Herstellung einer kristallinen Nanocellulose Embedded Agarose Biomaterial Tinte für Knochenmark-abgeleitete Mastzellkultur
Summary
Dieses Protokoll hebt eine Methode zur schnellen Bewertung der Biokompatibilität einer kristallinen Nanocellulose (CNC)/Agarose-Verbundhydrogel-Biomaterialtinte mit aus dem Knochenmark der Maus gewonnenen Mastzellen in Bezug auf die Zelllebensfähigkeit und die phänotypische Expression der Zelloberflächenrezeptoren Kit (CD117) und des hochaffinen IgE-Rezeptors (FcεRI) hervor.
Abstract
Das dreidimensionale (3D) Bioprinting verwendet Hydrogel-basierte Verbundwerkstoffe (oder Biomaterialtinten), die in einem Muster abgeschieden werden und ein Substrat bilden, auf dem Zellen abgeschieden werden. Da viele Biomaterialtinten potenziell zytotoxisch für Primärzellen sein können, ist es notwendig, die Biokompatibilität dieser Hydrogel-Verbundwerkstoffe vor ihrer Verwendung in kostspieligen 3D-Tissue-Engineering-Prozessen zu bestimmen. Einige 3D-Kulturmethoden, einschließlich Bioprinting, erfordern, dass Zellen in eine 3D-Matrix eingebettet werden, was es schwierig macht, die Zellen auf Veränderungen der Lebensfähigkeit und Biomarkerexpression zu extrahieren und zu analysieren, ohne mechanische Schäden hervorzurufen. Dieses Protokoll beschreibt als Proof of Concept eine Methode zur Bewertung der Biokompatibilität eines kristallinen Nanocellulose (CNC) eingebetteten Agarose-Verbundwerkstoffs, der zu einem 24-Well-Kultursystem mit aus dem Knochenmark der Maus gewonnenen Mastzellen (BMMCs) unter Verwendung von durchflusszytometrischen Assays für zelllebensfähigkeit und Biomarkerexpression hergestellt wird.
Nach 18 h Exposition gegenüber der CNC/Agarose/D-Mannitol-Matrix war die BMMC-Lebensfähigkeit unverändert, gemessen anhand der Propidiumiodidid (PI)-Permeabilität. BMMCs, die auf dem CNC/Agarose/D-Mannitol-Substrat kultiviert wurden, schienen jedoch ihre Expression des hochaffinen IgE-Rezeptors (FcεRI) und des Stammzellfaktorrezeptors (Kit; CD117), obwohl dies nicht von der Menge an CNC im Bioink-Verbundwerkstoff abhängig zu sein scheint. Die Lebensfähigkeit von BMMCs wurde auch nach einer zeitlichen Exposition gegenüber Hydrogelgerüsten bewertet, die aus einer kommerziellen Biomaterialtinte hergestellt wurden, die aus fibrillerer Nanocellulose (FNC) und Natriumalginat unter Verwendung eines 3D-Extrusionsbioprinters hergestellt wurde. Über einen Zeitraum von 6-48 h beeinträchtigten die FNC/Alginat-Substrate die Durchflusszytometrie und Mikrotiterassays (XTT und Laktatdehydrogenase) ermittelte Lebensfähigkeit der BMMCs nicht. Dieses Protokoll beschreibt eine effiziente Methode, um die biochemische Kompatibilität von Kandidaten-Biomaterialtinten schnell auf ihren Nutzen als 3D-Gerüste für das Post-Print-Seeding mit Mastzellen zu überprüfen.
Introduction
Das jüngste Interesse an 3D-Kultursystemen und 3D-Bioprinting hat die Aufmerksamkeit auf Hydrogele und Hydrogel-Verbundwerkstoffe gelenkt. Diese Verbundwerkstoffe dienen als viskose, aber poröse Biomimetik und können aus bis zu 99 Gew.-% Wassergehalt bestehen, was mit biologischen Geweben vergleichbar ist1,2,3. Diese Eigenschaften von Hydrogel-Verbundwerkstoffen ermöglichen somit das Wachstum von Zellen, ohne ihre Lebensfähigkeit und Funktion zu beeinträchtigen. Ein solcher Verbundwerkstoff ist kristalline Nanocellulose (CNC), die als Verstärkungsmaterial in Hydrogel-Verbundwerkstoffen, Zellgerüsten bei der Entwicklung von Biomaterialimplantaten und in zweidimensionaler (2D) und 3D-in-vitro-Zellkultur4,5 verwendet wurde. In den meisten Fällen sind Matrizen, die aus CNC bestehen, nicht offen zytotoxisch für menschliche Hornhautepithelzellen6, Darmepithelzellen7, aus dem menschlichen Knochenmark stammende mesenchymale Stammzellen8 oder neuronenähnliche Zellen9. Die metabolische Aktivität und Proliferation von mesenchymalen Stammzellen aus dem menschlichen Knochenmark nimmt jedoch in Korrelation mit der erhöhten Viskosität von Nanocellulose-Verbundwerkstoffen auf Holzbasis ab, was darauf hindeutet, dass die Zusammensetzung der Matrix sorgfältig auf ihre schädlichen Auswirkungen auf die Zellfunktionen getestet werden muss8.
