Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Рейтинг L-DOPA-индуцированных дискинезий в одностороннем 6-OHDA-пораженном крысиной модели болезни Паркинсона

Published: October 4, 2021 doi: 10.3791/62924
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1
1Department of Psychology, Faculty of Philosophy, Sciences and Letters of Ribeirão Preto, University of São Paulo
* These authors contributed equally

Summary

Грызунные модели L-DOPA-индуцированных дискинезий являются бесценными инструментами для выявления терапевтических вмешательств для ослабления развития или облегчения проявлений, возникающих из-за повторного введения L-DOPA. Этот протокол демонстрирует, как индуцировать и анализировать дискинетические движения в одностороннем 6-OHDA-пораженном крысиной модели болезни Паркинсона.

Abstract

L-DOPA-индуцированные дискинезии (LIDs) относятся к двигательным осложнениям, которые возникают в результате длительного введения L-DOPA пациентам с болезнью Паркинсона (PD). Наиболее распространенной картиной, наблюдаемой в клинике, является дискинезия пиковой дозы, которая состоит из клинических проявлений хореиформных, дистонических и баллистических движений. 6-гидроксидофаминовая (6-OHDA) крысиная модель PD имитирует несколько характеристик LID. После повторного введения L-DOPA у крыс с поражением 6-OHDA проявляются дискинетические движения (например, аномальные непроизвольные движения, ИМ). Этот протокол демонстрирует, как индуцировать и анализировать АИМ у крыс с поражением 6-OHDA с 90%-95% дофаминергическим истощением в нигростриатальном пути. Повторное введение (3 недели) L-DOPA (5 мг/кг в сочетании с 12,5 мг/кг бенсеразида) может индуцировать развитие АИМ. Анализ временного курса выявляет значительное увеличение АИМ через 30-90 мин (дискинезия пиковой дозы). Грызунные модели LID являются важным доклиническим инструментом для выявления эффективных антидискинетических вмешательств.

Introduction

Предшественник дофамина L-3,4-дигидроксифенилаланин (L-DOPA) представляет собой наиболее эффективное лечение двигательных симптомов болезни Паркинсона (PD)1. Терапия L-DOPA может улучшить двигательные симптомы, связанные с БП, но со временем теряет эффективность. Двигательные колебания, такие как «флуктуация износа» или «ухудшение в конце дозы», клинически проявляются как укороченная продолжительность эффекта однократных доз L-DOPA2. В других случаях клинические проявления состоят из медленных скручивающих движений и аномальных поз (дистония)3 и возникают, когда уровень дофамина низкий (внепериодическая дистония)4. С другой стороны, L-DOPA-индуцированные дискинезии (LIDs) появляются, когда уровни дофамина в плазме и мозге высоки5.

ЛИДы вызывают изнурительные побочные эффекты, которые включают двигательные осложнения, такие как хореиформные, дистонические и баллистическиедвижения 6. После установки LID возникают после каждого введения L-DOPA. Двигательные осложнения возникают у 40%-50% пациентов с БП, проходящих терапию L-DOPA в течение 5 лет, а заболеваемость увеличивается с течением7 лет. Хотя патофизиологические механизмы, участвующие в развитии LID у пациентов с БП, еще не полностью выяснены, степень дофаминергической денервации, пульсирующее введение L-DOPA, последующие изменения в стриатальных белках и генах, а также аномалии в недофаминовых передающих системах являются факторами, которые способствуют развитию этих нежелательных побочных эффектов 6,8,9,10.

Нейротоксин 6-гидроксидофамин (6-OHDA) является хорошо охарактеризованным инструментом для изучения БП у грызунов 11,12,13,14. Поскольку 6-OHDA не пересекает гематоэнцефалический барьер, его необходимо вводить непосредственно в нигростриатальный путь. 6-OHDA-индуцированное дофаминергическое истощение зависит от концентрации и участка15. Одностороннее введение 6-OHDA в медиальный пучок переднего мозга (MFB) может привести к тяжелому (>90%) нигростриатальному повреждению у грызунов 16,17,18,19. Хроническое введение L-DOPA тяжелым односторонне 6-OHDA-пораженным грызунам вызывает появление дискинетических движений, называемых аномальными непроизвольными движениями (AIMs). Дискинетические движения у грызунов имеют сходные молекулярные, функциональные и фармакологические механизмы, связанные с ЛИД у пациентов с БП5. Таким образом, 6-OHDA-пораженные крысы20 и мыши21 являются ценными доклиническими моделями для изучения LID. При хроническом лечении (7-21 день) терапевтическими дозами L-DOPA (5-20 мг/кг) в одностороннем порядке у крыс и мышей с поражением 6-OHDA наблюдается постепенное развитие АИМ, которые влияют на передние, туловищные и орофациальные мышцы, противоположные поражению 17,18,19,20,22,23,24 . Эти движения представлены на временном курсе, аналогичном L-DOPA-индуцированным дискинезиям пиковой дозы у пациентов с БП25 и характеризуются гиперкинетическими движениями и дистонией5. AIM обычно оцениваются на основе их тяжести (например, когда присутствует определенный AIM) и амплитуды (например, характеризуется амплитудой каждого движения) 5,23,25.

