Summary
Этот протокол выделяет метод быстрой оценки биосовместимости кристаллической наноцеллюлозы (ЧПУ) / агарозных композитных гидрогелевых биоматериалных чернил с тучными клетками костного мозга мыши с точки зрения жизнеспособности клеток и фенотипической экспрессии рецепторов клеточной поверхности, Kit (CD117) и высокоаффинного рецептора IgE (FcεRI).
Abstract
Трехмерная (3D) биопечать использует композиты на основе гидрогеля (или чернила биоматериала), которые наносятся в виде рисунка, образуя субстрат, на который наносятся клетки. Поскольку многие чернила биоматериала могут быть потенциально цитотоксичными для первичных клеток, необходимо определить биосовместимость этих гидрогелевых композитов до их использования в дорогостоящих процессах 3D-тканевой инженерии. Некоторые методы 3D-культивирования, включая биопечать, требуют, чтобы клетки были встроены в 3D-матрицу, что затрудняет извлечение и анализ клеток на предмет изменений жизнеспособности и экспрессии биомаркеров без механического повреждения. Этот протокол описывает в качестве доказательства концепции метод оценки биосовместимости кристаллической наноцеллюлозы (ЧПУ), встроенного в агарозный композит, изготовленный в 24-луночную культуральную систему, с тучными клетками, полученными из костного мозга мыши (BMMCs), с использованием проточных цитометрических анализов жизнеспособности клеток и экспрессии биомаркеров.
После 18 ч воздействия матрицы ЧПУ/агарозы/D-маннитола жизнеспособность BMMC не изменялась по проницаемости йодида пропидия (PI). Однако БММК, культивируемые на субстрате ЧПУ/агарозы/D-маннитола , по-видимому, несколько увеличивают экспрессию высокоаффинного IgE-рецептора (FcεRI) и рецептора фактора стволовых клеток (Kit; CD117), хотя это, по-видимому, не зависит от количества ЧПУ в композите биочернила. Жизнеспособность BMMC также оценивалась после воздействия гидрогелевых каркасов, которые были изготовлены из коммерческих чернил биоматериала, состоящих из фибриллярной наноцеллюлозы (FNC) и альгината натрия с использованием 3D-экструзионного биопринтера. В течение 6-48 ч субстраты FNC/alginate не оказывали неблагоприятного влияния на жизнеспособность BMMCs, определяемую проточной цитометрией и анализами микротитров (XTT и лактатдегидрогеназа). Этот протокол описывает эффективный метод быстрого скрининга биохимической совместимости чернил-кандидатов для биоматериала на предмет их полезности в качестве 3D-каркасов для послепечатного посева тучными клетками.
Introduction
Недавний интерес к системам 3D-культур и 3D-биопечати сосредоточил внимание на гидрогелях и гидрогелевых композитах. Эти композиты служат вязкими, но пористыми биомиметиками и могут состоять из содержания до 99% воды по массе, что сопоставимо с биологическими тканями1,2,3. Эти особенности гидрогелевых композитов, таким образом, позволяют расти клеткам, не влияя на их жизнеспособность и функцию. Одним из таких композитов является кристаллическая наноцеллюлоза (ЧПУ), которая использовалась в качестве армирующего материала в гидрогелевых композитах, клеточных каркасах при разработке имплантатов биоматериала, а также в двумерных (2D) и 3D in vitro клеточных культурах4,5. По большей части матрицы, состоящие из ЧПУ, не являются открыто цитотоксичными для эпителиальных клеток роговицы человека6, эпителиальных клеток кишечника7, мезенхимальных стволовых клеток человеческого костного мозга8 или нейроноподобных клеток9. Однако метаболическая активность и пролиферация мезенхимальных стволовых клеток, полученных из костного мозга человека, снижается в корреляции с повышенной вязкостью древесных наноцеллюлозных композитов, что позволяет предположить, что состав матрицы должен быть тщательно проверен на предмет ее вредного воздействия на функции клеток8.
Аналогичным образом, ЧПУ может вызывать воспалительные реакции у макрофагов при интернализации, что может иметь серьезные последствия в системах 3D-культуры иммунных клеток10,11. На самом деле, существует очень мало данных о том, как ЧПУ может влиять на другие иммунные клеточные реакции, особенно аллергические воспалительные реакции, которые инициируются тучными клетками. Тучные клетки представляют собой гранулированные лейкоциты, которые экспрессируют высокоаффинный рецептор IgE, FceRI, ответственный за активацию воспалительных реакций на аллергены. Их пролиферация и дифференцировка зависят от фактора стволовых клеток (SCF), который связывает тирозиновый рецептор Kit. Тучные клетки получены из клеток-предшественников костного мозга, которые входят в кровообращение и впоследствии мигрируют периферически, чтобы повсеместно рассеяться во всех тканях человека12. Поскольку тучные клетки функционируют в 3D-тканевой среде, они являются идеальным кандидатом на иммунные клетки для изучения иммунологических процессов в 3D-моделях тканей in vitro. Однако на сегодняшний день не существует жизнеспособной 3D-модели ткани in vitro, содержащей тучные клетки.
Из-за высокочувствительной природы тучных клеток и их склонности вызывать провоспалительные реакции на внешние раздражители, требуется тщательное рассмотрение составляющих 3D-матрицы и метода биопечати введения тучных клеток в 3D-каркас, как обсуждается далее. Тканевые конструкции могут быть биофабрикцинированы из двух широких категорий биоматериалов, т.е. биочернил и чернил биоматериалов. Различие заключается в том, что биочернила представляют собой насыщенные клетками гидрогелевые композиты, тогда как чернила биоматериала представляют собой гидрогелевые композиты, которые лишены клеток, как определено Groll et al.13,14. Следовательно, 3D-конструкции, напечатанные с помощью биочернил, содержат клетки, предварительно встроенные в гидрогелевую матрицу, тогда как 3D-конструкции, напечатанные чернилами биоматериала, должны быть засеяны клетками после печати. Биофабрикация культивировочных каркасов из биочернил на основе гидрогеля / чернил биоматериала чаще всего выполняется с использованием экструзионных 3D-биопринтеров, которые выдавливают чернила биочернила / биоматериала через микромасштабное сопло под давлением через пневматический или механически управляемый поршень14. Экструзионные биопринтеры изготавливают 3D-каркасы, нанося биочернила в 2D-узоры поперечного сечения, которые последовательно укладываются друг на друга в подходе «снизу вверх».
Чтобы быть совместимыми с экструзионной биопечатью, чернила на основе биочернила/биоматериала на основе гидрогеля должны обладать тиксотропными (разбавляющими сдвиг) свойствами, в результате чего составляющие гидрогелевые полимеры биочернила/биоматериала текут как жидкость через микроканальное сопло при воздействии напряжения сдвига, но возвращаются в вязкое, гелеобразное состояние при снятии напряжения сдвига15 . Из-за высокого содержания воды полимеры биочернил / чернил биоматериала на основе гидрогеля должны быть сшиты, физически или ковалентно, для поддержания архитектуры и структурной целостности 3D-биопечатной структуры. В случае биочернил, нагруженных клетками, клетки непосредственно подвергаются химическим напряжениям во время процесса сшивания. Процесс экструзии клеток, инкапсулированных в гидрогелевую матрицу биочернила, также подвергает клетки стрессу сдвига, что может привести к снижению жизнеспособности и/или гибели клеток. После того, как 3D-модель ткани была биопечатана, трудно различить уровни цитотоксичности, вызванные самой гидрогелевой матрицей, и процессами экструзии и сшивки соответственно. Это особенно сложно в контексте 3D-каркасов, где клетки предварительно встроены в гидрогелевую матрицу, что затрудняет удаление клеток для последующих анализов, что нанесет ущерб жизнеспособности тучных клеток.
Более мягкий подход к созданию 3D-тканевых конструкций, содержащих тучные клетки, включает в себя посев клеток в предварительно напечатанные, пористые чернильные 3D-каркасы биоматериала из суспензии клеточной культуры, которая использует врожденную способность тучных клеток мигрировать из циркуляции в периферические ткани. Преимущества этого подхода к посеву клеток двояки: (i) тучные клетки не подвергаются сдвиговым и химическим нагрузкам в результате процессов экструзии и сшивки соответственно, и (ii) клетки могут быть легко удалены из 3D-каркаса после воздействия путем тщательной промывки для анализа без негативного влияния на их жизнеспособность. Дополнительным преимуществом посева и анализа жизнеспособности тучных клеток на 3D-биопечатных, пористых гидрогелевых каркасах в отличие от 2D-гидрогелевых дисков является то, что 3D-биопечатные гидрогелевые каркасы рекапитулируют микромасштабные топографические особенности тканей in vivo , которые не присутствуют в объемных, 2D-плоских гидрогелевых дисках. Этот подход является подходящим, быстрым и экономически эффективным подходом к определению потенциально катастрофических цитотоксических эффектов матриц гидрогеля биочернила на тучные клетки, а также на другие иммунологические клетки до инвестирования в дорогостоящие эксперименты по 3D-тканевой инженерии.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол состоит из пяти разделов: (1) выделение костного мозга мыши и дифференцировка тучных клеток костного мозга мыши (BMMCs), (2) изготовление гидрогелевых субстратов с ЧПУ / агарозой / D-маннитом в 24-луночной системе и культура BMMC на субстратах, (3) удаление BMMC из субстратов С ЧПУ / агарозы / D-маннитола гидрогеля и анализ жизнеспособности и экспрессии биомаркеров с использованием проточной цитометрии, (4) 3D-биопечать гидрогелевых каркасов из коммерчески доступных фибриллярных наноцеллюлозных (FNC)/альгинатно-натриевых композитных биоматериальных чернил и (5) культивирование БММК на каркасах ФНК/альгината натрия гидрогеля и анализ жизнеспособности с использованием проточной цитометрии, XTT и микротитерных анализов лактатдегидрогеназы (ЛДГ).
