شكل لوحة من 24 بئرا
    1. من قائمة التحكم الرئيسية على الطابعة الحيوية ثلاثية الأبعاد، حدد UTILITIES MENU. انتقل إلى وحدد تعطيل SD PRINT، والتي سوف تسمح لبرنامج الطباعة الحيوية لنقل ملفات G-رمز إلى الطابعة الحيوية 3D للطباعة.
    2. انقر على زر LOAD في برنامج الطباعة الحيوية، وحدد ملف G-code المحدث ذو 24 بئرا المحفوظ في الخطوة 4.6.2.
    3. في لوحة التحكم اليمنى في البرنامج، حدد علامة التبويب معاينة الطباعة ، وانقر على زر PRINT لبدء الطباعة الحيوية في D1 جيدا.
      ملاحظة: إذا كان استخدام 3 × 4 شبكة جيدا لوحة G-رمز الملف، سوف تنتهي الطباعة الحيوية في A3 جيدا من لوحة 24-جيدا (الشكل 5C(ii)، D)، بدلا من A6 جيدا إذا تمت طباعة لوحة كاملة 24 جيدا.
    4. عند الانتهاء من الطباعة الحيوية للبنى المستقيمة ، قم بتغطية اللوحة ذات ال 24 بئرا بغطاءها ونقلها إلى خزانة السلامة البيولوجية من الفئة الثانية.
    5. تزج كل بناء مستقيم في قطرتين من المعقمة 50 mM CaCl2 الحل (الشكل 5B(ii))، واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق.
      ملاحظة: هذا يخدم إلى ربط متقاطعة صوتيا سلاسل البوليمر alginate مع الأيونات Ca2 + والسماح للبناءات المستقيم للحفاظ على سلامتها الهيكلية.
    6. يستنشق بعناية حل CaCl2 من كل بناء، وشطف مرة واحدة في 1 مل من 1x PBS (الرقم الحموضة 7.4) لإزالة CaCl2 الزائدة (الشكل 5D).
    7. لمنع الجفاف من يبني الهيدروجيل المطبوعة بيولوجيا، والحفاظ على 3D يبني المستقيم المطبوع بيولوجيا في برنامج تلفزيوني 1x الطازجة حتى BMMCs على استعداد لتكون البذور على البنى (الشكل 5D).

5. حضانة BMMCs على سقالات مستقيمة مطبوعة بيولوجيا ثلاثية الأبعاد واختبار قابلية البقاء

