Tillverkning av en kristallin nanocellulosa inbäddad agarose biomaterialbläck för benmärgsbaserad mastcellskultur
Summary
Detta protokoll belyser en metod för att snabbt bedöma biokompatibiliteten hos en kristallin nanocellulosa (CNC)/agaroskomposit hydrogel biomaterial bläck med mus benmärg-härledda mastceller när det gäller cell livskraft och fenotypiska uttryck av cellytan receptorer, Kit (CD117) och hög affinitet IgE receptor (FcεRI).
Abstract
Tredimensionell (3D) bioprinting använder hydrogelbaserade kompositer (eller biomaterialfärger) som deponeras i ett mönster och bildar ett substrat på vilket celler deponeras. Eftersom många biomaterialfärger kan vara potentiellt cytotoxiska för primärceller, är det nödvändigt att bestämma biokompatibiliteten hos dessa hydrogelkompositer innan de används i kostsamma 3D-vävnadsteknikprocesser. Vissa 3D-odlingsmetoder, inklusive bioprinting, kräver att celler bäddas in i en 3D-matris, vilket gör det svårt att extrahera och analysera cellerna för förändringar i livskraft och biomarköruttryck utan att framkalla mekanisk skada. Detta protokoll beskriver som proof of concept, en metod för att bedöma biokompatibiliteten hos en kristallin nanocellulosa (CNC) inbäddad agaroskomposit, tillverkad i ett 24-brunnskultursystem, med musbensmärgbaserade mastceller (BMMCs) med hjälp av flödescytometriska analyser för cellviabilitet och biomarköruttryck.
Efter 18 h exponering för CNC/agarose/D-mannitol matrisen, BMMC livskraft var oförändrad mätt med propidium jodid (PI) permeabilitet. BMMCs odlade på CNC/ agarose/ D-mannitol substrat tycktes dock något öka sitt uttryck för hög affinitet IgE-receptorn (FcεRI) och stamcellsfaktorreceptorn (Kit; CD117), även om detta inte verkar vara beroende av mängden CNC i biobläckkompositen. BMMCs livskraft bedömdes också efter en tidskursexponering för hydrogelställningar som tillverkades av ett kommersiellt biomaterialbläck bestående av fibrillärt nanocellulosa (FNC) och natriumalginat med hjälp av en 3D-extruderingsbioprinter. Under en period av 6-48 h påverkade FNC/alginatsubstrat inte BMMC:s livskraft negativt enligt flödescytometri och mikrotiteranalyser (XTT och laktatdehydrogenas). Detta protokoll beskriver en effektiv metod för att snabbt screena den biokemiska kompatibiliteten hos kandidat biomaterialfärger för deras användbarhet som 3D-byggnadsställningar för eftertryck sådd med mastceller.
Introduction
Den senaste tidens intresse för 3D-odlingssystem och 3D-bioprinting har fokuserat uppmärksamheten på hydrogeler och hydrogelkompositer. Dessa kompositer fungerar som trögflytande men porösa biomimetika och kan bestå av upp till 99% vattenhalt i vikt, vilket är jämförbart med biologiska vävnader1,2,3. Dessa egenskaper hos hydrogelkompositer möjliggör därmed tillväxt av celler utan att påverka deras livskraft och funktion. En sådan komposit är kristallin nanocellulosa (CNC), som har använts som ett förstärkande material i hydrogelkompositer, cellställningar i utvecklingen av biomaterialimplantat och i tvådimensionell (2D) och 3D in vitro-cellkultur4,5. För det mesta är matriser som består av CNC inte alltför cytotoxiska för mänskliga hornhinnans epitelceller6, intestinala epitelceller7, humana benmärgsbaserade mesenkymala stamceller8 eller neuronliknande celler9. Metabolisk aktivitet och spridning av humana benmärg-härledda mesenkymala stamceller minskar dock i samband med ökad viskositet av träbaserade nanocellulosa kompositer, vilket tyder på att matrisens sammansättning noggrant måste testas för dess skadliga effekter på cellfunktioner8.