1. Генерация культуры BMMC
ПРИМЕЧАНИЕ: Мышей усыпляли асфиксией CO2 после изофлурановой анестезии. Были выделены большеберцовая и бедренная кости, и был собран весь костный мозг. Все исследования на животных проводились в соответствии с Руководящими принципами и политикой Канадского совета по уходу за животными с одобрения Комитета по уходу и использованию животных в области здравоохранения Университета Альберты.
- Готовят полную питательную среду RPMI-1640, добавляя добавки, перечисленные в таблице 1 , к указанным конечным концентрациям. Отрегулируйте рН среды до 7,4-7,6 с помощью NaOH, фильтруйте-стерилизуйте с помощью одноразового фильтра для бутылок (размер пор 0,2 мкм) и храните при температуре 4 °C в темноте до 2 месяцев.
- Получайте бедренные кости от мышей в соответствии с протоколами и процедурами местного Комитета по уходу за животными университета.
ПРИМЕЧАНИЕ: В этом исследовании бедренные кости были выделены у мышей C57BL/6, но любой штамм может быть использован, если он имеет отношение к исследованию. - С помощью ножниц удалите кожу и мышцы из тазобедренного сустава, а затем осторожно вытяните бедренную кость, слегка выкрутив из тазобедренного сустава (рисунок 1). Будьте осторожны, чтобы не отломить головку бедренной кости. Отрежьте большеберцовую кость от бедренной кости на медиальной фабелле ножницами. Удалите лапу, разрезав чуть выше пяточной кости и выбросьте.
- С помощью скальпеля удалите кожу и хрящи с кусочков бедренной и большеберцовой костей. Используя ножницы, сделайте чистый разрез на каждом конце бедренной и большеберцовой костей, обнажив красный костный мозг внутри. При необходимости удалите малоберцовую кость в этот момент, но обратите внимание, что это может помочь в манипуляциях с большеберцовой костью во время гиперемии костного мозга.
- Приготовьте иглу весом 26 г со шприцем luer-lock объемом 5 мл и заполните примерно 5 мл полной среды, подготовленной, как описано выше.
ПРИМЕЧАНИЕ: На данный момент неполный RPMI без добавок также может быть использован для экономии на реагентах. - Удерживая щипцами бедренную или большеберцовую кость, вставьте иглу в один конец кости и аккуратно надавите на шприц. Держите кость над стерильной конической трубкой объемом 50 мл и осторожно введите примерно 5 мл среды в кость, оказывая некоторое давление. Наблюдайте, как кусочки костного мозга выпадают из другого конца кости тонкими красными лентами и в коническую трубку.
- Раскрутите аспираты и повторно суспендируйте в полной среде или переведите непосредственно в стерильную культуральную колбу T175 cm2 , содержащую 50 мл полной среды RPMI-1640. Поддерживают аспираты в полной среде RPMI-1640 с 30 нг/мл мышиного рекомбинантного интерлейкина (IL)-3.
- Через 1 день наблюдают за культурами под световым микроскопом. Культура будет состоять из гетерогенной популяции клеток различной формы и размеров и даже более крупных кусочков костного мозга. Подкармливайте клеточные культуры, добавляя 15 мл свежей среды каждые 3-5 дней с использованием полной среды RPMI-1640, как описано выше, и гарантируйте, что плотность клеток никогда не превышает 1 × 106 клеток / мл. Один раз в неделю вращайте клетки при 200 × г в течение 5 мин при комнатной температуре, повторно суспендируйте в свежей полной среде RPMI-1640 и разделите 1:4 на 50 мл среды в свежих колбах T175.
- Через 4 недели определяют чистоту клеток путем измерения поверхностной экспрессии рецепторов CD117 (Kit) и FceRI с помощью проточной цитометрии, как описано ниже (раздел 3.2).
ПРИМЕЧАНИЕ: Через 4 недели 99% клеток должны быть двойными положительными для CD117 (Kit) и FcεRI. - Через 4 недели и далее поддерживайте BMMC с 20 нг/мл IL-3 в полной среде RPMI-1640. Примерно через 6 недель клетки перестанут делиться и больше не будут требовать расщепления. Подкармливайте культуры каждые 3–5 дней, гранулируйте клетки центрифугированием один раз в неделю и повторно суспендируйте в свежей полной среде RPMI-1640.
2. Изготовление гидрогелевых субстратов с ЧПУ/агарозой/D-маннитолом и культуры BMMC
- В стеклянной бутылке добавьте 0,2 г порошка агарозы в фосфатно-буферный физиологический раствор (PBS) (2% мас./об.) до конечного объема 10 мл и кипятите в течение 1 мин при 100 °C для растворения.
- Растворите 2,5 г порошка с ЧПУ в PBS до конечного объема 10 мл для получения 25% мас./об.смеси.
- Растворить 2 г порошка с ЧПУ в PBS до конечного объема 10 мл для получения 20% мас./об.смеси и последовательно разбавлять 20% мас./об.смеси для приготовления 10, 5 и 2% мас./об. смесей с ЧПУ.
- Нагревайте 25, 20, 10, 5 и 2% мас./об смесей с ЧПУ до 37 °C в течение 10 мин (рисунок 2A).
- Добавьте 0,46 г D-маннита в горячий раствор агарозы (4,6% мас./об.) и растворите.
- Смешайте предварительно нагретые 25, 20, 10, 5 и 2% мас./об. смеси CNC-PBS с горячим раствором агарозы/D-маннитола в отдельных конических пробирках в соотношении 1:1, чтобы получить конечные концентрации ЧПУ 12,5, 10, 5, 2,5 и 1% мас./об.в в гидрогелевых смесях.
- Работая быстро, добавляют 500 мкл/лунку вышеуказанных растворов, приготовленных на стадии 2.6 в квадрузикате, в 24-луночную культуральную пластину и оставляют настояться в течение 30 мин при комнатной температуре для облегчения полимеризации (рис. 2В).
- Аккуратно нанесите 1000 мкл суспензии BMMC при плотности 1,1 × 106 клеток/мл поверх гидрогелевых подложек микропипеттором и избегайте прикосновения геля кончиком пипетки, так как это повредит поверхность геля и создаст частицы.
- Инкубировать BMMC на гидрогелевых субстратах в стерильном инкубаторе (5% CO2, увлажненная атмосфера) при 37 °C в течение 18 ч.
3. Проточный цитометрический анализ
- Проточный цитометрический анализ жизнеспособности BMMC путем исключения PI
- Осторожно удалите культуральную среду, содержащую BMMMc, из верхней части CNC/агарозы/D-маннита, избегая геля, и перенесите клетки в микрофрагменную трубку объемом 1,5 мл.
- Промыть BMMMc дважды PBS (pH 7,4), содержащим 0,5% мас./об. бычьего сывороточного альбумина при 300 × г в течение 5 мин при комнатной температуре, и повторно суспендировать в 180 мкл PBS-0,5% мас./об BSA до конечной плотности 1,5 × 106 клеток/мл. Перенесите ячейки на пластину с круглым дном из 96 скважин.
ПРИМЕЧАНИЕ: Фильтруйте и стерилизуйте все растворы PBS-0,5% мас./об BSA дважды с помощью шприцевого фильтра размером 0,2 мкм и храните при температуре 4 °C. - Добавьте 20 мкл PBS-0,5% мас./об BSA или 10x PI (100 мкг/мл), приготовленного в PBS-0,5% мас./об BSA, к клеткам до конечной концентрации 10 мкг/мл и инкубируйте в течение 1 ч при 4°C или 15 мин при комнатной температуре в темноте. Получение флуоресцентных данных с помощью проточного цитометра, оснащенного аргоновым ионным лазером (488-514 нм) и полосовым фильтром, чтобы обеспечить обнаружение флуоресцентного излучения при 578 нм. Получение 20 000 событий на образец при скорости потока 30 мкл/мин при комнатной температуре. Проанализируйте данные, как описано ниже (разделы 3.2.7-3.2.10).
- Проточный цитометрический анализ BMMMc для экспрессии Kit (CD117) и поверхностного рецептора FcεRI
- Осторожно удалите культуральную среду, содержащую BMMMc, из верхней части CNC/агарозы/D-маннита, избегая геля, и перенесите клетки в микрофрагменную трубку объемом 1,5 мл.
- Дважды промыть БММК фильтрованным ПБС-0,5% БСА при 300 × г в течение 5 мин при комнатной температуре и повторно суспендировать в 180 мкл ПБС, содержащего 0,5% мас./об.БСА (1,5 × 106 клеток/мл). Перенесите повторно суспендированные ячейки на 96-луночную пластину с круглым дном.
- Добавьте 20 мкл 10x рабочих растворов антител к клеткам для достижения конечной концентрации 0,06 мкг/мл CD117 (c-Kit)-фикоэритрина (PE) и 0,06 мкг/мл FcεRIα-аллофикоцианина (APC) соответственно.
ПРИМЕЧАНИЕ: 10x рабочие растворы антител должны быть приготовлены в стерилизованном фильтром PBS-0,5% мас./v BSA. - Добавьте 20 мкл 10x контрольных рабочих растворов изотипа, содержащих либо крысиный IgG2b κ isotype control-PE, либо армянский хомяк IgG isotype control-APC, чтобы отделить лунки, содержащие клетки, которые не были окрашены ни одним из конъюгатов антитело-флуорофор на этапе 3.2.3.