  1. حضانة BMMCs على سقالات هيدروجيل مستقيمة مطبوعة بيولوجيا ثلاثية الأبعاد
    1. البذور aliquots من BMMCs على السقالات المستقيمة المطبوعة بيولوجيا 3D في ثلاثية المدد لمدة أربع فترات مختلفة، على سبيل المثال، 6 و 18 و 24 و 48 ساعة، بحيث تنتهي جميع العلاجات في وقت واحد. استخدم BMMCs المصنفة في آبار فارغة في ثلاثية المدد مثل عناصر التحكم غير المعالجة.
    2. نقل BMMCs aseptically من قارورة الثقافة T175 سم2 إلى أنبوب مخروطي معقم 50 مل، بيليه BMMCs في 200 × غرام لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
    3. Resuspend بيليه في 50 مل من المتوسطة RPMI كاملة جديدة تحتوي على 20 نانوغرام / مل من IL-3، وحساب كثافة الخلايا الحية عن طريق عد aliquot من BMMCs تريبان الأزرق الملطخة باستخدام مقياس الهماسية.
    4. بناء على كثافة الخلية المحسوبة في الخطوة 5.1.3، قم بإعداد 6 مل من تعليق BMMC بكثافة نهائية تبلغ 1 × 106 خلايا/مل.
    5. لإعداد الحضانة 48 ساعة، يستنشق برنامج تلفزيوني من الآبار A1-3 التي تحتوي على سقالات هيدروجيل المستقيم المطبوعة بيولوجيا ثلاثية الأبعاد، وماصة 1 مل من BMMC (1 × 106 خلايا / مل) تعليق في كل بئر. أيضا، ماصة 1 مل من BMMC (1 × 106 خلايا / مل) تعليق في الآبار A4-6 دون يبني مطبوعة بيولوجيا لتكون بمثابة السيطرة غير المعالجة. احتضان الآبار المتبقية التي تحتوي على سقالات مطبوعة بيولوجيا (B1-3، C1-3، D1-3) في RPMI دون إضافات لمنع الجفاف حتى يتم الوصول إلى الوقت المناسب للبذر مع BMMC لمدة العلاج 24 و 18 و 6 ساعة. ملء الآبار دون سقالات مطبوعة بيولوجيا (B4-6، C4-6، D4-6) مع 1 مل من برنامج تلفزيوني حتى يتم التوصل إلى الوقت المناسب للبذر مع BMMCs ل24، 18، و 6 ساعة نقاط الوقت.
    6. احتضان لوحة 24 بئرا في 37 درجة مئوية في جو 5٪ CO2 الرطوبة.
    7. لإعداد الحضانة 24 ساعة، يستنشق ثقافة موجودة من قبل المتوسطة / العازلة من الآبار B1-6، والبذور 1 مل من BMMC (1 × 106 خلايا / مل) تعليق في هذه الآبار. أعد الطبق إلى الحاضنة.
    8. لإعداد الحضانة 18 ساعة، يستنشق ثقافة موجودة من قبل المتوسطة / العازلة من الآبار C1-6، والبذور 1 مل من BMMC (1 × 106 خلايا / مل) تعليق في هذه الآبار. أعد الطبق إلى الحاضنة.
    9. لإعداد الحضانة 6 ساعة، يستنشق ثقافة موجودة من قبل المتوسطة / العازلة من الآبار D1-6، والبذور 1 مل من BMMC (1 × 106 خلية / مل) تعليق في هذه الآبار. أعد الطبق إلى الحاضنة.
    10. لإنهاء الحضانة، والاستغناء عن عينات من كل بئر من لوحة 24 جيدا ل(1) PI تلطيخ وتحليل حسب قياس التدفق الخلوي، (2) XTT فحص صلاحية الخلية، و (3) LDH الافراج عن المقايسة. لذلك، تأكد من أن لوحة مستديرة القاع 96-جيدا والأنابيب الدقيقة اللازمة 1.5 مل وصفت قبل وقت كاف من نقطة النهاية للحضانة.
  2. أخذ عينات الخلايا لإجراء الفحص الأيضي XTT
    1. إعادة إنفاق بدقة BMMCs في وسط الثقافة داخل كل بئر، مع الحرص على عدم الإضرار وتفتيت السقالات هيدروجيل 3D المطبوعة بيولوجيا.
    2. نقل 40 ميكرولتر من تعليق BMMC متجانسة من كل بئر إلى أنابيب ميكروفوج 1.5 مل معقمة تحتوي على 760 ميكرولتر من المتوسط RPMI كاملة جديدة (الحجم النهائي = 800 ميكرولتر)، ودوامة لفترة وجيزة لخلط.
    3. الاستغناء عن 100 ميكرولتر من تعليق BMMC المخفف في ثلاثية إلى لوحة microtiter مسطحة القاع 96 جيدا التي هي مناسبة لتسجيل قياسات امتصاص (انظر جدول المواد) على مطياف لوحة صغيرة.
    4. الاستغناء عن 50 ميكرولتر من XTT حل العمل لكل بئر تحتوي على تعليق الخلية BMMC باستخدام micropipette متعدد القنوات.
      ملاحظة: إعداد حل العمل XTT عن طريق خلط 5 مل من كاشف XTT مع 100 ميكرولتر من كاشف اقتران الإلكترون. إذابة هذه المكونات من -20 درجة مئوية في حمام مائي 37 درجة مئوية مباشرة قبل الاستخدام.
    5. احتضان لوحة 96 بئرا في 37 درجة مئوية في جو 5٪ CO2 مرطب لمدة 24 ساعة.
    6. في نهاية الحضانة، قم بإزالة لوحة 96 بئرا من الحاضنة واتركها تبرد لدرجة حرارة الغرفة. قيم امتصاص قياسية على مطياف ميكروبليت عند 450 نانومتر مع طرح الخلفية عند 650 نانومتر.
  3. أخذ عينات فائقة لاستات ديهيدروجيناز (LDH) المقايسة
    1. نقل تعليق BMMC المتبقية (960 ميكرولتر) من كل بئر من لوحة 24 جيدا إلى أنابيب ميكروفوج، والكريه الخلايا في 200 × غرام لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
    2. Pipette ثلاثة 100 μL aliquots من ثقافة الخلية supernatant من كل أنبوب microfuge في لوحة 96 microtiter جيدا شقة القاع. تجاهل بقايا النافورات من كل أنبوب ميكروفوج، والاحتفاظ بكريات BMMC لمزيد من التلطيخ مع PI في الأقسام 5.4.1-5.4.8.
    3. ماصة 50 ميكرولتر من حل العمل LDH في كل 100 ميكرولتر aliquot من supernatant.
      ملاحظة: الرجوع إلى الملف التكميلي 3 لإعداد الكواشف LDH المقايسة.
    4. حضانة لمدة 1 ساعة في الظلام في درجة حرارة الغرفة.
    5. ماصة 50 ميكرولتر من 1 M حمض الخليك إلى كل بئر لوقف رد الفعل.
    6. قيم امتصاص قياسية على مطياف لوحة صغيرة عند 490 نانومتر مع طرح الخلفية عند 680 نانومتر.
  4. تحليل التدفق الخلوي لقابلية بقاء BMMC عن طريق استبعاد يوديد البروبيديوم (PI)
    1. Resuspend الكريات BMMC في تدفق غسل العازلة (PBS [درجة الحموضة 7.4] التي تحتوي على 0.5٪ ث / v BSA)، والكريه الخلايا في 300 × غرام لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
    2. كرر خطوة الغسيل مع تدفق غسل العازلة مرة أخرى.
    3. Resuspend كل بيليه BMMC في 400 ميكرولتر من تدفق غسل العازلة.
      ملاحظة: سيكون هناك 24 عينة BMMC أعيد إنفاقها في المجموع: 12 عينة BMMC المحتضنة على ركائز الهيدروجيل المطبوعة بيولوجيا (4 نقاط زمنية في ثلاثية) و 12 عينة BMMC المحتضنة في الآبار دون البنى المطبوعة بيولوجيا (4 نقاط زمنية في ثلاث نسخ).
    4. في لوحة microtiter مستديرة القاع 96 جيدا، ماصة 20 ميكرولتر من تدفق غسل العازلة في الآبار A1-12 و B1-12. في نفس لوحة microtiter، ماصة 20 ميكرولتر من محلول تلطيخ PI 10x (100 ميكروغرام / مل PI في تدفق غسل العازلة) في الآبار C1-12 و D1-12.
    5. توزيع 180 ميكرولتر من العينات 12 BMMC المحتضنة على ركائز الهيدروجيل المطبوعة بيولوجيا في الآبار A1-12 (عينة واحدة لكل بئر). توزيع 180 ميكرولتر من العينات 12 BMMC المحتضنة دون ركائز الهيدروجيل المطبوعة بيولوجيا في الآبار B1-12 (عينة واحدة لكل بئر). استخدم عينات BMMC التي تم توزيعها في الآبار A1-12 و B1-12 كعناصر تحكم غير ملطخة لكل حالة علاج (24 تحكما في المجموع).
    6. توزيع 180 ميكرولتر من العينات ال 12 التي تم احتضانها على بنى مطبوعة بيولوجيا في الآبار C1-12 (عينة واحدة لكل بئر). توزيع 180 ميكرولتر من العينات ال 12 التي تم احتضانها من قبل BMMC دون إجراء عمليات بناء مطبوعة بيولوجيا في الآبار D1-12 (عينة واحدة لكل بئر).
      ملاحظة: سوف تلطخ عينات BMMC في الآبار C1-12 و D1-12 بتركيز PI فعال نهائي قدره 10 ميكروغرام / مل (24 عينة ملطخة في المجموع).
    7. احتضان لوحة إما لمدة 1 ساعة في 4 درجة مئوية أو 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة في الظلام.
    8. في نهاية فترة الحضانة، قم بتحليل العينات مباشرة من لوحة الميكروتيتر على مقياس تدفق الخلايا كما هو موضح سابقا تحت القسم 3.1.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

واحدة من أهم خصائص الحبر المواد الحيوية الناجحة أو ركيزة الثقافة هو أن من التوافق البيولوجي. في المقام الأول ، يجب ألا تؤدي الركيزة إلى الموت الخلوي. هناك العديد من الأساليب القائمة على الميكروتيتر وتدفق قياس الخلايا لتحديد مدى صلاحية الخلية ونخر; ومع ذلك، هذه الطرق غير قابلة لتحليل الخلايا المضمنة داخل مصفوفة هيدروجيل. في هذا البروتوكول، يتم التحايل على القيد المذكور أعلاه عن طريق بذر BMMCs على الركيزة الهيدروجيل أو سقالة مطبوعة بيولوجيا. بعد فترة حضانة محددة (6-48 ساعة في هذه الدراسة) ، يتم حصاد BMMCs بسهولة عن طريق micropipetting دون الحاجة إلى اضطراب ميكانيكي أو تحلل هيدروغلي للركيزة الهيدروجيل أو سقالة مطبوعة بيولوجيا ، والتي من شأنها أن تسبب أضرارا مادية للخلايا. ثم يتم تحليل صلاحية BMMCs بسرعة باستخدام طريقة نفاذية PI عن طريق قياس التدفق الخلوي. PI هو صبغة غشاء غير منير التي يتم استبعادها من الخلايا القابلة للحياة مع أغشية الخلايا سليمة والفلورس فقط عند التشابك بين أزواج قواعد DNA16.

