Avaliação de discinesias induzidas por L-dopa no modelo unilateralmente de ratos lesionados com 6-OHDA da doença de Parkinson

Summary

Modelos de roedores de discinesias induzidas por L-dopa são ferramentas inestimáveis para identificar intervenções terapêuticas para atenuar o desenvolvimento ou aliviar as manifestações que surgem devido à administração repetida de L-DOPA. Este protocolo demonstra como induzir e analisar movimentos discinéticos no modelo unilateral de ratos lesionados com 6-OHDA da doença de Parkinson.

Abstract

As discinesias induzidas por L-dopa (LIDs) referem-se a complicações motoras que surgem da administração prolongada de L-DOPA em pacientes com doença de Parkinson (DP). O padrão mais comum observado na clínica é a discinesia de dose máxima, que consiste em manifestações clínicas de movimentos coreiformes, distônicos e balísticos. O modelo de 6-hidroxidopamina (6-OHDA) de PD em ratos imita várias características dos LIDs. Após administração repetida de L-DOPA, ratos com lesão de 6-OHDA exibem movimentos discinéticos semelhantes (por exemplo, movimentos involuntários anormais, AIMs). Este protocolo demonstra como induzir e analisar AIMs em ratos com lesão de 6-OHDA com depleção dopaminérgica de 90%-95% na via nigrostriatal. A administração repetida (3 semanas) de L-DOPA (5 mg/kg, combinada com 12,5 mg/kg de benserazida) pode induzir o desenvolvimento de AIMs. A análise do curso do tempo revela um aumento significativo nos AIMs em 30-90 min (discinesia de dose máxima). Modelos de roedores de LIDs são uma importante ferramenta pré-clínica para identificar intervenções antidiscinéticas eficazes.

Introduction

O precursor da dopamina L-3,4-di-hidroxifenilalanina (L-DOPA) representa o tratamento mais eficaz para os sintomas motores da doença de Parkinson (DP)¹. A terapia com L-DOPA pode melhorar os sintomas motores associados à DP, mas perde a eficácia com o tempo. Flutuações motoras como “flutuação de desgaste” ou “deterioração do fim da dose” manifestam-se clinicamente como uma duração encurtada do efeito de doses únicas de L-DOPA². Em outros casos, as manifestações clínicas consistem em movimentos lentos de torção e posturas anormais (distonia)³ e ocorrem quando os níveis de dopamina são baixos (distonia fora do período)⁴. Por outro lado, as discinesias induzidas por L-DOPA (LIDs) aparecem quando os níveis de dopamina no plasma e no cérebro são altos⁵.

Os LIDs produzem efeitos colaterais debilitantes que incluem complicações motoras, como movimentos coriformes, distônicos e balísticos⁶. Uma vez estabelecidos, os LIDs ocorrem após cada administração de L-DOPA. Complicações motoras ocorrem em 40%-50% dos pacientes com DP submetidos à terapia com L-DOPA por 5 anos, e a incidência aumenta ao longo dos anos⁷. Embora os mecanismos fisiopatológicos envolvidos no desenvolvimento de LIDs em pacientes com DP ainda não estejam totalmente elucidados, a extensão da denervação dopaminérgica, a administração pulsátil de L-DOPA, as alterações a jusante nas proteínas e genes estriatais e as anormalidades nos sistemas transmissores não dopaminérgicos são fatores que contribuem para o desenvolvimento desses efeitos colaterais indesejados 6,8,9,10.

A neurotoxina 6-hidroxidopamina (6-OHDA) é uma ferramenta bem caracterizada para estudar a DP em roedores^11,12,13,14. Uma vez que a 6-OHDA não atravessa a barreira hematoencefálica, deve ser injetada diretamente na via nigrostriatal. A depleção dopaminérgica induzida por 6-OHDA é dependente da concentração e do local¹⁵. A administração unilateral de 6-OHDA no feixe do prosencéfalo medial (MFB) pode produzir dano nigrostriatal grave (>90%) em roedores^16,17,18,19. A administração crônica de L-DOPA a roedores graves lesionados unilateralmente com 6-OHDA causa o aparecimento de movimentos discinéticos denominados movimentos involuntários anormais (AIMs). Movimentos discinéticos em roedores compartilham mecanismos moleculares, funcionais e farmacológicos semelhantes relacionados aos LIDs em pacientes com DP⁵. Portanto, ratos lesionados com 6-OHDA²⁰ e camundongos²¹ são modelos pré-clínicos valiosos para estudar LIDs. Quando tratados cronicamente (7-21 dias) com doses terapêuticas de L-DOPA (5-20 mg/kg), ratos e camundongos lesionados com 6-OHDA apresentam um desenvolvimento gradual de MIAs que acometem os músculos do membro anterior, tronco e orofacial contralaterais à lesão 17,18,19,20,22,23,24 . Esses movimentos são apresentados em um curso temporal semelhante às discinesias de dose máxima induzidas por L-dopa em pacientes com DP²⁵ e são caracterizados por movimentos hipercinéticos e distonia⁵. Os MIAs geralmente são pontuados com base em sua gravidade (por exemplo, quando uma IAM específica está presente) e amplitude (por exemplo, caracterizada pela amplitude de cada movimento)5,23,25.