ПРИМЕЧАНИЕ: Контроль изотипа, крыса IgG2b κ контроль изотипа-PE и армянский хомяк IgG изотип control-APC служат для контроля неспецифического прикрепления антител к BMMC. Поскольку BMMMc не экспрессируют высокие уровни FcR, редко обнаруживается высокая фоновая флуоресценция с контрольными антителами изотипа. Подготовьте 10-кратные рабочие растворы для управления изотипом в стерилизованном фильтром PBS-0,5% мас./об BSA. - Инкубировать 96-луночную пластину круглого дна в течение 1 ч при 4 °C в темноте.
- Промыть ячейки, добавив в каждую лунку 200 мкл свежего PBS-0,5% мас./об. буфера BSA, и центрифугу при 300 × г в течение 5 мин при комнатной температуре. Повторите шаг стирки еще раз. Осторожно удалить надосадочный материал, не касаясь ячейки гранулы; оставьте после себя немного супернатанта, чтобы гарантировать, что гранула клетки остается нетронутой.
- После промывки повторно суспендируют клетки в 100 мкл 0,5% мас./об. BSA, 0,05% мас./об.азида натрия в PBS (рН 7,4), который был стерильно отфильтрован дважды с помощью шприцевого фильтра размером 0,2 мкм. Получение флуоресцентных данных в каналах детектора PE и APC с помощью проточного цитометра, как описано выше на этапе 3.1.3.
- Анализируйте данные с помощью программного обеспечения, способного просматривать и анализировать файлы цитометрических данных потока с расширением «.fcs».
- Начните анализ с построения прямого рассеяния (FSC) вдоль оси x и бокового рассеяния (SSC) вдоль оси Y и затвора для сохраненной популяции клеток с диапазоном FSC log10 1,5-5,0 и диапазоном SSC log10 0,75-3,25 в необработанных и неокрашенных ячейках, как показано на рисунке 3A(i),(ii).
ПРИМЕЧАНИЕ: Это служит для обеспечения того, чтобы обломки клеток с низкими значениями FSC и SSC были исключены из анализа. Тучные клетки обычно являются очень зернистыми (с высоким SSC) клетками и большими (с высоким FSC) по сравнению с другими иммунологическими типами клеток, такими как моноциты и лимфоциты. - Затем генерируйте точечные графики FSC и SSC и профили гистограмм необработанных образцов, которые были окрашены красителем, антителами или контролем изотипа, и получайте среднюю интенсивность флуоресценции (MFI) в каналах PE или APC в соответствии с спектром излучения специфического конъюгата антитело-флуорофор или используемого красителя. Применять один и тот же набор затворов и параметров ко всем образцам BMMC, инкубированным с различными субстратами С ЧПУ/агарозой/D-маннитолом и окрашенным соответствующими элементами контроля изотипа, антителами или красителем; получить МФО.
ПРИМЕЧАНИЕ: По существу, точечные графики FSC и SSC необработанных окрашенных образцов должны быть неотличимы от необработанных/неокрашенных образцов, полученных на этапе 3.2.9, для обеспечения того, чтобы процедура окрашивания не изменяла размер ячейки (измеряемый FSC) или гранулярность (измеряемую SSC) (рисунок 3A(i),(ii)). - Рассчитайте средние MFI и стандартную среднюю погрешность (SEM) для каждой выборки из 4 независимых экспериментов с последующей генерацией графиков с использованием программного пакета статистического анализа.
- Подготовьте наложения гистограмм в программном обеспечении для анализа цитометрических данных потока (рисунок 3B, 4A(ii),B(ii)).
4.3D Биопечать субстратов FNC/гидрогеля альгината натрия
ПРИМЕЧАНИЕ: 3D-биопринтер, используемый в этом исследовании, представляет собой пневматическо-экструзионную систему, оснащенную двумя независимыми печатающими головками с контролируемой температурой. Чернила биоматериала, используемые для 3D-биопечати гидрогелевых каркасов, состоят из (а) высокогидратированной фибриллярной наноцеллюлозы (FNC), которая морфологически похожа на коллаген, (б) альгинат натрия и (c) D-маннит. Он поставляется в виде стерильной гидрогелевой суспензии в картриджах по 3 мл, к которым могут быть прикреплены стерильные конические сопла для биопечати luer-lock (22, 25 или 27 G).
- Используйте этот протокол с печатающими головками и печатной кроватью при комнатной температуре, где комнатная температура составляет 20-25 °C.
- Храните струйные картриджи с биоматериалом при температуре 4 °C для поддержания стабильности гидрогелевого композита. Перед началом 3D-биопечати извлеките картридж (3 мл) из холодильника и дайте ему уравновеситься до комнатной температуры.
- Установка картриджа Bioink на 3D-биопринтер INKREDIBLE+
- Снимите синие торцевые колпачки с картриджа с биоматериалом объемом 3 мл (рисунок 5B(i)) и прикрепите стерильную коническую сопло для биопечати весом 22 г (синий) к концу картриджа Bioink с блокировкой.
ПРИМЕЧАНИЕ: Необходимо прикрепить желаемое коническое сопло для биопечати к картриджу биочернила перед установкой картриджа и выполнением последующих этапов калибровки, так как невыполнение этого требования приведет к неправильной калибровке оси Z 3D-биопринтера. - Подключите трубку подачи воздуха для печатающей головки 1 (PH1, слева) к противоположному концу картриджа и вставьте картридж с прикрепленным коническим соплом для биопечати в вертикальный слот PH1 (рисунок 5A(ii)).
- Плотно установите картридж в PH1 с коническим соплом для биопечати, простирающимся под печатающей головкой. Затяните винт на PH1 по часовой стрелке до тех пор, пока палец не затянется, чтобы зафиксировать картридж Bioink на месте. Обратите внимание, что 3D-биопечать может быть выполнена с PH2, оставленным пустым.
- Снимите синие торцевые колпачки с картриджа с биоматериалом объемом 3 мл (рисунок 5B(i)) и прикрепите стерильную коническую сопло для биопечати весом 22 г (синий) к концу картриджа Bioink с блокировкой.
- Калибровка осей x-y-z 3D-биопринтера
- Включите 3D-биопринтер и запустите программное обеспечение биопринтера на ПК, подключенном к 3D-биопринтеру через кабель USB 2.0.
- В программном обеспечении нажмите кнопку CONNECT , чтобы синхронизировать программное обеспечение с 3D-биопринтером.
ПРИМЕЧАНИЕ: Синхронизация выполняется успешно, когда ультрафиолетовые светодиодные индикаторы печатающей головки включаются и выключаются, а вентилятор фильтра HEPA выключается и снова включается. Программное обеспечение должно быть синхронизировано с 3D-биопринтером перед самонаведением осей биопринтера и калибровкой начальной точки, как описано в последующих шагах. - Соблюдайте четыре опции в главном меню управления 3D-биопринтера: (i) ПОДГОТОВИТЬ BIOPRINT, (ii) BIOPRINT, (iii) UTILITIES MENU и (iv) STATUS SCREEN. Выберите опцию ПОДГОТОВИТЬ БИОПЕЧАТЬ , затем прокрутите вниз до и выберите опцию HOME AXES .
ПРИМЕЧАНИЕ: Затем 3D-биопринтер переместит сборку печатающей головки назад и влево для калибровки осей Y и X соответственно. После этого, когда печатающие головки будут приостановлены в крайнем левом положении, биопринтер поднимет печатную кровать до тех пор, пока калибровочный переключатель оси Z (расположенный на печатной кровати) не вступит в контакт с коническим соплом биопечати, установленным на печатающей головке 1 - После успешной калибровки осей x-y-z наблюдайте за небольшим опусканием печатной ленты и перемещением печатающих головок выше центральной точки печатной кровати (рисунок 5A(i)).
- Калибровка начальной точки биопринтера для биопечати в 24-луночных пластинах
- Извлеките стерильную 24-луночную культуральную пластину из герметичной пластиковой упаковки и отметьте точку в центральной точке скважины D1 на нижней стороне пластины постоянным маркером. Снимите крышку пластины и поместите 24-луночную культуральную пластину на печатную грядку с колодцем D1, расположенным в переднем левом углу печатной кровати.
- В главном меню управления выберите МЕНЮ УТИЛИТЫ , а затем выберите ПЕРЕМЕСТИТЬ ОСЬ. Перемещайте печатающие головки с шагом 1 мм вдоль осей x и Y до тех пор, пока коническое сопло для биопечати PH1 не окажется непосредственно над точкой, отмеченной под колодцем D1. При необходимости точно настройте положение конической биопечатной насадки над точкой, перемещая печатающие головки с шагом 0,1 мм.
- Записывайте координаты x- и y конической биопечати сопла непосредственно над центром скважины D1, как указано на экране панели управления 3D-биопринтера.
ПРИМЕЧАНИЕ: В случае используемого здесь биопринтера INKREDIBLE+ 3D координаты x и y следующие: x : -46.5 и y : -27.5. Эти координаты служат отправной точкой в центре скважины D1 для биопечати в 24-луночной пластине. - Затем поднимите печатное полотно с шагом 1 мм до тех пор, пока дно скважины D1 почти не коснется конического сопла для биопечати, установленного в печатающей головке 1. При необходимости настройте движение печатной ленты с шагом 0,1 мм (рисунок 5A(ii)). Затем в меню УТИЛИТЫ выберите опцию КАЛИБРОВКА ПО ОСИ Z , а затем выберите и подтвердите опцию КАЛИБРОВКА STORE Z .