على هذا النحو، فقط الخلايا مع أغشية الخلايا للخطر هي نفاذية إلى PI، وبالتالي، سوف الفلورس. أظهر تحليل نفاذية PI عدم وجود تغييرات في قابلية BMMC للحياة عندما يتم استزراعها على ركيزة CNC/agarose/D-mannitol. وفي الواقع، لم يحدث لأي من تركيزات CNC التي تم اختبارها (حتى 12.5٪ ث/5) أي آثار سلبية على قابلية BMMC للاستمرار مقارنة ب BMMCs المستزرعة في غياب ركائز الهيدروجيل CNC/agarose/D-mannitol (الشكل 3B, C). ومن الأهمية بمكان أيضا أن ركيزة bioink أو الثقافة لا يغير مورفولوجيا الخلايا. استنادا إلى تدفق القياسات الخلوية FSC مقابل لم تغير مؤامرات SSC، الركيزة الهيدروجيلية ذات أعلى تركيز CNC (12.5٪ ث/v) الحجم الأصلي (FSC) أو التفاصيل (SSC) ل BMMCs بالمقارنة مع BMMCs المستزرعة في غياب ركائز هيدروجيل CNC/agarose/D-mannitol (الشكل 3A(i) و(ii)).

ومن الخصائص الهامة الأخرى لحبر المادة الحيوية أو ركيزة الثقافة أنه يجب أن يمتلك القدرة على الحفاظ على التمايز والنمط الظاهري للخلايا التي يدعمها. اثنين من المؤشرات الحيوية الأكثر جوهرية من الخلايا الصاري هي مستقبلات IgE عالية التقارب، FcεRI، الذي يسهل استجابات BMMC للمستضدات ومستقبلات عامل الخلايا الجذعية، كيت (CD117)، وهو مطلوب للبقاء على قيد الحياة الخلية الصاري والتمايز. يتم تعريف الخلايا الصاري ناضجة من خلال التعبير عن هذه المستقبلات سطح اثنين، وركيزة bioink للحفاظ عليها في الثقافة، فإنه يجب أن لا تعدل بشكل كبير التعبير عن هذين المستقبلين. ويبدو أن ركيزة CNC/agarose/D-mannitol تزيد من التعبير عن FcεRI وكيت بتركيزات CNC ≥ 2.5٪ (الشكل 4A(iii)، B(iii)). ومن المثير للاهتمام أن مستويات التعبير المرتفعة FcεRI و Kit ظلت متسقة نسبيا بين 2.5٪ و 12.5٪ CNC ، مما يدل على تأثير الهضبة ويشير إلى تأثير لا يعتمد على تركيز CNC ، ولكن على بعض المعلمات الأخرى لمركب الهيدروجيل.

تتكون سقالات حبر الهيدروجيل الحيوي المطبوعة بيولوجيا ثلاثية الأبعاد التي تم إنشاؤها في هذه الدراسة من نانوسليلوز الرجفان (FNC) ، بدلا من نانوسليلوز البلوري ، وألجينات الصوديوم كجيلاتور ، بدلا من الآغروز. يعرض الخلايا النانوية الفيبريلار ميزات طوبوغرافية نانوية متميزة بالمقارنة مع CNC17 والتي ، بالإضافة إلى الهندسة المعمارية الصغيرة للركائز الحيوية ثلاثية الأبعاد للهيدرجيل الهيدروجيل الحيوي FNC ، يمكن أن تؤثر على صلاحية BMMCs. بعد الطباعة الحيوية ثلاثية الأبعاد والربط العرضي الأيوني لسقالات المنك الحيوي FNC/alginate/D-mannitol (الشكل 6)، تم استزراع BMMCs إما بمفردها أو على سقالات الهيدروجيل ثلاثية الأبعاد المطبوعة بيولوجيا لمدة 6، 18 و 24 و 48 ساعة على التوالي، من أجل تقييم التغيرات الديناميكية في جدوى BMMCs استجابة لسقالات FNC/alginate/D-mannitol، إن وجدت، على مدى فترات طويلة من الزمن. وأشار الفحص XTT إلى أن النشاط الأيضي للBMMCs المستزرعة على سقالات الهيدروجيل المطبوعة بيولوجيا ثلاثية الأبعاد ظل ثابتا نسبيا عند ~ 100٪ عبر جميع النقاط الزمنية المختبرة بالمقارنة مع BMMCs المستزرعة وحدها (الشكل 7A). تحلل الخلايا يؤدي إلى إطلاق LDH في وسط ثقافة الخلية، الذي يكشف عنه اختبار LDH كدالة لنشاطه الأنزيمي المؤكسيدو الاختزالي.

وأظهرت BMMCs المستزرعة على سقالات الهيدروجيل المطبوعة بيولوجيا ثلاثية الأبعاد زيادة تدريجية تعتمد على الوقت في إطلاق LDH بالمقارنة مع BMMCs المستزرعة وحدها؛ ومع ذلك، كان هذا الاتجاه انحراف معياري غير هام أقل من 9٪ (الشكل 7B). PI تلطيخ BMMCs المستزرعة على سقالات هيدروجيل مطبوعة بيولوجيا 3D كشفت أي تغييرات كبيرة في الجدوى بالمقارنة مع BMMCs المستزرعة وحدها في كل نقطة زمنية (الشكل 7C). وتجدر الإشارة إلى أن MFI من BMMCs PI الملطخة مثقف على سقالات الهيدروجيل المطبوعة بيولوجيا ثلاثية الأبعاد ظلت متسقة نسبيا (PI-MFI من 7000) عبر جميع النقاط الزمنية وكانت مشابهة ل BMMCs المستزرعة على ركائز CNC /agarose/D-mannitol، التي أظهرت ثابت PI-MFI من 7000 في جميع تركيزات CNC (2.5-12.5٪). وتبين هذه البيانات مجتمعة أن سقالات الهيدروجيل FNC/alginate/D-mannitol لا تؤثر سلبا على قدرة مركبات BMMCs على البقاء.