Os modelos de LIDs de roedores lesados por 6-OHDA apresentam validade de face (ou seja, o modelo possui diversas características que se parecem com a condição humana)5,11,26,27,28. Os MIAs de roedores, semelhantes ao que ocorre em pacientes com DP, são vistos como movimentos hipercinéticos (membros anteriores e orolinguais) e distônicos (axiais)²⁹ e imitam discinesia de dose máxima. No nível molecular e funcional, os modelos de roedores compartilham muitas características patológicas com pacientes com DP⁵, como a regulação positiva de FosB/ΔFosB 19,26,30,31,32,33 e do transportador de serotonina (SERT)^34,35 . Em relação à validade preditiva, os fármacos que reduzem os LIDs em pacientes com DP (por exemplo, o antagonista do receptor N-metil-D-aspartato (NMDA) amantadina) apresentam eficácia antidiscinética no modelo roedor 22,36,37,38,39.

A escala de classificação de AIMs de roedores foi criada com base em quatro subtipos de AIMs que incluem AIMs que afetam a cabeça, pescoço e tronco (AIMs axiais), movimentos hipercinéticos dos membros anteriores (AIMs de membros) e movimentos orolinguais discinéticos (AIMs orolinguais). Embora a rotação contralateral (AIM locomotores) também esteja presente em roedores lesionados unilateralmente 20,22,23,25,40, ela não foi pontuada como um movimento discinético, uma vez que pode não representar uma medida específica dos LIDs ^22,37,41.

Aqui, descreveremos como induzir e analisar movimentos discinéticos (AIMs axial, de membros e orolinguais) no modelo de DP de ratos com lesão unilateral de 6-OHDA grave (>90%). Organizamos nosso protocolo com base na literatura anterior e em nossa expertise laboratorial.

Protocol

Todos os experimentos foram realizados de acordo com o Comitê de Ética da Faculdade de Filosofia, Ciências e Letras de Ribeirão Preto (CEUA/FFCLRP 18.5.35.59.5). 1. Lesão de 6-OHDA Use ratos machos Sprague-Dawley pesando 200-250 g no início dos experimentos (6 semanas). Abrigar os animais (2-3 por gaiola) em condições normais de laboratório (ciclo claro/escuro das 12:12 h, luzes acesas às 06:00 h, instalações com temperatura controlada (22-24 °C), com co…

Representative Results

Embora os padrões de MIAs observados em ratos sejam mais simples e limitados em comparação com os observados em humanos e primatas não humanos, este modelo reproduz movimentos hipercinéticos e distônicos induzidos pela administração crônica de L-DOPA. Aqui apresentamos dados coletados de um grupo (n = 10) de ratos lesionados unilateralmente com 6-OHDA tratados cronicamente com L-DOPA (5 mg/kg combinados com 12,5 mg/kg de benserazida) por 3 semanas (segunda a sexta-feira). Observe que os dados apresentados na Fig…

Discussion

Este protocolo demonstra como induzir e analisar AIMs no modelo de DP induzida por microinjeção unilateral de 6-OHDA na MFB. A administração diária crônica de baixas doses de L-DOPA (5 mg/kg, combinada com 12,5 mg/kg de benserazida) produziu o desenvolvimento de MIAs ao longo das 3 semanas de tratamento. A análise temporal revelou um aumento significativo dos AIMs, e a discinesia de dose máxima é observada entre 30 e 90 minutos após a administração de L-DOPA. Os MIAs são movimentos repetitivos e sem propósi…

Materials

6-hydroxydopamine hydrobromide	Sigma-Aldrich, USA	H6507	Neurotoxin that produces degeneration of catecholaminergic terminals
Benzerazide hydrochloride	Sigma	B7283	Peripheral dopa-decarboxylase inhibitor
Camera Bullet IR Turbo HD (HD-TVI)  2.8mm B	HIKVISION	DS-2CE16C0T-IRP	Camera used to record all behavior
Imipramine hidrochloride	Alfa Aesar	J63723	Norepinephrine transporter inhibitor (NET) used to protect noradrenergic neurons from 6-OHDA
Ketamine hydrochloride	Ceva Animal Health		Anesthesia for surgical intervention
L-3,4-dihydroxyphenylalanine (L-DOPA) methyl ester (hydrochloride)	Cayman Chemical Company	16149	Dopamine precursor
Mirrors			Used to observe the behavior of animals during experiments in all directions
Needles 0.30 x 13 mm	PrecisionGlide		Needles used to inject drugs
Sodium chloride (NaCl)	Samtec		Salt
Syringes 1 ml Sterile	BD Plastipak		Syringes used to inject drugs
Transparent cylinders			Used to record animal behavior during experiments
Xylazine hydrochloride	Ceva Animal Health		Sedative, analgesic and muscle relaxant for surgical intervention