- Вернитесь в главное меню и выберите опцию ПОДГОТОВИТЬ БИОПЕЧАТЬ . Прокрутите вниз до и выберите параметр CALIBRATE Z .
ПРИМЕЧАНИЕ: 3D-биопринтер теперь будет опускать печатное полотно после успешного выполнения калибровки по оси Z (рисунок 5A(iii)).
- Обновление файла G-кода 24-луночной пластины с правильными координатами начальной точки
- Откройте предоставленный файл геометрического кода пластины (G-код) на 24 скважины в программном обеспечении биопринтера (Дополнительный файл 1).
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот 24-луночный файл G-кода кодирует печать 2-слойных прямолинейных конструкций 5 x 5 x 1 мм в каждой скважине (рисунок 5C(i),(iii)). Предоставленные файлы G-кода можно использовать с любым программным обеспечением для 3D-биопечати. - Обратите внимание, что строка 1 файла G-кода читает G0 X-50.0 Y-33.5 ; Центральное положение скважины D1. Обновите координаты x и y на строке 1 значениями, полученными на шаге 4.5.3, т.е. строка 1 теперь должна читать G0 X-46.5 Y-27.5; Центральное положение скважины D1. Сохраните файл под новым именем.
ПРИМЕЧАНИЕ: Эта процедура служит для калибровки файла G-кода таким образом, чтобы печать началась в центре скважины D1 на основе координат x,y конкретного используемого 3D-биопринтера. Этот подход может быть использован для калибровки 24-луночного файла G-кода пластины для печати с помощью любого экструзионного 3D-биопринтера. Для целей этого исследования была напечатана только левая половина 24-луночной пластины, т.е. скважины A1-3, B1-3, C1-3 и D1-3. Также предоставляется отдельный файл G-кода, который кодирует печать 2-слойных прямолинейных конструкций 5 x 5 x 1 мм в сетке 3 x 4 (Дополнительный файл 2, рисунок 5C(ii)).
- Откройте предоставленный файл геометрического кода пластины (G-код) на 24 скважины в программном обеспечении биопринтера (Дополнительный файл 1).
- Регулировка давления экструзии для печатающей головки 1 (PH1)
- Убедитесь, что пневматический насос плотно подключен к заднему воздухозаборному порту биопринтера INKREDIBLE+ 3D, и включите пневматический насос.
- Вытащите переднюю ручку управления, расположенную на правой стороне биопринтера INKREDIBLE+ 3D.
ПРИМЕЧАНИЕ: Передняя ручка управления регулирует давление для PH1, в то время как задняя ручка управления регулирует давление для PH2. - Обратите внимание на цифровые манометры для PH1 и PH2, расположенные на передней панели биопринтера, каждый из которых считывает около 0 кПа. Медленно поворачивайте ручку управления вперед по часовой стрелке, пока давление, указанное на левом манометре для PH1, не достигнет 12 кПа (рисунок 5A(iii)).
- Поместите сложенную папиросную бумагу или кусок водонепроницаемой уплотнительной пленки под сопло для печати установленного картриджа, стараясь не коснуться печатного сопла.
- В главном меню управления 3D-биопринтером выберите ПОДГОТОВИТЬ BIOPRINT.
- Перейдите к пункту ВКЛЮЧИТЬ PH1 и выберите ВКЛЮЧИТЬ ЕГО. Обратите внимание, что чернила биоматериала начинают выдавливаться из печатного сопла. При необходимости увеличьте давление экструзии, вращая ручку управления по часовой стрелке до тех пор, пока чернила биоматериала не будут экструдированы в непрерывную нить, и запишите новую настройку давления. Работайте быстро, чтобы избежать траты чернил биоматериала.
- Выберите ВЫКЛЮЧИТЬ PH1 , чтобы остановить экструзию чернил биоматериала, удалите папиросную бумагу или пленку, содержащую экструдированные чернила биоматериала, с печатной кровати и закройте дверцу биопринтера.
ПРИМЕЧАНИЕ: 3D-биопринтер автоматически включает подачу давления воздуха на PH1 во время печати в соответствии с инструкциями файла G-кода.
- 3D биопечать прямолинейных гидрогелевых подложек в формате 24-луночной пластины
- В главном меню управления на 3D-биопринтере выберите UTILITIES MENU. Перейдите и выберите DISABLE SD PRINT, что позволит программному обеспечению биопринтера передавать файлы G-кода на 3D-биопринтер для печати.
- Нажмите кнопку LOAD в программном обеспечении биопринтера и выберите обновленный файл G-кода пластины на 24 скважины, сохраненный на шаге 4.6.2.
- На правой панели управления в программном обеспечении выберите вкладку ПРЕДВАРИТЕЛЬНЫЙ ПРОСМОТР и нажмите кнопку ПЕЧАТЬ , чтобы начать биопечать в скважине D1.
ПРИМЕЧАНИЕ: При использовании файла G-кода пластины сетки 3 x 4, биопечать будет завершена в скважине A3 24-луночной пластины (рисунок 5C(ii),D), в отличие от скважины A6, если напечатана полная пластина из 24 скважин. - По завершении биопечати прямолинейных конструкций накройте крышкой 24-луночную пластину и переместите ее в шкаф биобезопасности класса II.
- Погружайте каждую прямолинейную конструкцию в две капли стерильного раствора CaCl2 объемом 50 мМ (рисунок 5B(ii)) и инкубируйте при комнатной температуре в течение 5 мин.
ПРИМЕЧАНИЕ: Это служит для ионного сшивания альгинатных полимерных цепей с ионами Ca2+ и позволяет прямолинейным конструкциям сохранять свою структурную целостность. - Осторожно аспирируйте раствор CaCl2 из каждой конструкции и промывайте один раз в 1 мл 1x PBS (pH 7,4), чтобы удалить избыток CaCl2 (рисунок 5D).
- Чтобы предотвратить обезвоживание биопечатных гидрогелевых конструкций, поддерживайте 3D-биопечатные прямолинейные конструкции в свежем 1x PBS до тех пор, пока BCMC не будут готовы к посеву на конструкции (рисунок 5D).
5. Инкубация БММК на 3D биопечатных прямолинейных каркасах и проверка жизнеспособности
- Инкубация BMMC на 3D-биопечатных прямолинейных гидрогелевых каркасах
- Посевные аликвоты BMMMc на 3D-биопечатные прямолинейные каркасы в трех экземплярах в течение четырех различных длительностей, например, 6, 18, 24 и 48 ч, так что все обработки заканчиваются одновременно. Используйте BMMC, засеянные в пустые скважины в трех экземплярах в течение тех же периодов времени, что и необработанные контрольные элементы.
- Асептически переносят БММК из колбы для культивирования T175 см2 в стерильную коническую трубку объемом 50 мл и гранулируют БММК при 200 × г в течение 5 мин при комнатной температуре.
- Повторно суспендировать гранулу в 50 мл свежей полной среды RPMI, содержащей 20 нг/мл IL-3, и рассчитать плотность живых клеток, подсчитав аликвоту трипан окрашенных в синий цвет BMMMc с использованием гемацитометра.
- Исходя из плотности клеток, рассчитанной на стадии 5.1.3, готовят 6 мл аликвоты суспензии BMMC при конечной плотности 1 × 106 клеток/мл.
- Для инкубационной установки продолжительностью 48 ч аспирируйте PBS из скважин A1-3, содержащих 3D-биопечатные прямолинейные гидрогелевые каркасы, и пипетку 1 мл суспензии BMMC (1 × 106 клеток /мл) в каждую скважину. Кроме того, пипетка 1 мл Суспензии БММК (1 × 106 клеток/мл) в скважины А4-6 без биопечатных конструкций для использования в качестве необработанного контроля. Инкубировать оставшиеся скважины, содержащие биопечатные каркасы (B1-3, C1-3, D1-3) в RPMI без добавок для предотвращения обезвоживания до тех пор, пока не будет достигнуто соответствующее время для посева BMMC в течение 24, 18 и 6 ч продолжительности обработки. Заполняйте скважины без биопечатных каркасов (B4-6, C4-6, D4-6) 1 мл PBS до тех пор, пока не будет достигнуто соответствующее время для посева с BMMC для 24, 18 и 6-часовых временных точек.
- Инкубируйте плиту из 24 скважин при 37 °C в 5% увлажненной атмосфере CO2 .
- Для инкубационной установки продолжительностью 24 ч аспирировать ранее существовавшую культуральную среду/буфер из скважин B1-6 и посеять 1 мл суспензии BMMC (1 × 106 клеток/мл) в эти скважины. Верните тарелку в инкубатор.
- Для инкубационной установки продолжительностью 18 ч аспирировать ранее существовавшую культуральную среду/буфер из скважин С1-6 и засеять 1 мл суспензии BMMC (1 × 106 клеток/мл) в эти скважины. Верните тарелку в инкубатор.
- Для инкубационной установки 6 ч аспирировать ранее существовавшую культуральную среду/буфер из скважин D1-6 и посеять 1 мл суспензии BMMC (1 × 106 клеток/мл) в эти скважины. Верните тарелку в инкубатор.
- Для завершения инкубации дозируйте образцы из каждой скважины 24-луночной пластины для (i) окрашивания и анализа PI с помощью проточной цитометрии, (ii) анализа жизнеспособности клеток XTT и (iii) анализа высвобождения LDH. Поэтому убедитесь, что пластина с круглым дном из 96 скважин и необходимые микрофрагменные трубки объемом 1,5 мл маркированы задолго до конечной точки инкубации.
- Отбор проб клеток для метаболического анализа XTT
- Тщательно повторно суспендируйте БММК в питательной среде в каждой скважине, стараясь не повредить и не фрагментировать 3D-биопечатные гидрогелевые каркасы.