Figure 1
الشكل 1: تشريح ساق الفأرة، الذي يصور الساق وعظم الفخذ الذي يتم عزل نخاع العظم منه.

Figure 2
الشكل 2: إعداد ركيزة CNC/agarose/D-mannitol هيدروجيل. (أ) التخطيطي لبروتوكول إعداد الركيزة CNC/agarose/D-mannitol. (ب) تم تحميل CNC /agarose/D-mannitol الاستعدادات (0، 1، 2.5، 5، 10، و 12.5٪ (ث / v) CNC في PBS / agarose / D-mannitol) على لوحة من 24 بئرا في أربعة أضعاف كما هو موضح. الاختصارات: PBS = ملحي عازل بالفوسفات؛ CNC = نانوسليلوز البلورية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: تحليل التدفق الخلوي لقابلية BMMC للحياة عن طريق استبعاد البروبيديوم يوديد بعد الحضانة على ركائز CNC/agarose/D-mannitol. تمت إزالة BMMCs من CNC / agarose / D-mannitol هيدروجيل الركائز، وغسلها مرتين، وإعادة الإنفاق في PBS-0.5٪ ث / v BSA، ملطخة PI لمدة 1 ساعة في 4 درجة مئوية، وتحليلها عن طريق قياس التدفق الخلوي (ن = 4). وتم الحصول على ما مجموعه 000 20 خلية لكل عينة، بما في ذلك الكشف عن انبعاثات الفلورسينس PI في قناة PE. تم إجراء تحليل البيانات باستخدام برنامج تحليل قياس التدفق الخلوي. (أ) التشتت الأمامي (المحور س) مقابل التحليل الجانبي المتناثر (المحور ص) لمجموع سكان الخلايا من (1) التحكم غير المعالج BMMC (0٪ CNC/agarose/D-mannitol) و (2) BMMCs المستزرعة على 12.5٪ CNC/agarose/D-mannitol، التي تصور مجموعة الخلايا المسورة المستخدمة لتحليل البيانات. (ب) الرسم البياني تراكب الشخصي للخلايا المسورة (غير ملطخة أو ملطخة PI)، من BMMCs التحكم غير المعالجة (0٪ CNC/agarose/D-mannitol) وBMMCs مثقف على 12.5٪ CNC/agarose/D-mannitol. (ج) تم استزراع BMMCs على ركائز CNC/agarose/D-mannitol المختلفة (1-12.5٪ (w/v) CNC) لمدة 18 ساعة، وتم تحديد صلاحية الخلية من خلال التحليل الخلوي التدفقي للخلايا الملطخة ب PI. تمثيل رسومي ل PI MFIs ل BMMCs المحتضنة على ركائز CNC/agarose/D-mannitol المختلفة (1-12.5٪ (w/v) CNC) نسبة إلى BMMCs التي لم يتم علاجها وملطخة ب PI. الاختصارات: BMMCs = خلايا الصاري المشتقة من نخاع العظم؛ CNC = نانوسليلوز البلورية; PBS = المالحة العازلة بالفوسفات؛ BSA = ألبوم مصل البقر; PI = يوديد البروبيديوم; PE = فيكوريثرين. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 4
الشكل 4: تدفق التحليل الخلوي من FcεRI وكيت (CD117) التعبير مستقبلات سطح الخلية. تم استزراع BMMCs إما في غياب أو وجود ركائز CNC /agarose/D-mannitol لمدة 18 ساعة ، وإزالتها ، وتحليلها للتعبير عن المستقبلات. البيانات ممثلة ل 4 نسخ متماثلة. مبعثر إلى الأمام (محور س) مقابل الجانب مبعثر (ص المحور) نقطة مؤامرة من مجموع السكان الخلية في عينة BMMC غير المعالجة (0٪ CNC / agarose / D-mannitol)، ملطخة (A)(ط) الأجسام المضادة للسيطرة isotype-APC أو (B)(i) الأجسام المضادة للتحكم isotype-PE، ومجموعة الخلايا المسورة المستخدمة لتحليل البيانات. تراكب الرسم البياني لمحات من BMMCs مسور (ملطخة الأجسام المضادة للسيطرة isotype أو (A)(ii) المضادة FcεRI-APC الأجسام المضادة أو (B)(2) المضادة كيت PE)، المحتضنة إما وحدها (0٪ CNC/agarose/D-mannitol) أو على 12.5٪ CNC/agarose/D-mannitol الركائز. تم استزراع BMMCs لمدة 18 ساعة على ركائز CNC/agarose/D-mannitol المختلفة (1-12.5٪ (w/v) CNC) تليها FcεRI و Kit تحليل التعبير عن مستقبلات السطح، على التوالي، عن طريق قياس التدفق الخلوي (n =4). تمثيل رسومي ل MFIs من BMMCs ملطخة (A)'iii) المضادة FcεRI-APC أو (B)'iii) المضادة كيت PE الأجسام المضادة، على التوالي، بعد الثقافة على مختلف CNC / agarose / D-mannitol الركائز (1-12.5٪ (ث / v) CNC) بالنسبة للخلايا التي لم تعالج (0٪ CNC) وملطخة بالمثل. المختصرات: CNC = نانوسليلوز البلورية؛ APC = الوفيكوسيانين; PE = فيكوريثرين; BMMCs = خلايا الصاري المشتقة من نخاع العظم؛ MFI = متوسط كثافة الفلورسينس. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 5
الشكل 5: معدات الطباعة الحيوية ثلاثية الأبعاد والمواد الاستهلاكية المطلوبة للطباعة الحيوية 5 × 5 × 1 مم 2 طبقة سقالات هيدروجيل bioink bioink طبقة في شكل لوحة 24 جيدا. (A)(i) طابعة بيولوجية ثلاثية الأبعاد هوائية البثق مع وضع تجميع رأس الطباعة في موقفها يستريح عند الانتهاء من توجيه محاورها x-y-z . (أ) الهيئة المعنية بالاتصالات والا '2' معايرة رأس الطباعة 1 من نقطة البداية بتركيب خرطوشة دينك حيوي ووضع فوهة الطباعة مباشرة فوق منتصف بئر D1 في أبعاد x-y-z . (أ) الهيئة المعنية بالاتصالات والا '3' موضع PH1 بعد معايرة المحور z وضغط البثق ل PH1 الذي تم ضبطه على 12 كيلو باسكال. (ب) 1000000 '1' خرطوشة بيوينك (3 مل) تحتوي على تركيبة حبر المواد الحيوية NFC/Alginate/D-mannitol. (ب) 1000000 '2' موزع قطرات من محلول الربط المتقاطع 50 mM CaCl2 . (ج) الهيئة المعنية بالاتصالات والدوائر '1' تمثيل تخطيطي لتخطيط طباعة من ملف G-code لترميز طباعة سقالات هيدروجيل 2 من طبقة 24 × 5 × 5 × 1 مم. (ج) الهيئة المعنية بالاتصالات والدوائر '2' تمثيل تخطيطي لتخطيط طباعة من ملف G-code لترميز طباعة سقالات هيدروجيل الزنك الحيوية ذات الطبقة 5 × 5 × 1 مم من طبقتين فقط في الآبار A1-3 وB1-3 وC1-3 وD1-3 من لوحة من 24 بئرا. (ج) الهيئة المعنية بالاتصالات والدوائر '3' عرض موسع لنمط سقالة هيدروجيل 5 × 5 × 1 ملم من طبقتين في برنامج التقطيع Slic3r. (د) 1000000 Topview الفعلية 3D bioprinted 5 × 5 × 1 ملم 2 طبقة السقالات الهيدروجيل bioink rectilinear في شكل لوحة 24 جيدا مغمورة في برنامج تلفزيوني. الاختصارات: 3D = ثلاثي الأبعاد؛ PH1 = رأس الطباعة 1; NFC = السليلوز النانوي الرجفان؛ G-code = رمز هندسي; PBS = ملحي عازل بالفوسفات. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 6
الشكل 6: رسم تخطيطي يصور سير عمل الطباعة الحيوية ثلاثية الأبعاد وثقافة BMMC على سقالات FNC/alginate/D-mannitol هيدروجيل. الطباعة الحيوية ثلاثية الأبعاد لسقالات الهيدروجيل مع دينك الحيوي FNC/Alginate/D-mannitol من ملف G-code لترميز نمط شبكة 5 × 5 × 1 مم 2 طبقة ، وربط سقالات الهيدروجيل مع CaCl2 ، وزراعة BMMCs على البنى الهيدروجيل FNC /Alginate/D-mannitol. الاختصارات: 3D = ثلاثي الأبعاد؛ 2D = ثنائي الأبعاد؛ G-code = رمز هندسي; FNC = نانوسليلوز الرجفان; BMMCs = خلايا الصاري المشتقة من نخاع العظم. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 7
الشكل 7: قياس التدفق الخلوي (PI) والميكروتر (XTT وLDH) المقايسات من قابلية BMMC البقاء بعد الحضانة على FNC / alginate / D- mannitol السقالات. (أ) انتشار الخلية (XTT) بيانات المقايسة الأيضية لBMMCs المستزرعة على FNC / Alginate / D- mannitol ركائز bioink ل6 و 18 و 24 و 48 ساعة ، على التوالي. يتم تقديم القيم كنسبة مئوية من بيانات التمثيل الغذائي XTT لBMMCs المستزرعة وحدها لمدة 6 و 18 و 24 و 48 ساعة على التوالي. تشير أشرطة الخطأ إلى الانحراف المعياري (n=3). (ب) بيانات فحص إنزيم LDH ل BMMCs المستزرعة على سقالات دينك الحيوي FNC/Alginate/D-mannitol لمدة 6 و18 و24 و48 ساعة على التوالي. يتم تقديم القيم كتغييرات قابلة للطي بالنسبة لأنزيم LDH الذي تطلقه BMMCs المستزرعة وحدها لمدة 6 و 18 و 24 و 48 ساعة على التوالي. تشير أشرطة الخطأ إلى الانحراف المعياري (n=3). (ج) تدفق البيانات الخلوية من BMMCs PI الملطخة التي تم استزراعها إما وحدها أو على FNC / Alginate / D- mannitol سقالات bioink لمدة 6 و 18 و 24 و 48 ساعة على التوالي. تشير أشرطة الخطأ إلى الانحراف المعياري (n=3). المختصرات: LDH = لاكتات ديهيدروجيناز; BMMCs = خلايا الصاري المشتقة من نخاع العظم؛ FNC = نانوسليلوز الرجفان; PI = يوديد البروبيديوم; MFI = متوسط كثافة الفلورسينس. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