På samma sätt kan CNC inducera inflammatoriska svar i makrofager vid internalisering, vilket kan få allvarliga konsekvenser i 3D-immuncellskultursystem10,11. Faktum är att det finns mycket lite data tillgängliga om hur CNC kan påverka andra immuncellsvar, särskilt allergiska inflammatoriska svar som initieras av mastceller. Mastceller är granulerade leukocyter som uttrycker den hög affinitet IgE-receptorn, FceRI, som ansvarar för att aktivera inflammatoriska reaktioner på allergener. Deras spridning och differentiering är beroende av stamcellsfaktor (SCF), som binder tyrosinreceptorn, Kit. Mastceller härleds från benmärgsprogenitorceller som kommer in i cirkulationen och därefter migrerar perifert för att sprida sig allestädes närvarande i alla mänskliga vävnader12. Eftersom mastceller fungerar i en 3D-vävnadsmiljö är de en idealisk immuncellskandidat för att studera immunologiska processer i in vitro 3D-vävnadsmodeller. Hittills finns det dock ingen livskraftig in vitro 3D-vävnadsmodell som innehåller mastceller.
På grund av mastcellernas mycket känsliga natur och deras benägenhet att framkalla proinflammatoriska svar på yttre stimuli krävs noggrant övervägande av 3D-matrisbeståndsdelarna och bioprintningsmetoden för att införa mastceller i 3D-ställningen, som diskuterats vidare. Vävnadskonstruktioner kan biofabriceras från två breda kategorier av biomaterial, det vill säga biobläck och biomaterialfärger. Skillnaden ligger i det faktum att biobläck är cellbelastade hydrogelkompositer, medan biomaterialfärger är hydrogelkompositer som saknar celler, enligt definitionen i Groll et al.13,14. Därför innehåller 3D-konstruktioner tryckta med biobläck celler förinbäddade i hydrogelmatrisen, medan 3D-konstruktioner tryckta med biomaterialfärger måste sås med celler efter utskrift. Biofabriceringen av odlingsställningar från hydrogelbaserade biobläck/biomaterialfärger utförs oftast med hjälp av extruderings-3D-bioprinters, som extruderar biobläcket/biomaterialet genom ett mikroskalemunstycke under tryck via antingen en pneumatiskt eller mekaniskt driven kolv14. Extruderingsbioprinters tillverkar 3D-byggnadsställningar genom att deponera biobläcket i 2D-tvärsnittsmönster som är sekventiellt staplade på varandra i en “bottom-up” -metod.
För att vara kompatibel med extruderingsbioprinting måste det hydrogelbaserade biobläcket ha tixotropa (skjuvningsgallring), varigenom biobläckets ingående hydrogelpolymerer flödar som en vätska genom ett mikrokanalmunstycke när det utsätts för skjuvningsstress, men återgår till ett visköst, gelliknande tillstånd vid avlägsnande av skjuvspänningen15 . På grund av deras höga vattenhalt måste polymererna i hydrogelbaserade biobläck/biomaterialfärger korsas, antingen fysiskt eller kovalent, för att upprätthålla arkitekturen och den strukturella integriteten hos den biotryckta 3D-strukturen. När det gäller cellbelastade biobläck utsätts cellerna direkt för kemiska påfrestningar under tvärbindningsprocessen. Processen med extruderande celler inkapslade i bioink hydrogel matrisen utsätter också cellerna för skjuvning stress, vilket kan leda till minskad livskraft och/eller celldöd. När 3D-vävnadsmodellen har bioprintats är det svårt att skilja mellan nivåerna av cytotoxicitet som framkallas av hydrogelmatrisen själv respektive extruderings- respektive tvärbindningsprocesserna. Detta är särskilt utmanande i samband med 3D-ställningar där cellerna är förinbäddade i hydrogelmatrisen, vilket gör det svårt att ta bort cellerna för efterföljande analyser, vilket skulle vara skadligt för mastcellernas livskraft.
