Fabrikasjon av en krystallinsk nanocellulose innebygd agarose biomateriale blekk for benmarg-avledet mastcellekultur
Summary
Denne protokollen fremhever en metode for raskt å vurdere biokompatibiliteten til en krystallinsk nanocellulose (CNC)/agarose kompositthydromaterial blekk med musbenmargsavledede mastceller når det gjelder celle levedyktighet og fenotypisk uttrykk for celleoverflatereseptorene, Kit (CD117) og høy affinitet IgE-reseptor (FcεRI).
Abstract
Tredimensjonal (3D) bioprinting benytter hydrogelbaserte kompositter (eller biomateriale blekk) som er avsatt i et mønster, og danner et substrat som celler deponeres på. Fordi mange biomaterialer kan være potensielt cytotoksiske for primærceller, er det nødvendig å bestemme biokompatibiliteten til disse hydrogelkomposittene før de brukes i kostbare 3D-vevsteknikkprosesser. Noen 3D-kulturmetoder, inkludert bioprinting, krever at celler bygges inn i en 3D-matrise, noe som gjør det vanskelig å trekke ut og analysere cellene for endringer i levedyktighet og biomarkøruttrykk uten å fremkalle mekanisk skade. Denne protokollen beskriver som konseptbevis, en metode for å vurdere biokompatibiliteten til en krystallinsk nanocellulose (CNC) innebygd agarosekompositt, fremstilt i et 24-brønns kultursystem, med musebenmarg-avledede mastceller (BMMCer) ved hjelp av strømningscytometriske analyser for celle levedyktighet og biomarkøruttrykk.
Etter 18 timers eksponering for CNC/agarose/D-mannitol-matrisen var BMMC-levedyktigheten uendret målt ved propidiumjodid (PI) permeabilitet. Imidlertid syntes BMMCs dyrket på CNC / agarose / D-mannitol substratet å øke deres uttrykk for høyaffinitet IgE reseptor (FcεRI) og stamcellefaktorreseptoren (Kit; CD117), selv om dette ikke ser ut til å være avhengig av mengden CNC i bioinkkomposittet. Levedyktigheten til BMMCer ble også vurdert etter en tidskurseksponering for hydrogel stillaser som ble fremstilt fra et kommersielt biomateriale blekk sammensatt av fibrillar nanocellulose (FNC) og natriumalginat ved hjelp av en 3D ekstruderingsbioprinter. Over en periode på 6-48 timer påvirket FNC/alginatsubstratene ikke levedyktigheten til BMMCene negativt, som bestemt av strømningscytometri og mikrotiteranalyser (XTT og laktatdehydrogenase). Denne protokollen beskriver en effektiv metode for raskt å screene den biokjemiske kompatibiliteten til kandidatens biomateriale blekk for deres nytte som 3D stillaser for post-print såing med mastceller.
Introduction
Den nylige interessen for 3D-kultursystemer og 3D-bioprinting har fokusert oppmerksomheten på hydrogeler og hydrogelkompositter. Disse komposittene fungerer som viskøse, men porøse biomimetika og kan bestå av opptil 99% vanninnhold etter vekt, noe som kan sammenlignes med biologisk vev1,2,3. Disse egenskapene til hydrogelkompositter tillater dermed veksten av celler uten å påvirke deres levedyktighet og funksjon. En slik kompositt er krystallinsk nanocellulose (CNC), som har blitt brukt som forsterkende materiale i hydrogelkompositter, celle stillaser i utviklingen av biomaterialeimplantater, og i todimensjonale (2D) og 3D in vitro cellekultur4,5. For det meste er matriser sammensatt av CNC ikke altfor cytotoksiske til humane hornhinnen epitelceller6, intestinale epitelceller7, human benmarg-avledet mesenchymale stamceller8, eller nevronlignende celler9. Imidlertid reduseres metabolsk aktivitet og spredning av humane benmarg-avledede mesenchymale stamceller i korrelasjon med økt viskositet av trebaserte nanocellulosekompositter, noe som tyder på at sammensetningen av matrisen må testes nøye for sine skadelige effekter på cellefunksjoner8.