1.1.1. زجاجة 500 مل من RPMI (HyClone، جنرال إلكتريك للرعاية الصحية، الولايات المتحدة الأمريكية)
1.1.2. 4 مليون لتر-الجلوتامين (جيبكو، والثام ماساتشوستس، الولايات المتحدة الأمريكية)
1.1.3. 50 مليون متر β ميركابتوثانول (فيشر ساينتفيك، هامبتون، نيو هامبشير، الولايات المتحدة الأمريكية)
1.1.4. 1 مليون صوديوم بيروفات (جيبكو)
1.1.5. 100 U/mL البنسلين (جيبكو)
1.1.6. 100 ميكروغرام/مل ستربتوميسين (جيبكو)
1.1.7. 0.1 مليون متر من الأحماض الأمينية غير الأساسية (Gibco)
1.1.8. 25 م م HEPES (فيشر)
1.1.9. 10٪ الحرارة تعطيل FBS (جيبكو)
1.1.10. 30 نانوغرام / مل الماوس المؤتلف IL-3 (Peprotech، روكي هيل، نيو جيرسي، الولايات المتحدة الأمريكية)

الجدول 1: استكمال مكملات وسائط RPMI-1640.

الملف التكميلي 1. الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الملف.

الملف التكميلي 2. الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الملف.