Модели 6-OHDA-пораженных грызунов LID представляют валидность лица (т.е. модель имеет несколько характеристик, которые выглядят как состояние человека)5,11,26,27,28. AIM грызунов, аналогичные тому, что происходит у пациентов с БП, рассматриваются как гиперкинетические (передние и оролингвальные) и дистонические (осевые) движения29 и имитируют дискинезию пиковой дозы. На молекулярном и функциональном уровне модели грызунов имеют много общих патологических характеристик с пациентами с БП5, таких как повышение регуляции FosB/ ΔFosB 19,26,30,31,32,33 и переносчика серотонина (SERT)34,35 . Что касается прогностической валидности, препараты, которые снижают LID у пациентов с БП (например, антагонист рецептора N-метил-D-аспартата (NMDA) амантадин), представляют антидискинетическую эффективность в модели грызунов 22,36,37,38,39.

Рейтинговая шкала AIMs грызунов была создана на основе четырех подтипов AIM, которые включают AIM, влияющие на голову, шею и туловище (осевые AIM), гиперкинетические движения передних конечностей (AIM конечностей) и дискинетические оролингвальные движения (orolingual AIMs). Хотя контралатеральное вращение (локомотивные AIM) также присутствует у односторонне пораженных грызунов 20,22,23,25,40, оно не было оценено как дискинетическое движение, поскольку оно не может представлять собой конкретную меру LID 22,37,41.

Здесь мы опишем, как индуцировать и анализировать дискинетические движения (осевые, конечностные и оролингвальные АИМ) в тяжелой (>90%) односторонне 6-OHDA-пораженной крысиной модели БП. Мы организовали наш протокол на основе предыдущей литературы и нашего лабораторного опыта.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Все эксперименты проводились в соответствии с Комитетом по этике факультета философии, наук и литературы Рибейран-Прету (CEUA/FFCLRP 18.5.35.59.5).

1. Поражение 6-OHDA

  1. Используют Спрэга-Доули самцы крыс весом 200-250 г в начале экспериментов (6 недель). Размещайте животных (2-3 в клетке) в стандартных лабораторных условиях (12:12 ч светлый / темный цикл, свет включен в 06:00 ч, помещения с контролируемой температурой (22-24 ° C), с пищей и водой , доступными до либитума.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Полное описание того, как генерировать тяжелых 6-OHDA-пораженных крыс, описано в другом месте42.
  2. Соответствующим образом акклиматизируйте животных до начала любой экспериментальной процедуры.
  3. Вводят (внутрибрюшинно, т..) ингибитор переносчика норадреналина имипрамин (20 мг/кг, растворенный в 0,9% физиологическом растворе) за 30 мин до операции.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Введение имипрамина увеличит селективность 6-OHDA для дофаминергических нейронов.
  4. Вводят кетамин/ксилазин (70/10 мг/кг) внутрибрюшинно.
  5. Убедитесь, что животное глубоко обезболено отсутствием реакции на защемление пальца ноги и расположено в положении лежа в стереотаксическом аппарате на верхней части грелки.
  6. Удалите мех на голове и продезинфицируйте хирургическую область 3 раза, чередуя скраб на основе йода и спирт.
  7. Используйте скальпель, чтобы сделать разрез (примерно 1 см) в области, где произойдет микроинъекция.
  8. Очистите область черепа ватными тампонами и убедитесь, что Брегма и Лямбда обнажены.
  9. Убедитесь, что стереотаксические координаты MFB взяты из брегмы 43,44,45: -4,3 мм спереди, 1,6 мм сбоку (правая сторона) и 8,3 мм с вентральной (с твердой мозговой оболочки).
  10. Вводят 6-OHDA со скоростью 0,4 мкл/мин (10 мкг в 4 мкл физиологического раствора, содержащего 0,1% аскорбиновой кислоты) в одностороннем порядке в правый медиальный пучок переднего мозга (MFB) с использованием стеклянного шприца Гамильтона объемом 50 мкл.
  11. В конце операции зашить разрез кожи головы и регидратировать животное теплым (~37 °C) стерильным 0,9% физиологическим раствором (~10 мл/кг, s.c.).
  12. Извлеките животное из стереотаксической рамки и поместите его в разогретую клетку восстановления. Следите до тех пор, пока сознание не будет восстановлено.
  13. Оценить эффективность дофаминергического поражения через 4 недели после поражения с помощью степпинг-теста46,47.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В этом тесте акинезия передней конечности контралатерально к поражению оценивается через количество корректирующих шагов с передней лапой, контралатеральной к поражению. Крысы, представляющие три или менее корректирующих шагов с контралатеральной передней конечностью, включены в исследование как предполагаемые сильно пораженные 6-OHDA крысы48.