På samme måte kan CNC indusere inflammatoriske responser i makrofager ved internalisering, noe som kan ha alvorlige konsekvenser i 3D immuncellekultursystemer10,11. Faktisk er det svært lite data tilgjengelig om hvordan CNC kan påvirke andre immuncelleresponser, spesielt allergiske inflammatoriske responser som initieres av mastceller. Mastceller er granulerte leukocytter som uttrykker høy affinitet IgE reseptor, FceRI, ansvarlig for å aktivere inflammatoriske responser på allergener. Deres spredning og differensiering er avhengig av stamcellefaktor (SCF), som binder tyrosinreseptoren, Kit. Mastceller er avledet fra benmargsforfedrederceller som kommer inn i sirkulasjonen og deretter migrerer perifert for å spre seg allestedsnærværende i alle menneskelige vev12. Ettersom mastceller fungerer i et 3D-vevsmiljø, er de en ideell immuncellekandidat for å studere immunologiske prosesser i in vitro 3D-vevsmodeller. Til dags dato er det imidlertid ingen levedyktig in vitro 3D-vevsmodell som inneholder mastceller.
På grunn av mastcellens svært følsomme natur og deres tilbøyelighet til å fremkalle proinflammatoriske responser på ytre stimuli, er det nødvendig med nøye vurdering av 3D-matrisebestanddelene og bioprintingsmetoden for å introdusere mastceller i 3D-stillaset, som diskutert videre. Vevskonstruksjoner kan biofabrikkeres fra to brede kategorier biomaterialer, det vil si bioinks og biomateriale blekk. Skillet ligger i det faktum at bioinks er cellebelastede hydrogelkompositter, mens biomateriale blekk er hydrogelkompositter som er blottet for celler, som definert av Groll et al.13,14. Derfor inneholder 3D-konstruksjoner trykt med bioinks celler forhåndsinspirert i hydrogelmatrisen, mens 3D-konstruksjoner trykt med biomaterialefarger må frøs med celler etter utskrift. Biofabrikasjonen av kulturstillaser fra hydrogelbaserte bioinks/biomaterialeblekk utføres oftest ved hjelp av ekstruderings-3D-bioprintere, som ekstruderer bioink/biomaterialet blekk gjennom en mikroskaladyse under trykk via enten et pneumatisk eller mekanisk drevet stempel14. Ekstruderingsbioprintere fremstiller 3D-stillaser ved å deponere bioink i 2D-tverrsnittsmønstre som er sekvensielt stablet på hverandre i en ‘bottom-up’ tilnærming.
For å være kompatibel med ekstruderingsbioprinting må den hydrogelbaserte bioink/biomaterialeblekk ha tixotrope (skjærfortynnende) egenskaper, hvorved de bestanddelene hydrogelpolymerer av bioink/biomaterialets blekkstrøm som en væske gjennom en mikrokanaldyse når den utsettes for skjærspenning, men går tilbake til askøse, gellignende tilstand ved fjerning av skjærspenningen15 . På grunn av deres høye vanninnhold må polymerene av hydrogelbaserte bioinks / biomaterialer krysskoblet, enten fysisk eller kovalent, for å opprettholde arkitekturen og strukturelle integriteten til den 3D bioprintede strukturen. Når det gjelder celleladede bioinks, blir cellene direkte utsatt for kjemiske påkjenninger under krysskoblingsprosessen. Prosessen med ekstruderingsceller innkapslet i bioink hydrogelmatrisen utsetter også cellene for skjærspenning, noe som kan føre til redusert levedyktighet og / eller celledød. Når 3D-vevsmodellen er bioprinted, er det vanskelig å diskriminere mellom nivåene av cytotoksisitet som fremkalles av hydrogelmatrisen selv og henholdsvis ekstruderings- og krysskoblingsprosessene. Dette er spesielt utfordrende i sammenheng med 3D-stillaser der cellene er forhåndsinfisert i hydrogelmatrisen, noe som gjør det vanskelig å fjerne cellene for etterfølgende analyser, noe som vil være skadelig for levedyktigheten til mastceller.