- Асептически переносят 40 мкл однородной суспензии BMMC из каждой скважины в стерильные 1,5 мл микрофьюжные трубки, содержащие 760 мкл свежей полной среды RPMI (конечный объем = 800 мкл), и вихрь кратковременно перемешивают.
- Дозируйте 100 мкл разбавленных суспензий BMMC в трех экземплярах в плоскодонную 96-луночную микротитровую пластину, которая подходит для регистрации измерений поглощения (см. Таблицу материалов) на микропластинчатом спектрофотометре.
- Дозируйте 50 мкл рабочего раствора XTT в каждую скважину, содержащую суспензию ячейки BMMC, используя многоканальную микропипетку.
ПРИМЕЧАНИЕ: Готовят рабочий раствор XTT путем смешивания 5 мл реагента XTT со 100 мкл электронно-связующего реагента. Разморозьте эти компоненты при -20 °C на водяной бане при температуре 37 °C непосредственно перед использованием. - Инкубируйте плиту из 96 скважин при 37 °C в 5% увлажненной атмосфере CO2 в течение 24 ч.
- В конце инкубации снимите из инкубатора 96-луночную пластину и дайте остыть до комнатной температуры. Запись значений поглощения на микропластинчатом спектрофотометре при 450 нм с вычитанием фона при 650 нм.
- Отбор проб супернатанта для анализа лактатдегидрогеназы (ЛДГ)
- Переложите оставшиеся суспензии BMMC (960 мкл) из каждой скважины 24-луночной пластины в микрофьюжные трубки и гранулируйте ячейки при 200 × г в течение 5 мин при комнатной температуре.
- Пипетка три 100 мкл аликвоты супернатанта клеточной культуры из каждой микрофьюжной трубки в 96-луночную микротитрную плоскодонную пластину. Выбросьте оставшиеся супернатанты из каждой микропластинки и сохраните гранулы BMMC для дальнейшего окрашивания PI в разделах 5.4.1-5.4.8.
- Пипетка 50 мкл рабочего раствора ЛДГ в каждые 100 мкл аликвоты супернатанта.
ПРИМЕЧАНИЕ: Обратитесь к Дополнительному файлу 3 для приготовления реагентов для анализа ЛДГ. - Инкубировать в течение 1 ч в темноте при комнатной температуре.
- Пипетка 50 мкл 1 М уксусной кислоты в каждую лунку для остановки реакции.
- Запись значений поглощения на микропластинчатом спектрофотометре при 490 нм с вычитанием фона при 680 нм.
- Проточный цитометрический анализ жизнеспособности BMMC путем исключения йодида пропидия (PI)
- Повторно суспендировать гранулы BMMC в буфере промывки потока (PBS [pH 7,4], содержащем 0,5% мас./об. BSA), и гранулировать ячейки при 300 × г в течение 5 мин при комнатной температуре.
- Повторите этап стирки с буфером промывки потока еще раз.
- Повторно суспендируйте каждую гранулу BMMC в 400 мкл буфера промывки потока.
ПРИМЕЧАНИЕ: Всего будет 24 повторно суспендированных образца BMMC: 12 образцов BMMC инкубированы на биопечатных гидрогелевых субстратах (4 временные точки в трех экземплярах) и 12 образцов BMMC, инкубированных в скважинах без биопечатных конструкций (4 временные точки в трех экземплярах). - В круглодонной 96-луночной микротитровой пластине пипетка 20 мкл проточного буфера промывки в скважины А1-12 и В1-12. В той же микротитровой пластине пипетка 20 мкл 10x PI окрашивающего раствора (100 мкг/мл PI в буфере промывки потока) в скважины C1-12 и D1-12.
- Дозируйте 180 мкл из 12 образцов BMMC, инкубированных на биопечатных гидрогелевых субстратах, в скважины A1-12 (один образец на скважину). Дозировать 180 мкл из 12 образцов BMMC, инкубированных без биопечатных гидрогелевых субстратов, в скважины B1-12 (один образец на скважину). Используйте образцы BMMC, дозированные в скважины A1-12 и B1-12, в качестве незапятнанных контрольных элементов для каждого состояния обработки (всего 24 контрольных элемента).
- Дозируйте 180 мкл из 12 образцов BMMC, инкубированных на биопечатных конструкциях, в скважины C1-12 (один образец на скважину). Дозируйте 180 мкл из 12 образцов BMMC, инкубированных без биопечатных конструкций, в скважины D1-12 (один образец на скважину).
ПРИМЕЧАНИЕ: Образцы BMMC в скважинах C1-12 и D1-12 будут окрашиваться при конечной эффективной концентрации PI 10 мкг/мл (всего 24 окрашенных образца). - Инкубировать пластину либо в течение 1 ч при 4 °C, либо 15 мин при комнатной температуре в темноте.
- В конце инкубационного периода проанализируйте образцы непосредственно с микротитерной пластины на проточном цитометре, как описано ранее в разделе 3.1.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Одной из наиболее важных характеристик успешной биоматериалной чернил или культурального субстрата является биосовместимость. Прежде всего, субстрат не должен вызывать клеточную гибель. Существует несколько микротитров и проточных цитометрических методов количественной оценки жизнеспособности и некроза клеток; однако эти методы не поддаются анализу клеток, встроенных в гидрогелевую матрицу. В этом протоколе вышеупомянутое ограничение обходится путем посева BMMC на гидрогелевой субстрат или биопечатный каркас. После определенного инкубационного периода (6-48 ч в этом исследовании) BMMC легко собирают путем микропипетирования без необходимости механического разрушения или гидролиза гидрогелевого субстрата или биопечатного каркаса, которые в противном случае вызвали бы физическое повреждение клеток. Затем жизнеспособность BMMC быстро анализируется с использованием метода проницаемости PI с помощью проточной цитометрии. PI представляет собой мембранонепроницаемый краситель, который исключается из жизнеспособных клеток с неповрежденными клеточными мембранами и флуоресценциями только при интеркалировании между парами оснований ДНК16.
Таким образом, только клетки с скомпрометированными клеточными мембранами проницаемы для PI и, следовательно, будут флуоресцировать. Анализ проницаемости PI не продемонстрировал никаких изменений жизнеспособности BMMC при их культивировании на субстрате CNC/agarose/D-mannitol. Фактически, ни одна из протестированных концентраций ЧПУ (до 12,5% мас./об.) не вызывала какого-либо неблагоприятного воздействия на жизнеспособность БММК по сравнению с БММК, культивируемыми в отсутствие гидрогелевых субстратов С ЧПУ/агарозы/D-маннитола (рисунок 3В,С). Также важно, чтобы биочернила или субстрат культуры не изменяли морфологию клеток. Исходя из проточных цитометрических участков FSC и SSC, гидрогелевая подложка с самой высокой концентрацией ЧПУ (12,5% мас./об.) не изменяла нативный размер (FSC) или гранулярность (SSC) БММК по сравнению с БММК, культивируемыми в отсутствие гидрогелевых субстратов с ЧПУ/агарозой/D-маннитолом (рисунок 3A(i), (ii)).
Другой важной характеристикой чернил биоматериала или культурального субстрата является то, что он должен обладать способностью поддерживать дифференцировку и фенотип клеток, которые он поддерживает. Двумя наиболее квинтэссенциальными биомаркерами тучных клеток являются высокоаффинный рецептор IgE, FcεRI, который облегчает ответы BMMC на антигены, и рецептор фактора стволовых клеток Kit (CD117), который необходим для выживания и дифференцировки тучных клеток. Зрелые тучные клетки определяются экспрессией этих двух поверхностных рецепторов, и для того, чтобы субстрат биочернил поддерживал их в культуре, он не должен существенно изменять экспрессию этих двух рецепторов. Субстрат с ЧПУ/агарозой/D-маннитолами, по-видимому, увеличивал экспрессию FcεRI и Kit при концентрациях ЧПУ ≥ 2,5% (рисунок 4A(iii),B(iii)). Интересно, что повышенные уровни экспрессии FcεRI и Kit оставались относительно стабильными между 2,5% и 12,5% ЧПУ, что свидетельствует об эффекте плато и предполагает эффект, который зависит не от концентрации ЧПУ, а от какого-либо другого параметра гидрогелевого композита.
3D-биопечатные биогелевые биоматериальные чернильные каркасы, полученные в этом исследовании, состоят из фибриллярной наноцеллюлозы (FNC) вместо кристаллической наноцеллюлозы и альгината натрия в качестве гелятора вместо агарозы. Фибриллярная наноцеллюлоза демонстрирует различные наноразмерные топографические особенности по сравнению с CNC17, которые, в дополнение к микромасштабной архитектуре 3D-биопечатных биогелевых биочернил FNC, потенциально могут повлиять на жизнеспособность BMMC. После 3D-биопечати и ионного сшивания каркасов биочернил FNC/alginate/D-mannitol (рисунок 6) BMMC культивировали либо отдельно, либо на 3D-биопечатных гидрогелевых каркасах в течение 6, 18, 24 и 48 ч, соответственно, для оценки динамических изменений жизнеспособности BMMC в ответ на каркасы FNC/alginate/D-mannitol, если таковые имеются, в течение длительных периодов времени. Анализ XTT показал, что метаболическая активность BMMMc, культивируемых на 3D-биопечатных гидрогелевых каркасах, оставалась относительно стабильной на уровне ~ 100% во всех тестируемых временных точках по сравнению с только КУЛЬТИвируемыми BMMC (рисунок 7A). Лизис клеток приводит к высвобождению ЛДГ в среду клеточного культивирования, которую анализ ЛДГ обнаруживает как функцию ее оксидоредуктивной ферментативной активности.
БММК, культивируемые на 3D-биопечатных гидрогелевых каркасах, демонстрировали постепенное зависящее от времени увеличение высвобождения ЛДГ по сравнению с БММК, культивируемыми только; однако эта тенденция имела незначительное стандартное отклонение менее 9% (рисунок 7B). Окрашивание PI BMMC, культивируемых на 3D-биопечатных гидрогелевых каркасах, не выявило существенных изменений в жизнеспособности по сравнению с BMMMc, культивируемыми отдельно в каждый момент времени (рисунок 7C). Примечательно, что МФО окрашенных PI BMMC, культивируемых на 3D-биопечатных гидрогелевых каркасах, оставались относительно последовательными (PI-MFI 7000) во всех временных точках и были аналогичны BC, культивируемым на субстратах С ЧПУ / агарозой / D-маннитом, которые демонстрировали последовательный PI-MFI 7000 во всех концентрациях ЧПУ (2,5-12,5%). В совокупности эти данные демонстрируют, что каркасы гидрогеля FNC/альгината/D-маннитола не оказывают негативного влияния на жизнеспособность BMMC.
Рисунок 1: Анатомия ноги мыши, изображающая большеберцовую и бедренную кости, из которых выделен костный мозг. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Получение гидрогелевого субстрата с ЧПУ/агарозой/D-маннитолом. (A) Схема протокола подготовки субстрата с ЧПУ/агарозой/D-маннитолом гидрогеля. (B) Препараты С ЧПУ/агарозы/D-маннитола (0, 1, 2,5, 5, 10 и 12,5% (мас./об.) ЧПУ в PBS/агарозе/D-маннитоле) загружали на 24-луночную пластину в четырехкратном виде, как показано на рисунке. Сокращения: PBS = фосфатно-буферный физиологический раствор; ЧПУ = кристаллическая наноцеллюлоза. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Проточный цитометрический анализ жизнеспособности BMMC путем исключения йодида пропидия после инкубации на субстратах С ЧПУ/агарозы/D-маннитола. БММК удаляли из гидрогелевых субстратов с ЧПУ/агарозой/D-маннитолом, промывали дважды, повторно суспендировали в ПБС-0,5% мас./об.БСА, окрашивали ПИ в течение 1 ч при 4°С и анализировали методом проточной цитометрии (n=4). В общей сложности было получено 20 000 клеток на образец, включая обнаружение флуоресцентного излучения PI в канале PE. Анализ данных проводился с использованием программного обеспечения для анализа проточной цитометрии. (A) Анализ диаграммы точечного рассеяния прямого рассеяния (ось X) по сравнению с боковым рассеянием (ось Y) из (i) необработанного контрольного BMMC (0% ЧПУ/агарозы/D-маннитола) и (ii) BMMC, культивируемых на 12,5% ЧПУ/агарозы/D-маннитола, с изображением закрытой клеточной популяции, используемой для анализа данных. (B) Гистограмма наложения профиля закрытых клеток (неокрашенных или окрашенных PI), из необработанных контрольных BMMC (0% ЧПУ/агароза/D-маннит) и BMMC, культивируемых на 12,5% ЧПУ/агарозы/D-маннита. (C) БММК культивировали на различных субстратах с ЧПУ/агарозой/D-маннитолами (1-12,5% (мас./об.) ЧПУ) в течение 18 ч, а жизнеспособность клеток определяли методом проточного цитометрического анализа PI-окрашенных клеток. Графическое представление МФУ ПИ для БММК, инкубированных на различных субстратах с ЧПУ/агарозой/D-маннитолами (1-12,5% (мас./об.) ЧПУ) по отношению к БММК, которые не были обработаны и окрашены ПИ. Сокращения: BMMCs = тучные клетки, полученные из костного мозга; ЧПУ = кристаллическая наноцеллюлоза; PBS = фосфатно-буферный физиологический раствор; BSA = бычий сывороточный альбумин; PI = йодид пропидия; ПЭ = фикоэритрин. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Проточный цитометрический анализ экспрессии fcεRI и Kit (CD117) клеточной поверхности рецептора. БММК культивировали либо в отсутствие, либо в присутствии субстратов С ЧПУ/агарозы/D-маннитола в течение 18 ч, удаляли и анализировали на экспрессию рецепторов. Данные являются репрезентативными для 4 реплик. Прямое рассеяние (ось X) против бокового рассеяния (ось Y) точечный график общей популяции клеток в необработанном образце BMMC (0% CNC/agarose/D-mannitol), окрашенный (A)(i) контрольным антителом изотипа-APC или (B)(i) контрольным антителом изотипа-PE, и закрытой клеточной популяцией, используемой для анализа данных. Гистограмма накладывает профили закрытых BMMMc (окрашенных антителом контроля изотипа или (A)(ii) анти-FcεRI-APC антителом или (B)(ii) анти-Kit-PE антителом), инкубированным либо отдельно (0% CNC/agarose/D-маннит), либо на 12,5% субстратов CNC/агарозы/D-маннитола. БММК культивировали в течение 18 ч на различных субстратах С ЧПУ/агарозы/D-маннитола (1-12,5% (мас./об.) ЧПУ) с последующим анализом экспрессии поверхности рецепторов FcεRI и Kit, соответственно, с помощью проточной цитометрии (n=4). Графическое представление МФУ БММК, окрашенных (A)(iii) анти-FcεRI-APC или (B)(iii) анти-Kit-PE антителами, соответственно, после культивирования на различных субстратах С ЧПУ/агарозы/D-маннитола (1-12,5% (мас./об.) ЧПУ) относительно клеток, которые не были обработаны (0% ЧПУ) и окрашены аналогичным образом. Сокращения: ЧПУ = кристаллическая наноцеллюлоза; APC = аллофикоцианин; ПЭ = фикоэритрин; BMMCs = тучные клетки, полученные из костного мозга; MFI = средняя интенсивность флуоресценции. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 5: Оборудование для 3D-биопринтера и расходные материалы, необходимые для биопечати 5 x 5 x 1 мм 2-слойных прямолинейных биочернил гидрогелевых лесов в формате пластины с 24 скважинами. (A)(i) Пневматический экструзионный 3D-биопринтер с положением сборки печатающей головки в положении покоя после завершения самонаведения его осей x-y-z . (А) ii) калибровка в начальной точке печатающей головки 1 с установленным картриджем биочернила и размещение печатного сопла непосредственно над серединой скважины D1 в размерах x-y-z . (А) iii) положение PH1 после калибровки по оси Z и давление экструзии PH1, установленное на уровне 12 кПа. (Б) i) картридж биочернил (3 мл), содержащий состав чернил биоматериала NFC/альгинат/D-маннитол. (Б) ii) капельный дозатор 50 мМ сшивающего раствора CaCl2 . (С) i) схематическое изображение печатного макета из файла G-кода, кодирующего печать 5 x 5 x 1 мм 2-слойных прямолинейных биочерниловых гидрогелевых лесов во всех скважинах пластины из 24 скважин. (С) ii) схематическое изображение печатного макета из файла G-кода, кодирующего печать 5 x 5 x 1 мм 2-слойных прямолинейных биочернилообразных гидрогелевых каркасов только в скважинах A1-3, B1-3, C1-3 и D1-3 24-луночной пластины. (С) (iii) Расширенный вид 5 x 5 x 1 мм 2-слойного прямолинейного биочернилого гидрогелевого каркаса в программе нарезки Slic3r. (Г) Вид сверху фактических 3D-биопечатных 5 x 5 x 1 мм 2-слойных прямолинейных биочерниловых гидрогелевых каркасов в формате 24-луночной пластины, погруженной в PBS. Сокращения: 3D = трехмерный; PH1 = печатающая головка 1; NFC = нанофибриллярная целлюлоза; G-код = геометрический код; PBS = фосфатно-буферный физиологический раствор. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 6: Принципиальная схема, изображающая рабочий процесс 3D-биопечати и культуры BMMC на каркасах гидрогеля FNC/альгината/D-маннитола. 3D-биопечать гидрогелевых лесов с помощью биочернила FNC/Alginate/D-mannitol из файла G-кода, кодирующего 5 x 5 x 1 мм 2-слойный рисунок сетки, сшивание гидрогелевых лесов с CaCl2 и культивирование BMMC на сшитых конструкциях гидрогеля FNC/Alginate/D-mannitol. Сокращения: 3D = трехмерный; 2D = двумерный; G-код = геометрический код; FNC = фибриллярная наноцеллюлоза; BMMCs = тучные клетки, полученные из костного мозга. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 7: Проточный цитометрический (PI) и микротитровый (XTT и LDH) анализы жизнеспособности BMMC после инкубации на каркасах FNC/альгината/D-маннитола. (A) Данные метаболического анализа пролиферации клеток (XTT) для BMMMc, культивируемые на субстратах биочернил FNC/Alginate/D-mannitol в течение 6, 18, 24 и 48 ч соответственно. Значения представлены в процентах от метаболических данных XTT для BMMMc, культивируемых отдельно в течение 6, 18, 24 и 48 ч, соответственно. Полосы погрешностей указывают на стандартное отклонение (n=3). (B) Данные анализа высвобождения ферментов ЛДГ для БММК, культивируемых на каркасах биочернил FNC/Альгината/D-маннитола в течение 6, 18, 24 и 48 ч, соответственно. Значения представлены в виде сгибообразных изменений относительно фермента ЛДГ, высвобождаемого ТОЛЬКО БММК, культивируемыми в течение 6, 18, 24 и 48 ч соответственно. Полосы погрешностей указывают на стандартное отклонение (n=3). (C) Проточные цитометрические данные окрашенных PI BMMC, которые культивировались либо отдельно, либо на каркасах биочернил FNC/Alginate/D-mannitol в течение 6, 18, 24 и 48 ч, соответственно. Полосы погрешностей указывают на стандартное отклонение (n=3). Сокращения: LDH = лактатдегидрогеназа; BMMCs = тучные клетки, полученные из костного мозга; FNC = фибриллярная наноцеллюлоза; PI = йодид пропидия; MFI = средняя интенсивность флуоресценции. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
| 1.1.1. Бутылка RPMI объемом 500 мл (HyClone, GE Healthcare, США) |
| 1.1.2. 4 мМ L-глютамин (Gibco, Waltham Massachusetts, США) |
| 1.1.3. 50 мМ β-меркаптоэтанола (Fisher Scientific, Хэмптон, Нью-Гэмпшир, США) |
| 1.1.4. 1 мМ Пируват натрия (Gibco) |
| 1.1.5. 100 ЕД/мл пенициллина (Gibco) |
| 1.1.6. 100 мкг/мл стрептомицина (Gibco) |
| 1.1.7. 0,1 мМ MEM заменимых аминокислот (Gibco) |
| 1.1.8. 25 мМ HEPES (Фишер) |
| 1.1.9. 10% инактивированный теплом FBS (Gibco) |
| 1.1.10. 30 нг/мл мышиный рекомбинантный IL-3 (Peprotech, Rocky Hill, New Jersey, США) |
Таблица 1: Полные добавки rpmI-1640.