الملف التكميلي 3. الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الملف.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

يتطلب تصنيع الأنسجة المحاكاة الحيوية ثلاثية الأبعاد الدمج الناجح للدينك الحيوي ، الذي يحاكي مكونات المصفوفة خارج الخلية ، مع المكون الخلوي (المكونات) لإنشاء تناظرات فسيولوجية في الأنسجة الحية . وهذا يتطلب استخدام الخلايا الأولية، وليس الخلايا المتحولة، عند تصنيع الأنسجة المحاكاة الحيوية الفسيولوجية. الخلايا المناعية الأولية، مثل الخلايا الصاري، ومع ذلك، هي عرضة بشكل خاص للآثار السامة للخلايا والتغيرات الظاهرية التي قد تكون ناجمة عن مصفوفة دينك الحيوي نفسه، وهو أمر غير مرغوب فيه. لذلك ، فإن القدرة على تقييم آثار حبر المواد الحيوية المرشح بسرعة على صلاحية والنمط الظاهري (تعبير مستقبلات السطح) للخلايا السارية مفيدة للغاية ، خاصة قبل الطباعة الحيوية ثلاثية الأبعاد للأنسجة المعقدة التي تحتوي على أنواع خلايا مختلفة مضمنة في مصفوفة bioink ، وهي مكلفة وتستغرق وقتا طويلا.

نهج هذا البروتوكول ينطوي على زراعة BMMCs، مثال على الخلايا الصاري الأولية، على سطح الركائز هيدروجيل بيونك مرشح مسبق (1-12.5٪ CNC جزءا لا يتجزأ من agarose)، مما يسمح استرجاع سهلة من BMMCs للتحليل اللاحقة من قدرة الخلية والتعبير مستقبلات السطح عن طريق قياس التدفق الخلوي. عزل نخاع العظم من عظم الفخذ الماوس والساق يتطلب الدقة والاهتمام بالتفاصيل بسبب هشاشة وحجم صغير من هذه العظام. بعد العزلة الناجحة وترسب نخاع العظم في الخلايا المتوسطة الثقافة، فمن الضروري للحفاظ على ثقافة الخلية مع 30 نانوغرام / مل الماوس المؤتلف IL-3 بشكل مستمر لمدة 4 أسابيع، مما يضمن التحفيز المستمر للتمييز بين خلايا السلف الدموي في الخلايا الصاري التي هي إيجابية مزدوجة للكيت (CD117) ومستقبلات سطح الخلية FcεRI.

يجب أن يستخدم تحليل التدفق الخلوي للخلايا السارية للتعبير السطحي عن Kit (CD117) ومستقبلات FcεRI ضوابط الأجسام المضادة متساوية النمط للمساعدة في تمييز إشارة الخلفية غير المحددة عن الإشارات المحددة للأجسام المضادة المستخدمة لاستهداف هذه المستقبلات ، كما هو موضح في الشكل 4A (ii) ، B (ii). ومن الضروري أيضا أن يتم فتح بوابة على مجموعة محددة جيدا من خلايا الصاري لاستبعاد حطام الخلية كما هو مبين في الشكل 4A(i) و 4B(i) ، والتي يمكن أيضا ربط الأجسام المضادة بشكل غير محدد. يجب استخدام micropipetting لطيف عند استرداد BMMCs من سطح الركائز هيدروجيل bioink للحد من قوى القص التي تمارس على الخلايا، والتي يمكن أن تلحق الضرر غشاء الخلية ويؤدي إلى تلطيخ مرتفعة اصطناعيا مع PI. يجب تحليل BMMCs الملطخة ب PI عن طريق قياس التدفق الخلوي مباشرة بعد انتهاء فترة حضانة التلطيخ حيث أن وسيط تلطيخ PI ، الذي يستند إلى PBS-0.5٪ ث / v BSA ، لا يهدف إلى الحفاظ على الخلايا لفترات طويلة من الزمن خارج وسيطة ثقافة الخلية. لأن PI يتخلل فقط الخلايا مع أغشية الخلايا للخطر، وأنها قادرة على وصمة عار الخلايا النخرية مع الانتقائية العالية والحساسية. ومع ذلك ، PI غير قادر على الكشف عن الخلايا المبرمج ، والتي تحافظ على أغشية الخلايا سليمة.

يمكن زيادة المقايسة الخلوية لتدفق PI-الاستبعاد الموصوفة في هذا البروتوكول مع الملحق-V-الفلورسين ايزوثيوسيانات (FITC)، الذي يرتبط على وجه التحديد إلى فوسفوليبيد، فوسفاتيديلسيرين، التي يتم نقلها إلى المنشور الخارجي لغشاء الخلية من الخلايا المبرمج. ومع ذلك، فإن التعويض ضروري لمراعاة نزيف الانبعاثات الفلورية من خلال FITC في قناة الكاشف المستخدمة للحصول على انبعاثات الفلورية من PI والعكس بالعكس. عند إعداد الطابعة الحيوية للطباعة الحيوية ثلاثية الأبعاد من اللوحة G-code المزودة ب 24 بئرا ، من الضروري إجراء معايرة نقطة البداية بدقة ، حيث يتم تسجيل إحداثيات x و y لمركز البئر D1 ، ويتم تحديث ملف G-code بهذه الإحداثيات x و y على السطر 1. إذا لم يتم تنفيذ هذه الخطوات المعايرة الأولية بدقة، لن تتحرك رؤوس الطباعة إلى نقطة البداية الصحيحة عند بدء الطباعة. المعايرة الصحيحة للمحور z بنفس القدر من الأهمية حيث أن الفشل في القيام بذلك يمكن أن يؤدي إلى اصطدام فوهة رأس الطباعة مع المطبوعة أو اللوحة ذات 24 بئرا عند بدء الطباعة.

يوضح الرسم التخطيطي لبناء الشبكة المستقيمة 5 × 5 × 1 مم من طبقتين (الشكل 5C(iii)) وجود المسام بين خيوط المنك الحيوية المنقوفة التي تشكل الركيزة. يعتمد حجم المسام وقطر خيوطها على ثلاثة معلمات: (1) سرعة سفر فوهة الطباعة، (2) ضغط البثق المطبق على المنك الحيوي داخل الخرطوشة، و(3) قطر فوهة الطباعة. يمكن طباعة ركائز Bioink ذات أقطار خيوط كبيرة ومسام صغيرة باستخدام سرعة فوهة طباعة أبطأ وضغط قذف أعلى (>12 كيلو باسكال) وفوهة طباعة قطرها أكبر (22 G). وعلى العكس من ذلك، فإن سرعة فوهة الطباعة الأسرع، وانخفاض ضغط البثق (<12 كيلو باسكال)، وفوهة الطباعة ذات القطر الأصغر (27 جراما) ستؤدي إلى ركائز ذات خيوط أدق ومسام أكبر. ومع ذلك ، فإن ضغط البثق العالي بشكل غير كاف سيؤدي إلى قذف كتل غير متسقة من دينك الحيوي بدلا من خيوط مستمرة ، مما سيؤثر سلبا على جودة الركيزة المطبوعة بيولوجيا ثلاثية الأبعاد وسلامتها الهيكلية.