En mildere tilnærming til å generere 3D-vevskonstruksjoner som inneholder mastceller innebærer å så cellene i forhåndstrykte, porøse biomaterialeblekk 3D-stillaser fra en cellekulturfjæring, som utnytter mastcellenes medfødte evne til å migrere fra sirkulasjonen til perifert vev. Fordelene med denne cellesåingsmetoden er todelt: (i) mastcellene blir ikke utsatt for skjær og kjemiske påkjenninger fra henholdsvis ekstruderings- og krysskoblingsprosessene, og (ii) cellene kan lett fjernes fra 3D-stillaset etter eksponering ved skånsom vask for analyse uten å påvirke deres levedyktighet negativt. Den ekstra fordelen med å så og analysere celle levedyktigheten til mastceller på 3D bioprinted, porøse hydrogel stillaser i motsetning til 2D hydrogel plater er at 3D bioprinted hydrogel stillaser rekapitulere mikroskala topografiske egenskaper av in vivo vev, som ikke er til stede i bulk, 2D planar hydrogel plater. Denne tilnærmingen er en egnet, rask og kostnadseffektiv tilnærming for å bestemme de potensielt katastrofale cytotoksiske effektene av kandidatens bioink hydrogelmatriser på mastceller, samt andre immunologiske celler, før investering i kostbare 3D-vevsteknikkeksperimenter.
Protocol
Representative Results
Discussion
Fabrikasjonen av 3D biomimetisk vev krever vellykket sammenslåing av bioink, som etterligner komponenter i den ekstracellulære matrisen, med cellulær(e) komponent(er) for å skape fysiologiske analoger av in vivo vev. Dette krever bruk av primærceller, og ikke transformerte celler, ved fremstilling av fysiologisk biomimetisk vev. Primære immunologiske celler, som mastceller, er imidlertid spesielt utsatt for cytotoksiske effekter og fenotypiske endringer som kan fremkalles av selve bioinkmatrisen, noe som e…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker Alberta Innovates for å ha gitt CNC og Ken Harris og Jae-Young Cho sine tekniske råd når de forbereder CNC/agarose/D-mannitol-matrisen. Vi takker også Ben Hoffman, Heather Winchell og Nicole Diamantides for deres tekniske råd og støtte med oppsett og kalibrering av INKREDIBLE+ 3D bioprinter.
Materials
| A | |||
| Acetic Acid (glacial) | Sigma Aldrich | AX0074-6 | |
| Agarose (OmniPur) | EMD Millipore Corporation | 2125-500GM | |
| Armenian Hamster IgG Isotype Control, APC (Clone: eBio299Arm) | Thermo Fisher Scientific | 17-4888-82 | |
| B | |||
| b-Mercaptoethanol | Fisher Scientific | O3446I-100 | |
| b-Nicotinamide adenine dinucleotide sodium salt (NAD) | Sigma Aldrich | N0632-5G | |
| BD 5 mL Syringe (Luer-Lok Tip) | BD | 309646 | |
| BD PrecisionGlide Needle 26G x 1/2 in | BD | 305111 | |
| BioLite 24 Well Multidish | Thermo Fisher Scientific | 930-186 | |
| BioLite 96 Well Multidish | Thermo Fisher Scientific | 130-188 | |
| BioLite 175 cm2 Flask Vented | Thermo Fisher Scientific | 130-191 | |
| Biosafety Cabinet Class II | Microzone Corp., Canada | BK-2-6-B3 | |
| BSA, Fraction V (OmniPur) | EMD Millipore Corporation | 2930-100GM | |
| C | |||
| C57BL/6 mice | The Jackson Laboratory | 000664 | |
| CD117 (c-Kit) Monoclonal Antibody, PE (Clone: 2B8) | Thermo Fisher Scientific | 12-1171-82 | |
| CELLINK BIOINK (3 x 3 mL Cartridge) | CELLINK LLC | IK1020000303 | |
| CELLINK CaCl2 Crosslinking Agent – Sterile Bottle 1 x 60 mL | CELLINK LLC | CL1010006001 | |
| CELLINK Empty Cartridges 3cc with End and Tip Caps | CELLINK LLC | CSC0103000102 | |
| CELLINK HeartWare for PC | CELLINK LLC | Version 2.4.1 | |