Ett skonsammare tillvägagångssätt för att generera 3D-vävnadskonstruktioner som innehåller mastceller innebär att cellerna sås till förtryckta, porösa biomaterialbläck 3D-byggnadsställningar från en cellodlingsfjädring, vilket utnyttjar mastcellernas medfödda förmåga att migrera från cirkulationen till perifera vävnader. Fördelarna med denna cellsåddsmetod är tvåfaldiga: i) mastcellerna inte utsätts för skjuvning och kemiska påfrestningar från extruderings- respektive tvärbindningsprocesserna, och ii) cellerna kan lätt avlägsnas från 3D-ställningen efter exponering genom skonsam tvättning för analys utan att deras livskraft påverkas negativt. Den ytterligare fördelen med sådd och analys av cell livskraften hos mastceller på 3D bioprintade, porösa hydrogelställningar i motsats till 2D-hydrogelskivor är att 3D bioprintade hydrogelställningar rekapitulerar mikroskala topografiska egenskaper hos in vivo-vävnader , som inte finns i bulk, 2D planar hydrogelskivor. Detta tillvägagångssätt är ett lämpligt, snabbt och kostnadseffektivt tillvägagångssätt för att bestämma de potentiellt katastrofala cytotoxiska effekterna av kandidat bioink hydrogel matriser på mastceller, liksom andra immunologiska celler, före investeringar i kostsamma 3D vävnadstekniska experiment.
Protocol
Representative Results
Discussion
Tillverkningen av 3D biomimetiska vävnader kräver en framgångsrik sammanslagning av bioink, som efterliknar komponenter i den extracellulära matrisen, med cellulära komponenter för att skapa fysiologiska analoger av in vivo vävnader. Detta kräver användning av primära celler, och inte omvandlade celler, vid tillverkning av fysiologiska biomimetiska vävnader. Primära immunologiska celler, såsom mastceller, är dock särskilt mottagliga för cytotoxiska effekter och fenotypiska förändringar som kan …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi tackar Alberta Innovates för att ha tillhandahållit CNC och Ken Harris och Jae-Young Cho för deras tekniska råd när de förbereder CNC / agarose / D-mannitolmatrisen. Vi tackar också Ben Hoffman, Heather Winchell och Nicole Diamantides för deras tekniska råd och support med installation och kalibrering av INKREDIBLE+ 3D bioprinter.
Materials
| A | |||
| Acetic Acid (glacial) | Sigma Aldrich | AX0074-6 | |
| Agarose (OmniPur) | EMD Millipore Corporation | 2125-500GM | |
| Armenian Hamster IgG Isotype Control, APC (Clone: eBio299Arm) | Thermo Fisher Scientific | 17-4888-82 | |
| B | |||
| b-Mercaptoethanol | Fisher Scientific | O3446I-100 | |
| b-Nicotinamide adenine dinucleotide sodium salt (NAD) | Sigma Aldrich | N0632-5G | |
| BD 5 mL Syringe (Luer-Lok Tip) | BD | 309646 | |
| BD PrecisionGlide Needle 26G x 1/2 in | BD | 305111 | |
| BioLite 24 Well Multidish | Thermo Fisher Scientific | 930-186 | |
| BioLite 96 Well Multidish | Thermo Fisher Scientific | 130-188 | |
| BioLite 175 cm2 Flask Vented | Thermo Fisher Scientific | 130-191 | |
| Biosafety Cabinet Class II | Microzone Corp., Canada | BK-2-6-B3 | |
| BSA, Fraction V (OmniPur) | EMD Millipore Corporation | 2930-100GM | |
| C | |||
| C57BL/6 mice | The Jackson Laboratory | 000664 | |
| CD117 (c-Kit) Monoclonal Antibody, PE (Clone: 2B8) | Thermo Fisher Scientific | 12-1171-82 | |
| CELLINK BIOINK (3 x 3 mL Cartridge) | CELLINK LLC | IK1020000303 | |
| CELLINK CaCl2 Crosslinking Agent – Sterile Bottle 1 x 60 mL | CELLINK LLC | CL1010006001 | |
| CELLINK Empty Cartridges 3cc with End and Tip Caps | CELLINK LLC | CSC0103000102 | |
| CELLINK HeartWare for PC | CELLINK LLC | Version 2.4.1 | |
| CELLINK INKREDIBLE+ 3D BIOPRINTER | CELLINK LLC | S-10003-001 | |
| CELLINK Sterile Standard Conical Bioprinting Nozzles 22G | CELLINK LLC | NZ4220005001 | |
| CELLINK Sterile Standard Conical Bioprinting Nozzles 25G | CELLINK LLC | NZ4250005001 | |
| CELLINK Sterile Standard Conical Bioprinting Nozzles 27G | CELLINK LLC | NZ4270005001 | |
| Cell Proliferation Kit II (XTT) (Roche) | Sigma Aldrich | 11465015001 | |
| Centrifuge (Benchtop) | Eppendorf | 5804R | |
| Corning Costar 96 Well Clear Flat-Bottom Non-Treated PS Microplate | Sigma Aldrich | CLS3370 | |
| CO2 Incubator | Binder GmbH, Germany | 9040-0113 | |
| CytoFLEX Flow Cytometer | Beckman Coulter | A00-1-1102 | |
| D | |||
| D-mannitol (MilliporeSigma Calbiochem) | Fisher Scientific | 44-390-7100GM | |
| F | |||
| Falcon 15 mL Polystyrene Conical Tubes, Sterile | Corning | 352095 | |
| Falcon 50 mL Polystyrene Conical Tubes, Sterile | Corning | 352070 | |
| FceR1 alpha Monoclonal Antibody, APC (Clone: MAR-1) | Thermo Fisher Scientific | 17-5898-82 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS), qualified, heat inactivated | Thermo Fisher Scientific | 12484028 | |
| FlowJo Software | Becton Dickinson & Co. USA | Version 10.6.2 | |
| G | |||
| GraphPad Prism | GraphPad Software, LLC | Version 8.4.3 | |
| H | |||
| Hemacytometer (Improved Neubauer 0.1 mmm deep levy) | VWR | 15170-208 | |
| HEPES Sodium Salt | Fisher Scientific | BP410-500 | |
| I | |||
| Iodonitrotetrazolium chloride (INT) | Sigma Aldrich | I10406-5G | |
| L | |||
| L-Glutamine 200 mM (Gibco) | Thermo Fisher Scientific | 25030-081 | |
| Lithium L-lactate | Sigma Aldrich | L2250-100G | |
| M | |||
| MEM Non-Essential Amino Acids 100 mL 100x (Gibco) | Thermo Fisher Scientific | 11140-050 | |
| 1-Methoxy-5-methylphenazinium methyl sulfate (MPMS) | Sigma Aldrich | M8640 | |
| Microtubes (1.7 mL clear) | Axygen | MCT-175-C | |
| Microtubes (2.0 mL clear) | Axygen | MCT-200-C | |
| MilliQ Academic (for producing MilliQ ultrapure water) | Millipore | ZMQS60001 | |
| N | |||
| Nalgene Rapid-Flow 90 mm Filter Unit (0.2 mm Pore size, 500 mL) | Thermo Fisher Scientific | 566-0020 | |
| Nalgene Syringe filter (0.2 mm PES, 25 mm) | Thermo Fisher Scientific | 725-2520 | |
| P | |||
| Penicillin Streptomycin 100 mL (Gibco) | Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | |
| PBS pH 7.4, No Calcium/Magnesium, 500 mL (Gibco) | Thermo Fisher Scientific | 10010-023 | |
| Propidium iodide, 1.0 mg/mL (Invitrogen) | Thermo Fisher Scientific | P3566 | |
| R | |||
| Rat IgG2b kappa Isotype Control, PE (Clone: eB149/10H5) | Thermo Fisher Scientific | 12-4031-82 | |
| Recombinant Murine IL-3 | PeproTech, Inc. | 213-13 | |
| RPMI-1640 Medium 1X + 2.05 mM L-Glutamine (HyClone) | GE Healthcare | SH30027.01 | |
| S | |||
| Sarstedt 96 well round base PS transparent micro test plate (82.1582.001) | Fisher Scientific | NC9913213 | |
| Sodium Azide, 500 g | Fisher Scientific | BP922I-500 | |
| Sodium Pyruvate (100 mM) 100X (Gibco) | Thermo Fisher Scientific | 11360-070 | |
| T | |||
| Tris Base (2-amino-2(hydroxymethyl)-1,3-propanediol) | Sigma Aldrich | 252859 | |
| Trypan Blue solution (0.4%, for microscopy) | Sigma Aldrich | 93595 | |
| V | |||
| VARIOSKAN LUX Microplate Spectrophotometer (Type: 3020) | Thermo Fisher Scientific | VLBL00D0 |
References
- Tibbitt, M. W., Anseth, K. S. Hydrogels as extracellular matrix mimics for 3D cell culture. Biotechnology and Bioengineering. 103 (4), 655-663 (2009).
- Drury, J. L., Mooney, D. J. Hydrogels for tissue engineering: Scaffold design variables and applications. Biomaterials. 24 (24), 4337-4351 (2003).
- Lee, K. Y., Mooney, D. J. Hydrogels for tissue engineering. Chemical Reviews. 101 (7), 1869-1879 (2001).
- Halib, N., Ahmad, I. Nanocellulose: Insight into health and medical applications. Handbook of Ecomaterials. , 1345-1363 (2019).
- Alonso-Lerma, B., et al. High performance crystalline nanocellulose using an ancestral endoglucanase. Communications Materials. 1 (1), 57 (2020).
- Tummala, G. K., Lopes, V. R., Mihranyan, A., Ferraz, N. Biocompatibility of nanocellulose-reinforced PVA hydrogel with human corneal epithelial cells for ophthalmic applications. Journal of Functional Biomaterials. 10 (3), 35 (2019).
- Fey, C., et al. Bacterial nanocellulose as novel carrier for intestinal epithelial cells in drug delivery studies. Materials Science and Engineering: C. 109, 110613 (2020).
- Ojansivu, M., et al. Wood-based nanocellulose and bioactive glass modified gelatin-alginate bioinks for 3D bioprinting of bone cells. Biofabrication. 11 (3), 035010 (2019).
- Jonsson, M., et al. Neuronal networks on nanocellulose scaffolds. Tissue Engineering Part C: Methods. 21 (11), 1162-1170 (2015).
- Samulin Erdem, J., et al. Cellulose nanocrystals modulate alveolar macrophage phenotype and phagocytic function. Biomaterials. 203, 31-42 (2019).
- Menas, A. L., et al. Fibrillar vs crystalline nanocellulose pulmonary epithelial cell responses: Cytotoxicity or inflammation. Chemosphere. 171, 671-680 (2017).
- Halova, I., Draberova, L., Draber, P. Mast cell chemotaxis chemoattractants and signaling pathways. Frontiers in Immunology. 3, 1-19 (2012).
- Groll, J., et al. A definition of bioinks and their distinction from biomaterial inks. Biofabrication. 11 (1), 013001 (2019).
- Schwab, A., et al. Printability and shape fidelity of bioinks in 3D bioprinting. Chemical Reviews. 120 (19), 11028-11055 (2020).
- Jungst, T., Smolan, W., Schacht, K., Scheibel, T., Groll, J. Strategies and molecular design criteria for 3D printable hydrogels. Chemical reviews. 116 (3), 1496-1539 (2016).
- Sasaki, D. T., Dumas, S. E., Engleman, E. G. Discrimination of viable and non-viable cells using propidium iodide in two color immunofluorescence. Cytometry. 8 (4), 413-420 (1987).
- Usov, I., et al. Understanding nanocellulose chirality and structure-properties relationship at the single fibril level. Nature Communications. 6 (1), 7564 (2015).