وCNC / agarose / D - mannitol مرشح bioink المقدمة في هذا البروتوكول يخضع للهلام الحراري عندما يبرد agarose وصولا الى درجة حرارة الغرفة. وعلى النقيض من ذلك، يخضع المنك الحيوي التجاري المستخدم للطباعة الحيوية ثلاثية الأبعاد في هذا البروتوكول للربط العرضي الأيوني مع CaCl2 بسبب إدراج الألجينات الصوديومية في تركيبة الدينك الحيوي. ولذلك، فمن الضروري لتزج سقالات FNC/alginate/D-mannitol المطبوعة بيولوجيا في محلول 50 mM CaCl2 بعد الطباعة الحيوية لتسهيل الربط المتقاطع (الهلام) للركيزة. سيؤدي إغفال خطوة الربط الأيونية مع CaCl2 إلى انحلال سقالات FNC /alginate/D-mannitol عندما تكون مغمورة في وسط ثقافة الخلية. القيد الأول من CNC / agarose / D - mannitol صياغة bioink في تطبيقه في الطباعة الحيوية 3D الفعلية هي درجة حرارة ذوبان عالية بشكل استثنائي من agarose (90-95 درجة مئوية). على الرغم من أن رؤوس الطباعة للطباعة الحيوية ثلاثية الأبعاد المستخدمة في هذه الدراسة يمكن أن تصل إلى درجة حرارة قصوى تبلغ 130 درجة مئوية ، إلا أن خيوط CNC/agarose/D-mannitol المنيتول مقذوفة ستتفرق بسرعة مع طباعة الطبقات المتعاقبة لبناء الركيزة. ويمكن التحايل على هذا القيد من CNC / agarose / D - mannitol صياغة bioink إما عن طريق طباعة CNC / agarose / D - mannitol bioink مباشرة على مطبوعة مبردة لتسريع gelation ، أو استبدال agarose مع alginate الصوديوم ، والتي يمكن قذفها في درجة حرارة الغرفة ويخضع للربط العرضي الأيونية السريعة مع 50 MM CaCl2 في غضون 5 دقائق.

يقدم هذا البروتوكول نهجا موثوقا به لفحص واستبعاد تركيبات البيوينك التي تظهر توافقا كيميائيا بيوكيميائية ضعيفا مع الخلايا المناعية الحساسة ، مثل الخلايا السارية ، التي لا ينبغي أن تخضع للطباعة الحيوية ثلاثية الأبعاد الهوائية. وعلاوة على ذلك، فإن هذا البروتوكول فعال من حيث التكلفة لأنه يتطلب كميات منخفضة نسبيا من الخلايا لإجراء فحص متعدد فأس. وعلى النقيض من ذلك، تحتاج الخلائط الحيوية الخلية التي تمت صياغتها مسبقا إلى الطباعة الحيوية بكثافات خلايا عالية جدا (>107 خلايا/مل)، والتي يمكن أن تكون مكلفة وتستغرق وقتا طويلا لإجراء فحص للتوافق البيولوجي خاصة عند زراعة الخلايا الأولية التي تعتمد على عوامل النمو المؤتلفة المكلفة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

وقد دعم هذا العمل المجلس الوطني للبحوث في كندا وألبرتا للابتكار.

Acknowledgments

نشكر ألبرتا الابتكار لتوفير CNC وكين هاريس وجاي يونغ تشو لمشورتهم التقنية عند إعداد مصفوفة CNC / agarose / D - mannitol. نشكر أيضا بن هوفمان وهيذر وينشيل ونيكول ديامانتييدات على نصائحهم التقنية ودعمهم بإعداد ومعايرة الطابعة الحيوية INKREDIBLE+ ثلاثية الأبعاد.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
A
Acetic Acid (glacial) Sigma Aldrich AX0074-6
Agarose (OmniPur) EMD Millipore Corporation 2125-500GM
Armenian Hamster IgG Isotype Control, APC (Clone: eBio299Arm) Thermo Fisher Scientific 17-4888-82
B
b-Mercaptoethanol Fisher Scientific O3446I-100
b-Nicotinamide adenine dinucleotide sodium salt (NAD) Sigma Aldrich N0632-5G
BD 5 mL Syringe (Luer-Lok Tip) BD 309646
BD PrecisionGlide Needle 26G x 1/2 in BD 305111
BioLite 24 Well Multidish Thermo Fisher Scientific 930-186
BioLite 96 Well Multidish Thermo Fisher Scientific 130-188
BioLite 175 cm2 Flask Vented Thermo Fisher Scientific 130-191
Biosafety Cabinet Class II Microzone Corp., Canada BK-2-6-B3
BSA, Fraction V (OmniPur) EMD Millipore Corporation 2930-100GM
C
C57BL/6 mice The Jackson Laboratory 000664
CD117 (c-Kit) Monoclonal Antibody, PE (Clone: 2B8) Thermo Fisher Scientific 12-1171-82
CELLINK BIOINK (3 x 3 mL Cartridge) CELLINK LLC IK1020000303
CELLINK CaCl2 Crosslinking Agent - Sterile Bottle 1 x 60 mL CELLINK LLC CL1010006001
CELLINK Empty Cartridges 3cc with End and Tip Caps CELLINK LLC CSC0103000102
CELLINK HeartWare for PC CELLINK LLC Version 2.4.1
CELLINK INKREDIBLE+ 3D BIOPRINTER CELLINK LLC S-10003-001
CELLINK Sterile Standard Conical Bioprinting Nozzles 22G CELLINK LLC NZ4220005001
CELLINK Sterile Standard Conical Bioprinting Nozzles 25G CELLINK LLC NZ4250005001
CELLINK Sterile Standard Conical Bioprinting Nozzles 27G CELLINK LLC NZ4270005001
Cell Proliferation Kit II (XTT) (Roche) Sigma Aldrich 11465015001
Centrifuge (Benchtop) Eppendorf 5804R
Corning Costar 96 Well Clear Flat-Bottom Non-Treated PS Microplate Sigma Aldrich CLS3370
CO2 Incubator Binder GmbH, Germany 9040-0113
CytoFLEX Flow Cytometer Beckman Coulter A00-1-1102
D
D-mannitol (MilliporeSigma Calbiochem) Fisher Scientific 44-390-7100GM
F
Falcon 15 mL Polystyrene Conical Tubes, Sterile Corning 352095
Falcon 50 mL Polystyrene Conical Tubes, Sterile Corning 352070
FceR1 alpha Monoclonal Antibody, APC (Clone: MAR-1) Thermo Fisher Scientific 17-5898-82
Fetal Bovine Serum (FBS), qualified, heat inactivated Thermo Fisher Scientific 12484028
FlowJo Software Becton Dickinson & Co. USA Version 10.6.2
G
GraphPad Prism GraphPad Software, LLC Version 8.4.3
H
Hemacytometer (Improved Neubauer 0.1 mmm deep levy) VWR 15170-208
HEPES Sodium Salt Fisher Scientific BP410-500
I
Iodonitrotetrazolium chloride (INT) Sigma Aldrich I10406-5G
L
L-Glutamine 200 mM (Gibco) Thermo Fisher Scientific 25030-081
Lithium L-lactate Sigma Aldrich L2250-100G
M
MEM Non-Essential Amino Acids 100 mL 100x (Gibco) Thermo Fisher Scientific 11140-050
1-Methoxy-5-methylphenazinium methyl sulfate (MPMS) Sigma Aldrich M8640
Microtubes (1.7 mL clear) Axygen MCT-175-C
Microtubes (2.0 mL clear) Axygen MCT-200-C
MilliQ Academic (for producing MilliQ ultrapure water) Millipore ZMQS60001
N
Nalgene Rapid-Flow 90 mm Filter Unit (0.2 mm Pore size, 500 mL) Thermo Fisher Scientific 566-0020
Nalgene Syringe filter (0.2 mm PES, 25 mm) Thermo Fisher Scientific 725-2520
P
Penicillin Streptomycin 100 mL (Gibco) Thermo Fisher Scientific 15140-122
PBS pH 7.4, No Calcium/Magnesium, 500 mL (Gibco)  Thermo Fisher Scientific 10010-023
Propidium iodide, 1.0 mg/mL (Invitrogen)  Thermo Fisher Scientific P3566
R
Rat IgG2b kappa Isotype Control, PE (Clone: eB149/10H5) Thermo Fisher Scientific 12-4031-82
Recombinant Murine IL-3 PeproTech, Inc.  213-13
RPMI-1640 Medium 1X + 2.05 mM L-Glutamine (HyClone) GE Healthcare SH30027.01
S
Sarstedt 96 well round base PS transparent micro test plate (82.1582.001) Fisher Scientific NC9913213
Sodium Azide, 500 g Fisher Scientific BP922I-500
Sodium Pyruvate (100 mM) 100X (Gibco) Thermo Fisher Scientific 11360-070
T
Tris Base (2-amino-2(hydroxymethyl)-1,3-propanediol) Sigma Aldrich 252859
Trypan Blue solution (0.4%, for microscopy) Sigma Aldrich 93595
V
VARIOSKAN LUX Microplate Spectrophotometer (Type: 3020) Thermo Fisher Scientific VLBL00D0