2. Лечение хронической инфекции L-DOPA

  1. Начните хроническое лечение в понедельник, через 4 недели после поражения 6-OHDA.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку AIM будут записываться на видео в течение 3 последовательных дней в неделю (среда, четверг и пятница) в течение 3 недель, рекомендуется начинать лечение в понедельник.
  2. Обрабатывайте крыс свежеприготовленным L-DOPA (через подкожное (s.c.), 1 мл/кг) плюс бенсеразида гидрохлорид (5 мг/кг и 12,5 мг/кг соответственно) в течение 3 недель, один раз в день с понедельника по пятницу45.
    ПРИМЕЧАНИЕ: После создания AIM будут проявляться при каждом администрировании L-DOPA. Поэтому введение L-ДОФА 2-4 раза в неделю после 3-недельного индукционного периода достаточно для поддержания стабильной экспрессии АИМ48.

3. Запись и подсчет очков AIMs

  1. Проводите эксперименты с 09:00 ч до 17:00 ч. Убедитесь, что исследователь совершенно не знает о личности крыс и фармакологическом лечении.
  2. Осторожно поместите крысу внутрь прозрачного цилиндра (диаметром 20 см х 40 см высотой) и дайте ей акклиматизироваться не менее 15 минут. Убедитесь, что пол покрыт постельным материалом. Зеркала должны быть расположены позади цилиндра, чтобы экспериментатор мог наблюдать за животным со всех возможных углов.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если в эксперименте более одной крысы, используйте цилиндр для каждой крысы. Манипуляции с животными между сеансами могут мешать поведенческому анализу.
  3. Расположите видеокамеру с высоким разрешением таким образом, чтобы она благоприятствовала просмотру осевых, конечностных и оролингвальных AIM. Поскольку поведение вращения присутствует в этих экспериментальных условиях, зеркала позади цилиндра позволят отслеживать AIM под углом 360 °. Используйте штатив или закрепите камеру прямо на скамейке.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Оролингуальные AIM могут быть сложными для оценки, особенно если существует высокая частота ротационного поведения. Захват видео с помощью камеры, расположенной немного ниже плоскости, где животные находятся под углом 15 °, поможет наблюдать этот подтип движения.
  4. Осторожно извлекают животное из цилиндра и вводят L-DOPA (5 мг/кг в сочетании с 12,5 мг/кг бенсеразида, s.c.).
  5. Поместите животное обратно в цилиндр и запустите таймер для отслеживания AIM после инъекции L-DOPA. Используйте видеокамеру для записи AIM в течение 180 мин после инъекции L-DOPA. Хотя анализ может быть проведен путем непосредственного наблюдения за животным, предпочтительным является оффлайн-подсчет.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что таймер также снят на видео, чтобы AIM можно было оценивать в точное время после введения L-DOPA.
  6. Назначайте AIMs с интервалом 30 мин до 180 мин после инъекции L-DOPA (см. Таблицу 1 для определений), как первоначально описано20,23. Оценки должны быть даны в течение 1-2 мин эпох и классифицированы как осевые, конечностные или оролингвальные (рисунок 1).
  7. Внимательно наблюдайте за каждым AIM и приписывайте баллы по степени тяжести и амплитуде. Используйте таблицу 1 для инструкций. Не включайте в рейтинг нормальное поведение, такое как выращивание, обнюхивание, груминг и грызение. Всего будет шесть периодов наблюдения (30, 60, 90, 120, 150 и 180 минут).
ПОДТИПОВ
Осевой: кручение головы, шеи и туловища
Конечность: непроизвольные движения как дистальной, так и проксимальной передней конечности
Оролингвальные: непроизвольные движения орофациальных мышц
СУРОВОСТЬ
0: Отсутствует
1: Эпизодические (с перерывами, присутствующими менее чем в половине времени наблюдения)
2: Частые (с перерывами, но присутствуют более чем в половине времени наблюдения)
3: Непрерывный, но прерывается внешними сенсорными стимулами
4: Непрерывный и не прерывается внешними сенсорными стимулами
АМПЛИТУДА
Осевой
1: Кручение головы и шеи под углом приблизительно 30°
2: Кручение головы и шеи под углом примерно 30° < ≤ 60°
3: Кручение головы, шеи и верхней части туловища под углом примерно 60° < ≤ 90°
4: Кручение головы, шеи и туловища под углом > 90 °, часто заставляя крысу терять равновесие
Конечность
1: Небольшие непроизвольные движения дистальной передней конечности
2: Движения низкой амплитуды, вызывающие транслокацию как дистального, так и проксимального передних конечностей
3: Непроизвольные движения всей конечности, включая мышцы плеча
4: Сильные движения конечностей и плеч, часто похожие на баллизм
Оролингуал
1: Небольшие непроизвольные движения орофациальных мышц
2: Орофациальные движения высокой амплитуды с выпячиванием языка