| CELLINK INKREDIBLE+ 3D BIOPRINTER | CELLINK LLC | S-10003-001 | |
| CELLINK Sterile Standard Conical Bioprinting Nozzles 22G | CELLINK LLC | NZ4220005001 | |
| CELLINK Sterile Standard Conical Bioprinting Nozzles 25G | CELLINK LLC | NZ4250005001 | |
| CELLINK Sterile Standard Conical Bioprinting Nozzles 27G | CELLINK LLC | NZ4270005001 | |
| Cell Proliferation Kit II (XTT) (Roche) | Sigma Aldrich | 11465015001 | |
| Centrifuge (Benchtop) | Eppendorf | 5804R | |
| Corning Costar 96 Well Clear Flat-Bottom Non-Treated PS Microplate | Sigma Aldrich | CLS3370 | |
| CO2 Incubator | Binder GmbH, Germany | 9040-0113 | |
| CytoFLEX Flow Cytometer | Beckman Coulter | A00-1-1102 | |
| D | |||
| D-mannitol (MilliporeSigma Calbiochem) | Fisher Scientific | 44-390-7100GM | |
| F | |||
| Falcon 15 mL Polystyrene Conical Tubes, Sterile | Corning | 352095 | |
| Falcon 50 mL Polystyrene Conical Tubes, Sterile | Corning | 352070 | |
| FceR1 alpha Monoclonal Antibody, APC (Clone: MAR-1) | Thermo Fisher Scientific | 17-5898-82 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS), qualified, heat inactivated | Thermo Fisher Scientific | 12484028 | |
| FlowJo Software | Becton Dickinson & Co. USA | Version 10.6.2 | |
| G | |||
| GraphPad Prism | GraphPad Software, LLC | Version 8.4.3 | |
| H | |||
| Hemacytometer (Improved Neubauer 0.1 mmm deep levy) | VWR | 15170-208 | |
| HEPES Sodium Salt | Fisher Scientific | BP410-500 | |
| I | |||
| Iodonitrotetrazolium chloride (INT) | Sigma Aldrich | I10406-5G | |
| L | |||
| L-Glutamine 200 mM (Gibco) | Thermo Fisher Scientific | 25030-081 | |
| Lithium L-lactate | Sigma Aldrich | L2250-100G | |
| M | |||
| MEM Non-Essential Amino Acids 100 mL 100x (Gibco) | Thermo Fisher Scientific | 11140-050 | |
| 1-Methoxy-5-methylphenazinium methyl sulfate (MPMS) | Sigma Aldrich | M8640 | |
| Microtubes (1.7 mL clear) | Axygen | MCT-175-C | |
| Microtubes (2.0 mL clear) | Axygen | MCT-200-C | |
| MilliQ Academic (for producing MilliQ ultrapure water) | Millipore | ZMQS60001 | |
| N | |||
| Nalgene Rapid-Flow 90 mm Filter Unit (0.2 mm Pore size, 500 mL) | Thermo Fisher Scientific | 566-0020 | |
| Nalgene Syringe filter (0.2 mm PES, 25 mm) | Thermo Fisher Scientific | 725-2520 | |
| P | |||
| Penicillin Streptomycin 100 mL (Gibco) | Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | |
| PBS pH 7.4, No Calcium/Magnesium, 500 mL (Gibco) | Thermo Fisher Scientific | 10010-023 | |
| Propidium iodide, 1.0 mg/mL (Invitrogen) | Thermo Fisher Scientific | P3566 | |
| R | |||
| Rat IgG2b kappa Isotype Control, PE (Clone: eB149/10H5) | Thermo Fisher Scientific | 12-4031-82 | |
| Recombinant Murine IL-3 | PeproTech, Inc. | 213-13 | |
| RPMI-1640 Medium 1X + 2.05 mM L-Glutamine (HyClone) | GE Healthcare | SH30027.01 | |
| S | |||
| Sarstedt 96 well round base PS transparent micro test plate (82.1582.001) | Fisher Scientific | NC9913213 | |
| Sodium Azide, 500 g | Fisher Scientific | BP922I-500 | |
| Sodium Pyruvate (100 mM) 100X (Gibco) | Thermo Fisher Scientific | 11360-070 | |
| T | |||
| Tris Base (2-amino-2(hydroxymethyl)-1,3-propanediol) | Sigma Aldrich | 252859 | |
| Trypan Blue solution (0.4%, for microscopy) | Sigma Aldrich | 93595 | |
| V | |||
| VARIOSKAN LUX Microplate Spectrophotometer (Type: 3020) | Thermo Fisher Scientific | VLBL00D0 |
References
- Tibbitt, M. W., Anseth, K. S. Hydrogels as extracellular matrix mimics for 3D cell culture. Biotechnology and Bioengineering. 103 (4), 655-663 (2009).