Дополнительный файл 1. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Дополнительный файл 2. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Дополнительный файл 3. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Изготовление 3D-биомиметических тканей требует успешного объединения биочернила, который имитирует компоненты внеклеточного матрикса, с клеточным компонентом (компонентами) для создания физиологических аналогов тканей in vivo . Это обусловливает необходимость использования первичных клеток, а не трансформированных клеток, при изготовлении физиологических биомиметических тканей. Первичные иммунологические клетки, такие как тучные клетки, однако, особенно восприимчивы к цитотоксическим эффектам и фенотипическим изменениям, которые могут быть вызваны самой матрицей биочернил, что нежелательно. Поэтому способность быстро оценивать влияние чернил-кандидатов биоматериала на жизнеспособность и фенотип (экспрессию поверхностных рецепторов) тучных клеток является весьма выгодной, особенно до 3D-биопечати сложных тканей, содержащих различные типы клеток, встроенных в матрицу биочернила, что является дорогостоящим и трудоемким.
Подход этого протокола включает культивирование BMMC, пример первичных тучных клеток, на поверхности предварительно сформированных субстратов биочернила-кандидата (1-12,5% ЧПУ, встроенных в агарозу), что позволяет легко извлекать BMMC для последующего анализа жизнеспособности клеток и экспрессии поверхностных рецепторов с помощью проточной цитометрии. Выделение костного мозга из бедренной и большеберцовой костей мыши требует точности и внимания к деталям из-за хрупкости и небольших размеров этих костей. После успешного выделения и осаждения костного мозга в клеточную культуральную среду важно поддерживать клеточную культуру с рекомбинантным IL-3 3 3 нг /мл непрерывно в течение 4 недель, что обеспечивает устойчивую стимуляцию для дифференцировки кроветворных клеток-предшественников в тучные клетки, которые являются двойными положительными для рецепторов клеточной поверхности Kit (CD117) и FcεRI.
Проточный цитометрический анализ тучных клеток для поверхностной экспрессии рецепторов Kit (CD117) и FcεRI должен использовать контроль антител изотипа для оказания помощи в дифференцировке неспецифического фонового сигнала от специфических сигналов антител, используемых для нацеливания на эти рецепторы, как показано на рисунке 4A(ii),B(ii). Также важно использовать четко определенную популяцию тучных клеток, чтобы исключить клеточный мусор, как показано на рисунке 4A(i) и 4B(i),которые также могут неспецифически связывать антитела. Щадящее микропипетирование следует использовать при извлечении BMMC с поверхности биочерниловых гидрогелевых субстратов для уменьшения сил сдвига, оказываемых на клетки, которые могут повредить клеточную мембрану и привести к искусственно повышенному окрашиванию PI. ОКРАШЕННЫЕ PI BMMC должны быть проанализированы методом проточной цитометрии сразу после окончания инкубационного периода окрашивания, поскольку окрашивающая среда PI, основанная на PBS-0,5% мас./v BSA, не предназначена для поддержания клеток в течение длительных периодов времени вне среды клеточной культуры. Поскольку PI пронизывает только клетки с скомпрометированными клеточными мембранами, он способен окрашивать некротические клетки с высокой селективностью и чувствительностью. Однако PI не может обнаружить апоптотические клетки, которые поддерживают неповрежденные клеточные мембраны.
Цитометрический анализ потока PI-исключения, описанный в настоящем протоколе, может быть дополнен изотиоцианатом аннексина-V-флуоресцеина (FITC), который специфически связывается с фосфолипидом, фосфатидилсерином, который транслоцируется на внешний листок клеточной мембраны апоптотических клеток. Однако компенсация необходима для учета просачивания флуоресцентного излучения ФИТК в канал детектора, используемый для получения флуоресцентного излучения от PI, и наоборот. При подготовке биопринтера для 3D-биопечати из предоставленной 24-луночной пластины G-кода важно, чтобы калибровка начальной точки была выполнена точно, в результате чего регистрируются координаты x и y центра скважины D1, а файл G-кода обновляется этими координатами x и y на строке 1. Если эти начальные этапы калибровки выполнены не точно, печатающие головки не переместятся в правильную начальную точку в начале печати. Правильная калибровка оси Z не менее важна, поскольку невыполнение этого требования может привести к столкновению сопла печатающей головки с печатной кроватью или 24-луночной пластиной в начале печати.
Принципиальная схема 2-слойной прямолинейной сетки размером 5 x 5 x 1 мм (рисунок 5C(iii)) иллюстрирует наличие пор между экструдированными нитями биочернила, образующими подложку. Размер пор и диаметр нитей зависят от трех параметров: (i) скорости перемещения печатного сопла, (ii) давления экструзии, приложенного к биочернилу внутри картриджа, и (iii) диаметра печатного сопла. Биочернила с большим диаметром нити накала и небольшими порами могут быть напечатаны с использованием более медленной скорости печати, более высокого давления экструзии (>12 кПа) и сопла печати большего диаметра (22 Г). И наоборот, более высокая скорость печати сопла, более низкое давление экструзии (<12 кПа) и сопло для печати меньшего диаметра (27 Г) приведут к созданию подложек с более тонкими нитями и большими порами. Однако недостаточно высокое давление экструзии приведет к тому, что вместо непрерывных нитей будут экструдироваться непоследовательные сгустки биочернила, что отрицательно скажется на качестве и структурной целостности 3D-биопечатной подложки.
Биочернило-кандидат с ЧПУ/агарозой/D-маннитолом, представленное в этом протоколе, подвергается термическому гелеобразованию, когда агароза охлаждается до комнатной температуры. Напротив, коммерческий биочернила, используемый для 3D-биопечати в этом протоколе, подвергается ионному сшиванию с CaCl2 из-за включения альгината натрия в состав биочернила. Поэтому необходимо погружать биопечатные каркасы FNC/alginate/D-mannitol в раствор CaCl2 объемом 50 мМ после биопечати, чтобы облегчить сшивание (гелеобразование) субстрата. Пропуск стадии ионного сшивания с CaCl2 приведет к растворению каркасов FNC/альгината/D-маннитола при их погружении в питательную среду клеток. Основным ограничением состава биочернил с ЧПУ/агарозой/D-маннитолом при его применении в фактической 3D-биопечати является исключительно высокая температура плавления агарозы (90-95 °C). Несмотря на то, что печатающие головки 3D-биопринтера, используемого в этом исследовании, могут достигать максимальной температуры 130 ° C, экструдированные нити С ЧПУ / агарозы / D-маннитола, вероятно, будут быстро рассеиваться по мере печати последовательных слоев для построения подложки. Это ограничение биочернила с ЧПУ/агарозой/D-маннитолом можно обойти либо путем печати биочернила с ЧПУ/агарозы/D-маннитола непосредственно на охлаждаемой печатной ленте для ускорения гелеобразования, либо путем замены агарозы альгинатом натрия, который может быть экструдирован при комнатной температуре и подвергается быстрому сшиванию ионной сшивки с 50 мМ CaCl2 в течение 5 мин.
Этот протокол предлагает надежный подход к быстрому скринингу и исключению составов биочернил, которые демонстрируют плохую биохимическую совместимость с чувствительными иммунологическими клетками, такими как тучные клетки, которые не должны подвергаться пневматической экструзии 3D-биопечати. Кроме того, этот протокол является экономически эффективным, поскольку он требует относительно небольшого количества клеток для выполнения мультиплексированного скринингового анализа. Напротив, предварительно составленные биочернило-клеточные смеси должны быть биопечатаны при очень высокой плотности клеток (>107 клеток / мл), что может оказаться дорогостоящим и трудоемким для выполнения скринингового анализа биосовместимости, особенно при культивировании первичных клеток, которые зависят от дорогостоящих рекомбинантных факторов роста.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Эта работа была поддержана Национальным исследовательским советом Канады и Alberta Innovates.