In ähnlicher Weise kann CNC bei der Internalisierung Entzündungsreaktionen in Makrophagen hervorrufen, die schwerwiegende Folgen in 3D-Immunzellkultursystemen haben könnten10,11. Tatsächlich gibt es nur sehr wenige Daten darüber, wie CNC andere Immunzellantworten beeinflussen kann, insbesondere allergische Entzündungsreaktionen, die von Mastzellen initiiert werden. Mastzellen sind granulierte Leukozyten, die den hochaffinen IgE-Rezeptor FceRI exprimieren, der für die Aktivierung von Entzündungsreaktionen auf Allergene verantwortlich ist. Ihre Proliferation und Differenzierung sind abhängig vom Stammzellfaktor (SCF), der den Tyrosinrezeptor Kit bindet. Mastzellen werden aus Vorläuferzellen des Knochenmarks gewonnen, die in den Kreislauf gelangen und anschließend peripher wandern, um sich ubiquitär in allen menschlichen Geweben zu verteilen12. Da Mastzellen in einer 3D-Gewebeumgebung funktionieren, sind sie ein idealer Immunzellkandidat für die Untersuchung immunologischer Prozesse in in vitro 3D-Gewebemodellen. Bis heute gibt es jedoch kein brauchbares in vitro 3D-Gewebemodell, das Mastzellen enthält.
Aufgrund der hochempfindlichen Natur von Mastzellen und ihrer Neigung, entzündungsfördernde Reaktionen auf äußere Reize hervorzurufen, ist eine sorgfältige Berücksichtigung der 3D-Matrixbestandteile und der Bioprinting-Methode zur Einführung von Mastzellen in das 3D-Gerüst erforderlich, wie weiter diskutiert. Gewebekonstrukte können aus zwei großen Kategorien von Biomaterialien biofabriziert werden, nämlich Biotinten und Biomaterialtinten. Der Unterschied liegt in der Tatsache, dass Biotinten zellbeladene Hydrogel-Verbundwerkstoffe sind, während Biomaterial-Tinten Hydrogel-Komposite sind, die frei von Zellen sind, wie von Groll et al.13,14 definiert. Daher enthalten 3D-Konstrukte, die mit Biotinten gedruckt werden, Zellen, die in die Hydrogelmatrix eingebettet sind, während 3D-Konstrukte, die mit Biomaterialtinten gedruckt werden, mit Zellen nach dem Drucken ausgesät werden müssen. Die Biofabrikation von Kulturgerüsten aus Hydrogel-basierten Biotinten/Biomaterialtinten wird am häufigsten mit Extrusions-3D-Bioprintern durchgeführt, die die Bioink-/Biomaterialtinte durch eine mikroskalige Düse unter Druck entweder über einen pneumatisch oder mechanisch angetriebenen Kolben extrudieren14. Extrusionsbioprinter stellen 3D-Gerüste her, indem sie die Bioink in 2D-Querschnittsmustern ablegen, die nacheinander in einem “Bottom-up” -Ansatz aufeinander gestapelt werden.
Um mit dem Extrusions-Bioprinting kompatibel zu sein, muss die Hydrogel-basierte Bioink/Biomaterial-Tinte thixotrope (scherverdünnende) Eigenschaften besitzen, wobei die konstituierenden Hydrogelpolymere der Bioink/Biomaterial-Tinte bei Scherspannung wie eine Flüssigkeit durch eine Mikrokanaldüse fließen, aber bei Entfernung der Scherspannung in einen viskosen, gelartigen Zustand zurückkehren15 . Aufgrund ihres hohen Wassergehalts müssen die Polymere von Hydrogel-basierten Biotinten / Biomaterialtinten entweder physikalisch oder kovalent vernetzt werden, um die Architektur und strukturelle Integrität der 3D-biogedruckten Struktur zu erhalten. Bei zellbeladenen Biotinten werden die Zellen während des Vernetzungsprozesses direkt chemischen Belastungen ausgesetzt. Der Prozess der Extrudierung von Zellen, die in der Bioink-Hydrogel-Matrix eingekapselt sind, setzt die Zellen auch Scherstress aus, was zu einer verminderten Lebensfähigkeit und / oder zum Zelltod führen kann. Sobald das 3D-Gewebemodell biogedruckt wurde, ist es schwierig, zwischen dem Grad der Zytotoxizität, der durch die Hydrogelmatrix selbst hervorgerufen wird, und den Extrusions- bzw. Vernetzungsprozessen zu unterscheiden. Dies ist besonders herausfordernd im Zusammenhang mit 3D-Gerüsten, bei denen die Zellen in die Hydrogelmatrix eingebettet sind, was es schwierig macht, die Zellen für nachfolgende Analysen zu entfernen, was die Lebensfähigkeit von Mastzellen beeinträchtigen würde.