- Drury, J. L., Mooney, D. J. Hydrogels for tissue engineering: Scaffold design variables and applications. Biomaterials. 24 (24), 4337-4351 (2003).
- Lee, K. Y., Mooney, D. J. Hydrogels for tissue engineering. Chemical Reviews. 101 (7), 1869-1879 (2001).
- Halib, N., Ahmad, I. Nanocellulose: Insight into health and medical applications. Handbook of Ecomaterials. , 1345-1363 (2019).
- Alonso-Lerma, B., et al. High performance crystalline nanocellulose using an ancestral endoglucanase. Communications Materials. 1 (1), 57 (2020).
- Tummala, G. K., Lopes, V. R., Mihranyan, A., Ferraz, N. Biocompatibility of nanocellulose-reinforced PVA hydrogel with human corneal epithelial cells for ophthalmic applications. Journal of Functional Biomaterials. 10 (3), 35 (2019).
- Fey, C., et al. Bacterial nanocellulose as novel carrier for intestinal epithelial cells in drug delivery studies. Materials Science and Engineering: C. 109, 110613 (2020).
- Ojansivu, M., et al. Wood-based nanocellulose and bioactive glass modified gelatin-alginate bioinks for 3D bioprinting of bone cells. Biofabrication. 11 (3), 035010 (2019).
- Jonsson, M., et al. Neuronal networks on nanocellulose scaffolds. Tissue Engineering Part C: Methods. 21 (11), 1162-1170 (2015).
- Samulin Erdem, J., et al. Cellulose nanocrystals modulate alveolar macrophage phenotype and phagocytic function. Biomaterials. 203, 31-42 (2019).
- Menas, A. L., et al. Fibrillar vs crystalline nanocellulose pulmonary epithelial cell responses: Cytotoxicity or inflammation. Chemosphere. 171, 671-680 (2017).
- Halova, I., Draberova, L., Draber, P. Mast cell chemotaxis chemoattractants and signaling pathways. Frontiers in Immunology. 3, 1-19 (2012).
- Groll, J., et al. A definition of bioinks and their distinction from biomaterial inks. Biofabrication. 11 (1), 013001 (2019).
- Schwab, A., et al. Printability and shape fidelity of bioinks in 3D bioprinting. Chemical Reviews. 120 (19), 11028-11055 (2020).
- Jungst, T., Smolan, W., Schacht, K., Scheibel, T., Groll, J. Strategies and molecular design criteria for 3D printable hydrogels. Chemical reviews. 116 (3), 1496-1539 (2016).
- Sasaki, D. T., Dumas, S. E., Engleman, E. G. Discrimination of viable and non-viable cells using propidium iodide in two color immunofluorescence. Cytometry. 8 (4), 413-420 (1987).
- Usov, I., et al. Understanding nanocellulose chirality and structure-properties relationship at the single fibril level. Nature Communications. 6 (1), 7564 (2015).