Acknowledgments
Мы благодарим Alberta Innovates за предоставление ЧПУ, а также Кена Харриса и Дже-Янг Чо за их технические консультации при подготовке матрицы CNC/agarose/D-mannitol. Мы также благодарим Бена Хоффмана, Хизер Уинчелл и Николь Диамантидес за их технические консультации и поддержку в настройке и калибровке 3D-биопринтера INKREDIBLE+.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| A | |||
| Acetic Acid (glacial) | Sigma Aldrich | AX0074-6 | |
| Agarose (OmniPur) | EMD Millipore Corporation | 2125-500GM | |
| Armenian Hamster IgG Isotype Control, APC (Clone: eBio299Arm) | Thermo Fisher Scientific | 17-4888-82 | |
| B | |||
| b-Mercaptoethanol | Fisher Scientific | O3446I-100 | |
| b-Nicotinamide adenine dinucleotide sodium salt (NAD) | Sigma Aldrich | N0632-5G | |
| BD 5 mL Syringe (Luer-Lok Tip) | BD | 309646 | |
| BD PrecisionGlide Needle 26G x 1/2 in | BD | 305111 | |
| BioLite 24 Well Multidish | Thermo Fisher Scientific | 930-186 | |
| BioLite 96 Well Multidish | Thermo Fisher Scientific | 130-188 | |
| BioLite 175 cm2 Flask Vented | Thermo Fisher Scientific | 130-191 | |
| Biosafety Cabinet Class II | Microzone Corp., Canada | BK-2-6-B3 | |
| BSA, Fraction V (OmniPur) | EMD Millipore Corporation | 2930-100GM | |
| C | |||
| C57BL/6 mice | The Jackson Laboratory | 000664 | |
| CD117 (c-Kit) Monoclonal Antibody, PE (Clone: 2B8) | Thermo Fisher Scientific | 12-1171-82 | |
| CELLINK BIOINK (3 x 3 mL Cartridge) | CELLINK LLC | IK1020000303 | |
| CELLINK CaCl2 Crosslinking Agent - Sterile Bottle 1 x 60 mL | CELLINK LLC | CL1010006001 | |
| CELLINK Empty Cartridges 3cc with End and Tip Caps | CELLINK LLC | CSC0103000102 | |
| CELLINK HeartWare for PC | CELLINK LLC | Version 2.4.1 | |
| CELLINK INKREDIBLE+ 3D BIOPRINTER | CELLINK LLC | S-10003-001 | |
| CELLINK Sterile Standard Conical Bioprinting Nozzles 22G | CELLINK LLC | NZ4220005001 | |
| CELLINK Sterile Standard Conical Bioprinting Nozzles 25G | CELLINK LLC | NZ4250005001 | |
| CELLINK Sterile Standard Conical Bioprinting Nozzles 27G | CELLINK LLC | NZ4270005001 | |
| Cell Proliferation Kit II (XTT) (Roche) | Sigma Aldrich | 11465015001 | |
| Centrifuge (Benchtop) | Eppendorf | 5804R | |
| Corning Costar 96 Well Clear Flat-Bottom Non-Treated PS Microplate | Sigma Aldrich | CLS3370 | |
| CO2 Incubator | Binder GmbH, Germany | 9040-0113 | |
| CytoFLEX Flow Cytometer | Beckman Coulter | A00-1-1102 | |
| D | |||
| D-mannitol (MilliporeSigma Calbiochem) | Fisher Scientific | 44-390-7100GM | |
| F | |||
| Falcon 15 mL Polystyrene Conical Tubes, Sterile | Corning | 352095 | |
| Falcon 50 mL Polystyrene Conical Tubes, Sterile | Corning | 352070 | |
| FceR1 alpha Monoclonal Antibody, APC (Clone: MAR-1) | Thermo Fisher Scientific | 17-5898-82 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS), qualified, heat inactivated | Thermo Fisher Scientific | 12484028 | |
| FlowJo Software | Becton Dickinson & Co. USA | Version 10.6.2 | |
| G | |||
| GraphPad Prism | GraphPad Software, LLC | Version 8.4.3 | |
| H | |||
| Hemacytometer (Improved Neubauer 0.1 mmm deep levy) | VWR | 15170-208 | |
| HEPES Sodium Salt | Fisher Scientific | BP410-500 | |
| I | |||
| Iodonitrotetrazolium chloride (INT) | Sigma Aldrich | I10406-5G | |
| L | |||
| L-Glutamine 200 mM (Gibco) | Thermo Fisher Scientific | 25030-081 | |
| Lithium L-lactate | Sigma Aldrich | L2250-100G | |
| M | |||
| MEM Non-Essential Amino Acids 100 mL 100x (Gibco) | Thermo Fisher Scientific | 11140-050 | |
| 1-Methoxy-5-methylphenazinium methyl sulfate (MPMS) | Sigma Aldrich | M8640 | |
| Microtubes (1.7 mL clear) | Axygen | MCT-175-C | |
| Microtubes (2.0 mL clear) | Axygen | MCT-200-C | |
| MilliQ Academic (for producing MilliQ ultrapure water) | Millipore | ZMQS60001 | |
| N | |||
| Nalgene Rapid-Flow 90 mm Filter Unit (0.2 mm Pore size, 500 mL) | Thermo Fisher Scientific | 566-0020 | |
| Nalgene Syringe filter (0.2 mm PES, 25 mm) | Thermo Fisher Scientific | 725-2520 | |
| P | |||
| Penicillin Streptomycin 100 mL (Gibco) | Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | |
| PBS pH 7.4, No Calcium/Magnesium, 500 mL (Gibco) | Thermo Fisher Scientific | 10010-023 | |
| Propidium iodide, 1.0 mg/mL (Invitrogen) | Thermo Fisher Scientific | P3566 | |
| R | |||
| Rat IgG2b kappa Isotype Control, PE (Clone: eB149/10H5) | Thermo Fisher Scientific | 12-4031-82 | |
| Recombinant Murine IL-3 | PeproTech, Inc. | 213-13 | |
| RPMI-1640 Medium 1X + 2.05 mM L-Glutamine (HyClone) | GE Healthcare | SH30027.01 | |
| S | |||
| Sarstedt 96 well round base PS transparent micro test plate (82.1582.001) | Fisher Scientific | NC9913213 | |
| Sodium Azide, 500 g | Fisher Scientific | BP922I-500 | |
| Sodium Pyruvate (100 mM) 100X (Gibco) | Thermo Fisher Scientific | 11360-070 | |
| T | |||
| Tris Base (2-amino-2(hydroxymethyl)-1,3-propanediol) | Sigma Aldrich | 252859 | |
| Trypan Blue solution (0.4%, for microscopy) | Sigma Aldrich | 93595 | |
| V | |||
| VARIOSKAN LUX Microplate Spectrophotometer (Type: 3020) | Thermo Fisher Scientific | VLBL00D0 |
References
- Tibbitt, M. W., Anseth, K. S. Hydrogels as extracellular matrix mimics for 3D cell culture. Biotechnology and Bioengineering. 103 (4), 655-663 (2009).
- Drury, J. L., Mooney, D. J. Hydrogels for tissue engineering: Scaffold design variables and applications. Biomaterials. 24 (24), 4337-4351 (2003).
- Lee, K. Y., Mooney, D. J.
- Halib, N., Ahmad, I. Nanocellulose: Insight into health and medical applications. Handbook of Ecomaterials. , Springer. Cham. 1345-1363 (2019).
- Alonso-Lerma, B., et al. High performance crystalline nanocellulose using an ancestral endoglucanase. Communications Materials. 1 (1), 57 (2020).
- Tummala, G. K., Lopes, V. R., Mihranyan, A., Ferraz, N. Biocompatibility of nanocellulose-reinforced PVA hydrogel with human corneal epithelial cells for ophthalmic applications. Journal of Functional Biomaterials. 10 (3), 35 (2019).
- Fey, C., et al. Bacterial nanocellulose as novel carrier for intestinal epithelial cells in drug delivery studies. Materials Science and Engineering: C. 109, 110613 (2020).
- Ojansivu, M., et al. Wood-based nanocellulose and bioactive glass modified gelatin-alginate bioinks for 3D bioprinting of bone cells. Biofabrication. 11 (3), 035010 (2019).
- Jonsson, M., et al. Neuronal networks on nanocellulose scaffolds. Tissue Engineering Part C: Methods. 21 (11), 1162-1170 (2015).
- Samulin Erdem, J., et al. Cellulose nanocrystals modulate alveolar macrophage phenotype and phagocytic function. Biomaterials. 203, 31-42 (2019).
- Menas, A. L., et al. Fibrillar vs crystalline nanocellulose pulmonary epithelial cell responses: Cytotoxicity or inflammation. Chemosphere. 171, 671-680 (2017).
- Halova, I., Draberova, L., Draber, P. Mast cell chemotaxis chemoattractants and signaling pathways. Frontiers in Immunology. 3, 1-19 (2012).
- Groll, J., et al. A definition of bioinks and their distinction from biomaterial inks. Biofabrication. 11 (1), 013001 (2019).
- Schwab, A., et al. Printability and shape fidelity of bioinks in 3D bioprinting. Chemical Reviews. 120 (19), 11028-11055 (2020).
- Jungst, T., Smolan, W., Schacht, K., Scheibel, T., Groll, J. Strategies and molecular design criteria for 3D printable hydrogels. Chemical reviews. 116 (3), 1496-1539 (2016).
- Sasaki, D. T., Dumas, S. E., Engleman, E. G. Discrimination of viable and non-viable cells using propidium iodide in two color immunofluorescence. Cytometry. 8 (4), 413-420 (1987).
- Usov, I., et al. Understanding nanocellulose chirality and structure-properties relationship at the single fibril level. Nature Communications. 6 (1), 7564 (2015).