Ein schonenderer Ansatz zur Erzeugung von 3D-Gewebekonstrukten, die Mastzellen enthalten, besteht darin, die Zellen in vorgedruckte, poröse Biomaterial-Tinten-3D-Gerüste aus einer Zellkultursuspension zu säen, die die angeborene Fähigkeit von Mastzellen nutzt, aus dem Kreislauf in periphere Gewebe zu wandern. Die Vorteile dieses Zellsaatansatzes sind zweifach: (i) Die Mastzellen werden keiner Scher- bzw. chemischen Belastung durch die Extrusions- bzw. Vernetzungsprozesse ausgesetzt, und (ii) die Zellen können nach der Exposition durch sanftes Waschen zur Analyse leicht aus dem 3D-Gerüst entfernt werden, ohne ihre Lebensfähigkeit zu beeinträchtigen. Der zusätzliche Vorteil der Aussaat und Analyse der Zelllebensfähigkeit von Mastzellen auf 3D-biogedruckten, porösen Hydrogel-Gerüsten im Gegensatz zu 2D-Hydrogel-Scheiben besteht darin, dass die 3D-biogedruckten Hydrogel-Gerüste mikroskalige topographische Merkmale von In-vivo-Geweben rekapitulieren, die in großen, planaren 2D-Hydrogelscheiben nicht vorhanden sind. Dieser Ansatz ist ein geeigneter, schneller und kostengünstiger Ansatz, um die potenziell katastrophalen zytotoxischen Wirkungen von Bioink-Hydrogel-Matrices auf Mastzellen sowie andere immunologische Zellen zu bestimmen, bevor in kostspielige 3D-Tissue-Engineering-Experimente investiert wird.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die Herstellung von biomimetischen 3D-Geweben erfordert die erfolgreiche Verschmelzung der Biotinte, die Komponenten der extrazellulären Matrix nachahmt, mit der zellulären Komponente(n), um physiologische Analoga von In-vivo-Geweben zu erzeugen. Dies erfordert die Verwendung von Primärzellen und nicht von transformierten Zellen bei der Herstellung physiologischer biomimetischer Gewebe. Primäre immunologische Zellen, wie Mastzellen, sind jedoch besonders anfällig für zytotoxische Wirkungen und phänotypisc…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken Alberta Innovates für die Bereitstellung der CNC und Ken Harris und Jae-Young Cho für ihre technische Beratung bei der Vorbereitung der CNC/Agarose/D-Mannitol-Matrix. Wir danken auch Ben Hoffman, Heather Winchell und Nicole Diamantides für ihre technische Beratung und Unterstützung bei der Einrichtung und Kalibrierung des INKREDIBLE+ 3D-Bioprinters.
Materials
| A | |||
| Acetic Acid (glacial) | Sigma Aldrich | AX0074-6 | |
| Agarose (OmniPur) | EMD Millipore Corporation | 2125-500GM | |
| Armenian Hamster IgG Isotype Control, APC (Clone: eBio299Arm) | Thermo Fisher Scientific | 17-4888-82 | |
| B | |||
| b-Mercaptoethanol | Fisher Scientific | O3446I-100 | |
| b-Nicotinamide adenine dinucleotide sodium salt (NAD) | Sigma Aldrich | N0632-5G | |
| BD 5 mL Syringe (Luer-Lok Tip) | BD | 309646 | |
| BD PrecisionGlide Needle 26G x 1/2 in | BD | 305111 | |
| BioLite 24 Well Multidish | Thermo Fisher Scientific | 930-186 | |
| BioLite 96 Well Multidish | Thermo Fisher Scientific | 130-188 | |
| BioLite 175 cm2 Flask Vented | Thermo Fisher Scientific | 130-191 | |
| Biosafety Cabinet Class II | Microzone Corp., Canada | BK-2-6-B3 | |
| BSA, Fraction V (OmniPur) | EMD Millipore Corporation | 2930-100GM | |
| C | |||
| C57BL/6 mice | The Jackson Laboratory | 000664 | |
| CD117 (c-Kit) Monoclonal Antibody, PE (Clone: 2B8) | Thermo Fisher Scientific | 12-1171-82 | |
| CELLINK BIOINK (3 x 3 mL Cartridge) | CELLINK LLC | IK1020000303 | |
| CELLINK CaCl2 Crosslinking Agent – Sterile Bottle 1 x 60 mL | CELLINK LLC | CL1010006001 | |