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Tibbitt, M. W., Anseth, K. S. Hydrogels as extracellular matrix mimics for 3D cell culture. Biotechnology and Bioengineering. 103 (4), 655-663 (2009).
  2. Drury, J. L., Mooney, D. J. Hydrogels for tissue engineering: Scaffold design variables and applications. Biomaterials. 24 (24), 4337-4351 (2003).
  3. Lee, K. Y., Mooney, D. J. Hydrogels for tissue engineering. Chemical Reviews. 101 (7), 1869-1879 (2001).
  4. Halib, N., Ahmad, I. Nanocellulose: Insight into health and medical applications. Handbook of Ecomaterials. , Springer. Cham. 1345-1363 (2019).
  5. Alonso-Lerma, B., et al. High performance crystalline nanocellulose using an ancestral endoglucanase. Communications Materials. 1 (1), 57 (2020).
  6. Tummala, G. K., Lopes, V. R., Mihranyan, A., Ferraz, N. Biocompatibility of nanocellulose-reinforced PVA hydrogel with human corneal epithelial cells for ophthalmic applications. Journal of Functional Biomaterials. 10 (3), 35 (2019).
  7. Fey, C., et al. Bacterial nanocellulose as novel carrier for intestinal epithelial cells in drug delivery studies. Materials Science and Engineering: C. 109, 110613 (2020).
  8. Ojansivu, M., et al. Wood-based nanocellulose and bioactive glass modified gelatin-alginate bioinks for 3D bioprinting of bone cells. Biofabrication. 11 (3), 035010 (2019).
  9. Jonsson, M., et al. Neuronal networks on nanocellulose scaffolds. Tissue Engineering Part C: Methods. 21 (11), 1162-1170 (2015).
  10. Samulin Erdem, J., et al. Cellulose nanocrystals modulate alveolar macrophage phenotype and phagocytic function. Biomaterials. 203, 31-42 (2019).
  11. Menas, A. L., et al. Fibrillar vs crystalline nanocellulose pulmonary epithelial cell responses: Cytotoxicity or inflammation. Chemosphere. 171, 671-680 (2017).
  12. Halova, I., Draberova, L., Draber, P. Mast cell chemotaxis chemoattractants and signaling pathways. Frontiers in Immunology. 3, 1-19 (2012).
  13. Groll, J., et al. A definition of bioinks and their distinction from biomaterial inks. Biofabrication. 11 (1), 013001 (2019).
  14. Schwab, A., et al. Printability and shape fidelity of bioinks in 3D bioprinting. Chemical Reviews. 120 (19), 11028-11055 (2020).
  15. Jungst, T., Smolan, W., Schacht, K., Scheibel, T., Groll, J. Strategies and molecular design criteria for 3D printable hydrogels. Chemical reviews. 116 (3), 1496-1539 (2016).
  16. Sasaki, D. T., Dumas, S. E., Engleman, E. G. Discrimination of viable and non-viable cells using propidium iodide in two color immunofluorescence. Cytometry. 8 (4), 413-420 (1987).
  17. Usov, I., et al. Understanding nanocellulose chirality and structure-properties relationship at the single fibril level. Nature Communications. 6 (1), 7564 (2015).

Tags

الهندسة الحيوية، العدد 171،
تصنيع بلوري Nanocellulose جزءا لا يتجزأ من الحبر Agarose المواد الحيوية لثقافة الخلايا الصاري نخاع العظام المستمدة
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Karamchand, L., Wagner, A., Alam, S. … More

Karamchand, L., Wagner, A., Alam, S. B., Kulka, M. Fabrication of a Crystalline Nanocellulose Embedded Agarose Biomaterial Ink for Bone Marrow-Derived Mast Cell Culture. J. Vis. Exp. (171), e62519, doi:10.3791/62519 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter