Fabrikation af en krystallinsk nanocellulose Indlejret Agarose Biomaterial Ink til knoglemarvs-afledt mast cellekultur
Summary
Denne protokol fremhæver en metode til hurtigt at vurdere biokompatibiliteten af en krystallinsk nanocellulose (CNC)/agarose komposit hydrogel biomateriale blæk med mus knoglemarvs-afledt mastceller i form af celle levedygtighed og fænotypiske udtryk for celleoverfladen receptorer, Kit (CD117) og høj affinitet IgE receptor (FcεRI).
Abstract
Tredimensionel (3D) bioprint udnytter hydrogelbaserede kompositter (eller biomateriale blæk), der deponeres i et mønster og danner et substrat, hvorpå celler deponeres. Fordi mange biomateriale blæk kan være potentielt cytotoksiske til primære celler, er det nødvendigt at bestemme biokompatibiliteten af disse hydrogel kompositter forud for deres udnyttelse i dyre 3D-væv engineering processer. Nogle 3D-kulturmetoder, herunder bioprint, kræver, at celler indlejres i en 3D-matrix, hvilket gør det vanskeligt at udtrække og analysere cellerne for ændringer i levedygtighed og biomarkørudtryk uden at fremkalde mekanisk skade. Denne protokol beskriver som proof of concept, en metode til at vurdere biokompatibiliteten af en krystallinsk nanocellulose (CNC) indlejret agarosekomposit, fremstillet i et 24-brønds kultursystem med musebenmarvsbaserede mastceller (BMMCs) ved hjælp af flowcytometriske analyser for celle levedygtighed og biomarkørudtryk.
Efter 18 timers eksponering for CNC/agarose/D-mannitolmatrixen blev BMMC’s levedygtighed uændret målt ved propidiumidodi (PI) permeabilitet. BMMCs, der dyrkes på CNC/agarose/D-mannitolsubstratet , syntes imidlertid at øge deres udtryk for den høje affinitets-IgE-receptor (FcεRI) og stamcellefaktorreceptoren (Kit; CD117), selv om dette ikke synes at være afhængig af mængden af CNC i bioink komposit. BMMCs’ levedygtighed blev også vurderet efter et tidsinterval, der blev udsat for hydrogel-stilladser, der var fremstillet af et kommercielt biomaterialeblæk bestående af fibrillar nanocellulose (FNC) og natriumalginat ved hjælp af en 3D-ekstruderingsbioprinter. I en periode på 6-48 timer påvirkede FNC/alginatsubstraterne ikke BMCCs levedygtighed negativt som bestemt af flowcytometri- og mikrotiteranalyser (XTT- og laktatdehydrogenase). Denne protokol beskriver en effektiv metode til hurtigt at screene den biokemiske kompatibilitet af kandidat biomateriale blæk for deres nytte som 3D stilladser til post-print såning med mast celler.
Introduction
Den seneste interesse for 3D-kultursystemer og 3D bioprinting har fokuseret opmærksomheden på hydrogels og hydrogelkompositter. Disse kompositter tjener som tyktflydende endnu porøse biomimetik og kan bestå af op til 99% vandindhold efter vægt, hvilket kan sammenlignes med biologisk væv1,2,3. Disse træk ved hydrogel kompositter dermed tillade vækst af celler uden at påvirke deres levedygtighed og funktion. En sådan komposit er krystallinsk nanocellulose (CNC), som er blevet brugt som et forstærkende materiale i hydrogel kompositter, celle stilladser i udviklingen af biomateriale implantater, og i to-dimensionelle (2D) og 3D in vitro celle kultur4,5. For det meste er matricer bestående af CNC ikke åbenlyst cytotoksiske til menneskelige hornhinde epitelceller6, intestinale epitelceller7, menneskelige knoglemarvsbaserede mesenkymale stamceller8 eller neuronlignende celler9. Metabolisk aktivitet og spredning af menneskelige knoglemarvsbaserede mesenkymale stamceller falder imidlertid i sammenhæng med den øgede viskositet af træbaserede nanocellulosekompositter, hvilket tyder på, at matrixens sammensætning skal testes omhyggeligt for dens skadelige virkninger på cellefunktioner8.
På samme måde kan CNC fremkalde inflammatoriske reaktioner i makrofager ved internalisering, hvilket kan have alvorlige konsekvenser i 3D immuncellekultursystemer10,11. Faktisk er der meget få data tilgængelige om, hvordan CNC kan påvirke andre immuncelleresponser, især allergiske inflammatoriske reaktioner, der er initieret af mastceller. Mastceller er granulerede leukocytter, der udtrykker den høje affinitet IgE receptor, FceRI, ansvarlig for aktivering inflammatoriske reaktioner på allergener. Deres spredning og differentiering er afhængige af stamcellefaktor (SCF), som binder tyrosin receptor, Kit. Mastceller er afledt af knoglemarvs stamfader celler, der kommer ind i cirkulationen og efterfølgende migrere perifert at sprede allestedsnærværende i alle menneskelige væv12. Da mastceller fungerer i et 3D-vævsmiljø, er de en ideel immuncellekandidat til at studere immunologiske processer i in vitro 3D-vævsmodeller. Til dato er der dog ingen levedygtig in vitro 3D-vævsmodel, der indeholder mastceller.
På grund af mastcellernes meget følsomme karakter og deres tilbøjelighed til at fremkalde proinflammatoriske reaktioner på eksterne stimuli kræves omhyggelig overvejelse af 3D-matrixbestanddelene og bioprintmetoden til at introducere mastceller i 3D-stilladset, som diskuteret yderligere. Vævskonstruktioner kan biofabrikeres fra to brede kategorier af biomaterialer, dvs. bioinks og biomateriale blæk. Sondringen ligger i, at bioinks er cellebelastede hydrogelkompositter, mens biomateriale blæk er hydrogelkompositter, der er blottet for celler, som defineret af Groll et al.13,14. Derfor indeholder 3D-konstruktioner trykt med bioinks celler, der er indlejret i hydrogelmatrixen, mens 3D-konstruktioner trykt med biomaterialefarver skal sås med celler efter udskrivning. Biofabrication af kultur stilladser fra hydrogel-baserede bioinks / biomateriale blæk er oftest udføres ved hjælp af ekstrudering 3D bioprintere, som ekstruderer bioink / biomateriale blæk gennem en mikroskala dyse under tryk via enten en pneumatically eller mekanisk drevet stempel14. Ekstrudering bioprintere fabrikerer 3D-stilladser ved at deponere bioinken i 2D-tværsnitsmønstre, der sekventielt stables på hinanden i en ‘bottom-up’-tilgang.
For at være kompatibel med ekstruderingsbioprinting skal den hydrogelbaserede bioink/biomaterialeblæk have thixotrope (forskydningsfortyndende) egenskaber, hvorved bioink/biomaterialeblæks konstituerende hydrogelpolymmer flyder som en væske gennem en mikrokanaldyse, når de udsættes for forskydningsstress, men vender tilbage til en tyktflydende gellignende tilstand ved fjernelse af forskydningsstress15 . På grund af deres høje vandindhold skal polymererne af hydrogelbaserede bioinks/biomaterialeblæk være krydslinket, enten fysisk eller kovalent, for at opretholde arkitekturen og den strukturelle integritet af den bioprintede struktur med 3D-bioprintet. I tilfælde af cellebelastede bioinks udsættes cellerne direkte for kemiske belastninger under krydslinkprocessen. Processen med ekstrudering af celler indkapslet i bioink hydrogel matrix også udsætter cellerne for at forskyde stress, hvilket kan føre til nedsat levedygtighed og / eller celledød. Når 3D-vævsmodellen er blevet bioprintet, er det vanskeligt at skelne mellem de niveauer af cytotoksicitet fremkaldt af hydrogelmatrixen selv og ekstruderings- og krydslinkingsprocesserne. Dette er især udfordrende i forbindelse med 3D-stilladser, hvor cellerne er indlejret i hydrogelmatrixen, hvilket gør det vanskeligt at fjerne cellerne til efterfølgende analyser, hvilket ville være skadeligt for mastcellernes levedygtighed.
En blidere tilgang til generering af 3D-vævskonstruktioner, der indeholder mastceller, indebærer såning af cellerne i fortrykt, porøs biomaterialeblæk 3D-stilladser fra en cellekulturophængning, hvilket udnytter mastcellernes medfødte evne til at migrere fra cirkulationen til perifert væv. Fordelene ved denne cellesåningsmetode er dobbelt: (i) mastcellerne udsættes ikke for forskydning og kemiske belastninger fra henholdsvis ekstruderings- og krydslinkingsprocesserne, og (ii) cellerne let kan fjernes fra 3D-stilladset efter eksponering ved skånsom vask til analyse uden at påvirke deres levedygtighed negativt. Den yderligere fordel ved såning og analyse af mastcellernes celle levedygtighed på 3D bioprintede, porøse hydrogel stilladser i modsætning til 2D hydrogelskiver er, at 3D bioprintede hydrogel stilladser generobrer mikroskala topografiske træk ved in vivovæv , som ikke er til stede i bulk, 2D planar hydrogel diske. Denne tilgang er en passende, hurtig og omkostningseffektiv tilgang til at bestemme de potentielt katastrofale cytotoksiske virkninger af kandidat bioink hydrogel matricer på mastceller, samt andre immunologiske celler, forud for investeringer i dyre 3D væv engineering eksperimenter.
Protocol
Representative Results
Discussion
Fremstillingen af 3D biomimetiske væv kræver en vellykket sammenlægning af bioinken, som efterligner komponenter i den ekstracellulære matrix, med den eller de cellulære komponenter for at skabe fysiologiske analoger af in vivovæv . Dette kræver brug af primære celler, og ikke omdannes celler, når der fremstilles fysiologiske biomimetiske væv. Primære immunologiske celler, såsom mastceller, er imidlertid særligt modtagelige for cytotoksiske virkninger og fænotypiske ændringer, der kan fremkaldes a…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker Alberta Innovates for at levere CNC og Ken Harris og Jae-Young Cho for deres tekniske rådgivning, når de forbereder CNC / agarose / D-mannitol matrix. Vi takker også Ben Hoffman, Heather Winchell og Nicole Diamantides for deres tekniske rådgivning og support med opsætning og kalibrering af INKREDIBLE + 3D bioprinter.
Materials
| A | |||
| Acetic Acid (glacial) | Sigma Aldrich | AX0074-6 | |
| Agarose (OmniPur) | EMD Millipore Corporation | 2125-500GM | |
| Armenian Hamster IgG Isotype Control, APC (Clone: eBio299Arm) | Thermo Fisher Scientific | 17-4888-82 | |
| B | |||
| b-Mercaptoethanol | Fisher Scientific | O3446I-100 | |
| b-Nicotinamide adenine dinucleotide sodium salt (NAD) | Sigma Aldrich | N0632-5G | |
| BD 5 mL Syringe (Luer-Lok Tip) | BD | 309646 | |
| BD PrecisionGlide Needle 26G x 1/2 in | BD | 305111 | |
| BioLite 24 Well Multidish | Thermo Fisher Scientific | 930-186 | |
| BioLite 96 Well Multidish | Thermo Fisher Scientific | 130-188 | |
| BioLite 175 cm2 Flask Vented | Thermo Fisher Scientific | 130-191 | |
| Biosafety Cabinet Class II | Microzone Corp., Canada | BK-2-6-B3 | |
| BSA, Fraction V (OmniPur) | EMD Millipore Corporation | 2930-100GM | |
| C | |||
| C57BL/6 mice | The Jackson Laboratory | 000664 | |
| CD117 (c-Kit) Monoclonal Antibody, PE (Clone: 2B8) | Thermo Fisher Scientific | 12-1171-82 | |
| CELLINK BIOINK (3 x 3 mL Cartridge) | CELLINK LLC | IK1020000303 | |
| CELLINK CaCl2 Crosslinking Agent – Sterile Bottle 1 x 60 mL | CELLINK LLC | CL1010006001 | |
| CELLINK Empty Cartridges 3cc with End and Tip Caps | CELLINK LLC | CSC0103000102 | |
| CELLINK HeartWare for PC | CELLINK LLC | Version 2.4.1 | |
| CELLINK INKREDIBLE+ 3D BIOPRINTER | CELLINK LLC | S-10003-001 | |
| CELLINK Sterile Standard Conical Bioprinting Nozzles 22G | CELLINK LLC | NZ4220005001 | |
| CELLINK Sterile Standard Conical Bioprinting Nozzles 25G | CELLINK LLC | NZ4250005001 | |
| CELLINK Sterile Standard Conical Bioprinting Nozzles 27G | CELLINK LLC | NZ4270005001 | |
| Cell Proliferation Kit II (XTT) (Roche) | Sigma Aldrich | 11465015001 | |
| Centrifuge (Benchtop) | Eppendorf | 5804R | |
| Corning Costar 96 Well Clear Flat-Bottom Non-Treated PS Microplate | Sigma Aldrich | CLS3370 | |
| CO2 Incubator | Binder GmbH, Germany | 9040-0113 | |
| CytoFLEX Flow Cytometer | Beckman Coulter | A00-1-1102 | |
| D | |||
| D-mannitol (MilliporeSigma Calbiochem) | Fisher Scientific | 44-390-7100GM | |
| F | |||
| Falcon 15 mL Polystyrene Conical Tubes, Sterile | Corning | 352095 | |
| Falcon 50 mL Polystyrene Conical Tubes, Sterile | Corning | 352070 | |
| FceR1 alpha Monoclonal Antibody, APC (Clone: MAR-1) | Thermo Fisher Scientific | 17-5898-82 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS), qualified, heat inactivated | Thermo Fisher Scientific | 12484028 | |
| FlowJo Software | Becton Dickinson & Co. USA | Version 10.6.2 | |
| G | |||
| GraphPad Prism | GraphPad Software, LLC | Version 8.4.3 | |
| H | |||
| Hemacytometer (Improved Neubauer 0.1 mmm deep levy) | VWR | 15170-208 | |
| HEPES Sodium Salt | Fisher Scientific | BP410-500 | |
| I | |||
| Iodonitrotetrazolium chloride (INT) | Sigma Aldrich | I10406-5G | |
| L | |||
| L-Glutamine 200 mM (Gibco) | Thermo Fisher Scientific | 25030-081 | |
| Lithium L-lactate | Sigma Aldrich | L2250-100G | |
| M | |||
| MEM Non-Essential Amino Acids 100 mL 100x (Gibco) | Thermo Fisher Scientific | 11140-050 | |
| 1-Methoxy-5-methylphenazinium methyl sulfate (MPMS) | Sigma Aldrich | M8640 | |
| Microtubes (1.7 mL clear) | Axygen | MCT-175-C | |
| Microtubes (2.0 mL clear) | Axygen | MCT-200-C | |
| MilliQ Academic (for producing MilliQ ultrapure water) | Millipore | ZMQS60001 | |
| N | |||
| Nalgene Rapid-Flow 90 mm Filter Unit (0.2 mm Pore size, 500 mL) | Thermo Fisher Scientific | 566-0020 | |
| Nalgene Syringe filter (0.2 mm PES, 25 mm) | Thermo Fisher Scientific | 725-2520 | |
| P | |||
| Penicillin Streptomycin 100 mL (Gibco) | Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | |
| PBS pH 7.4, No Calcium/Magnesium, 500 mL (Gibco) | Thermo Fisher Scientific | 10010-023 | |
| Propidium iodide, 1.0 mg/mL (Invitrogen) | Thermo Fisher Scientific | P3566 | |
| R | |||
| Rat IgG2b kappa Isotype Control, PE (Clone: eB149/10H5) | Thermo Fisher Scientific | 12-4031-82 | |
| Recombinant Murine IL-3 | PeproTech, Inc. | 213-13 | |
| RPMI-1640 Medium 1X + 2.05 mM L-Glutamine (HyClone) | GE Healthcare | SH30027.01 | |
| S | |||
| Sarstedt 96 well round base PS transparent micro test plate (82.1582.001) | Fisher Scientific | NC9913213 | |
| Sodium Azide, 500 g | Fisher Scientific | BP922I-500 | |
| Sodium Pyruvate (100 mM) 100X (Gibco) | Thermo Fisher Scientific | 11360-070 | |
| T | |||
| Tris Base (2-amino-2(hydroxymethyl)-1,3-propanediol) | Sigma Aldrich | 252859 | |
| Trypan Blue solution (0.4%, for microscopy) | Sigma Aldrich | 93595 | |
| V | |||
| VARIOSKAN LUX Microplate Spectrophotometer (Type: 3020) | Thermo Fisher Scientific | VLBL00D0 |
References
- Tibbitt, M. W., Anseth, K. S. Hydrogels as extracellular matrix mimics for 3D cell culture. Biotechnology and Bioengineering. 103 (4), 655-663 (2009).