| CELLINK Empty Cartridges 3cc with End and Tip Caps | CELLINK LLC | CSC0103000102 | |
| CELLINK HeartWare for PC | CELLINK LLC | Version 2.4.1 | |
| CELLINK INKREDIBLE+ 3D BIOPRINTER | CELLINK LLC | S-10003-001 | |
| CELLINK Sterile Standard Conical Bioprinting Nozzles 22G | CELLINK LLC | NZ4220005001 | |
| CELLINK Sterile Standard Conical Bioprinting Nozzles 25G | CELLINK LLC | NZ4250005001 | |
| CELLINK Sterile Standard Conical Bioprinting Nozzles 27G | CELLINK LLC | NZ4270005001 | |
| Cell Proliferation Kit II (XTT) (Roche) | Sigma Aldrich | 11465015001 | |
| Centrifuge (Benchtop) | Eppendorf | 5804R | |
| Corning Costar 96 Well Clear Flat-Bottom Non-Treated PS Microplate | Sigma Aldrich | CLS3370 | |
| CO2 Incubator | Binder GmbH, Germany | 9040-0113 | |
| CytoFLEX Flow Cytometer | Beckman Coulter | A00-1-1102 | |
| D | |||
| D-mannitol (MilliporeSigma Calbiochem) | Fisher Scientific | 44-390-7100GM | |
| F | |||
| Falcon 15 mL Polystyrene Conical Tubes, Sterile | Corning | 352095 | |
| Falcon 50 mL Polystyrene Conical Tubes, Sterile | Corning | 352070 | |
| FceR1 alpha Monoclonal Antibody, APC (Clone: MAR-1) | Thermo Fisher Scientific | 17-5898-82 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS), qualified, heat inactivated | Thermo Fisher Scientific | 12484028 | |
| FlowJo Software | Becton Dickinson & Co. USA | Version 10.6.2 | |
| G | |||
| GraphPad Prism | GraphPad Software, LLC | Version 8.4.3 | |
| H | |||
| Hemacytometer (Improved Neubauer 0.1 mmm deep levy) | VWR | 15170-208 | |
| HEPES Sodium Salt | Fisher Scientific | BP410-500 | |
| I | |||
| Iodonitrotetrazolium chloride (INT) | Sigma Aldrich | I10406-5G | |
| L | |||
| L-Glutamine 200 mM (Gibco) | Thermo Fisher Scientific | 25030-081 | |
| Lithium L-lactate | Sigma Aldrich | L2250-100G | |
| M | |||
| MEM Non-Essential Amino Acids 100 mL 100x (Gibco) | Thermo Fisher Scientific | 11140-050 | |
| 1-Methoxy-5-methylphenazinium methyl sulfate (MPMS) | Sigma Aldrich | M8640 | |
| Microtubes (1.7 mL clear) | Axygen | MCT-175-C | |
| Microtubes (2.0 mL clear) | Axygen | MCT-200-C | |
| MilliQ Academic (for producing MilliQ ultrapure water) | Millipore | ZMQS60001 | |
| N | |||
| Nalgene Rapid-Flow 90 mm Filter Unit (0.2 mm Pore size, 500 mL) | Thermo Fisher Scientific | 566-0020 | |
| Nalgene Syringe filter (0.2 mm PES, 25 mm) | Thermo Fisher Scientific | 725-2520 | |
| P | |||
| Penicillin Streptomycin 100 mL (Gibco) | Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | |
| PBS pH 7.4, No Calcium/Magnesium, 500 mL (Gibco) | Thermo Fisher Scientific | 10010-023 | |
| Propidium iodide, 1.0 mg/mL (Invitrogen) | Thermo Fisher Scientific | P3566 | |
| R | |||
| Rat IgG2b kappa Isotype Control, PE (Clone: eB149/10H5) | Thermo Fisher Scientific | 12-4031-82 | |
| Recombinant Murine IL-3 | PeproTech, Inc. | 213-13 | |
| RPMI-1640 Medium 1X + 2.05 mM L-Glutamine (HyClone) | GE Healthcare | SH30027.01 | |
| S | |||
| Sarstedt 96 well round base PS transparent micro test plate (82.1582.001) | Fisher Scientific | NC9913213 | |
| Sodium Azide, 500 g | Fisher Scientific | BP922I-500 | |
| Sodium Pyruvate (100 mM) 100X (Gibco) | Thermo Fisher Scientific | 11360-070 | |
| T | |||
| Tris Base (2-amino-2(hydroxymethyl)-1,3-propanediol) | Sigma Aldrich | 252859 | |
| Trypan Blue solution (0.4%, for microscopy) | Sigma Aldrich | 93595 | |
| V | |||
| VARIOSKAN LUX Microplate Spectrophotometer (Type: 3020) | Thermo Fisher Scientific | VLBL00D0 |
References
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