- Drury, J. L., Mooney, D. J. Hydrogels for tissue engineering: Scaffold design variables and applications. Biomaterials. 24 (24), 4337-4351 (2003).
- Lee, K. Y., Mooney, D. J. Hydrogels for tissue engineering. Chemical Reviews. 101 (7), 1869-1879 (2001).
- Halib, N., Ahmad, I. Nanocellulose: Insight into health and medical applications. Handbook of Ecomaterials. , 1345-1363 (2019).
- Alonso-Lerma, B., et al. High performance crystalline nanocellulose using an ancestral endoglucanase. Communications Materials. 1 (1), 57 (2020).
- Tummala, G. K., Lopes, V. R., Mihranyan, A., Ferraz, N. Biocompatibility of nanocellulose-reinforced PVA hydrogel with human corneal epithelial cells for ophthalmic applications. Journal of Functional Biomaterials. 10 (3), 35 (2019).
- Fey, C., et al. Bacterial nanocellulose as novel carrier for intestinal epithelial cells in drug delivery studies. Materials Science and Engineering: C. 109, 110613 (2020).
- Ojansivu, M., et al. Wood-based nanocellulose and bioactive glass modified gelatin-alginate bioinks for 3D bioprinting of bone cells. Biofabrication. 11 (3), 035010 (2019).
- Jonsson, M., et al. Neuronal networks on nanocellulose scaffolds. Tissue Engineering Part C: Methods. 21 (11), 1162-1170 (2015).
- Samulin Erdem, J., et al. Cellulose nanocrystals modulate alveolar macrophage phenotype and phagocytic function. Biomaterials. 203, 31-42 (2019).
- Menas, A. L., et al. Fibrillar vs crystalline nanocellulose pulmonary epithelial cell responses: Cytotoxicity or inflammation. Chemosphere. 171, 671-680 (2017).
- Halova, I., Draberova, L., Draber, P. Mast cell chemotaxis chemoattractants and signaling pathways. Frontiers in Immunology. 3, 1-19 (2012).
- Groll, J., et al. A definition of bioinks and their distinction from biomaterial inks. Biofabrication. 11 (1), 013001 (2019).
- Schwab, A., et al. Printability and shape fidelity of bioinks in 3D bioprinting. Chemical Reviews. 120 (19), 11028-11055 (2020).
- Jungst, T., Smolan, W., Schacht, K., Scheibel, T., Groll, J. Strategies and molecular design criteria for 3D printable hydrogels. Chemical reviews. 116 (3), 1496-1539 (2016).
- Sasaki, D. T., Dumas, S. E., Engleman, E. G. Discrimination of viable and non-viable cells using propidium iodide in two color immunofluorescence. Cytometry. 8 (4), 413-420 (1987).
- Usov, I., et al. Understanding nanocellulose chirality and structure-properties relationship at the single fibril level. Nature Communications. 6 (1), 7564 (2015).