Таблица 1: Определение АИСЮ и критерии оценки.

Figure 1
Рисунок 1: Последовательность фотографий, показывающих каждый подтип AIM. (от А до А'") Осевой AIM, показывающий дистонические движения под разными углами (A: угол 30°, A': угол 30° < ≤ 60°, A": угол 60° < ≤ 90° и A'": угол > 90°). (В-В") Конечность AIM (черные стрелки), показывающая непроизвольные движения дистальной (B и B') и всей передней конечности (включая плечо, B). (C) Orolingual AIM (красная стрелка) высокой амплитуды с выпячиванием языка. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

4. Анализ данных

  1. Вычислите осевые, конечностные или оролингвальные подтипы AIMs путем умножения баллов тяжести и амплитуды для каждого периода наблюдения после введения L-DOPA (т.е. шести периодов наблюдения), как описано ранее20. Теоретический максимальный балл, который одно животное может накопить за один сеанс тестирования, составляет 240 (максимальный балл за период наблюдения составляет 40, см. Таблицу 1 для деталей).
  2. График AIMs оценивается для всех шести периодов наблюдения, зарегистрированных в среду, четверг и пятницу в течение 3 недель хронического введения L-DOPA (рисунок 2). AIM могут быть суммированы, чтобы указать максимальный балл каждого животного в каждый день подсчета очков (рисунок 3) или каждую неделю (рисунок 4) в течение 3 недель хронического введения L-DOPA.
  3. Проверьте, имеют ли данные близкое к нормальному распределение, прежде чем выбрать подход к статистическому анализу.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Рейтинговые шкалы AIM состоят из порядковых данных и могут быть проанализированы с помощью непараметрической статистики. Параметрические тесты широко используются при сравнении баллов AIM в экспериментальных группах после повторных сеансов тестирования40.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Хотя паттерны AIM, наблюдаемые у крыс, проще и ограничены по сравнению с теми, которые наблюдаются у людей и нечеловеческих приматов, эта модель воспроизводит как гиперкинетические, так и дистонические движения, вызванные хроническим введением L-DOPA. Здесь мы представляем данные, собранные из группы (n = 10) односторонне пораженных 6-OHDA крыс, хронически получавших L-DOPA (5 мг / кг в сочетании с 12,5 мг / кг бенсеразида) в течение 3 недель (с понедельника по пятницу). Обратите внимание, что данные, представленные на рисунке 2, рисунке 3 и рисунке 4, относятся к одним и тем же животным.

На рисунке 2 показан анализ временного курса для баллов, применяемых к осевым, конечностным и оролингвальным AIM в течение 3 недель хронического введения L-DOPA. Каждый подтип оценки AIM в определенный период наблюдения сообщается как умножение баллов тяжести и амплитуды в этом анализе. Этот тип анализа может быть удобен для изучения эффекта препаратов, которые вмешиваются во временной профиль АИМ.Обратите внимание, что L-DOPA-индуцированные дискинезии пиковой дозы возникают между 30-90 мин с постепенным снижением через 120 мин после инъекции (рисунок 2).

Figure 2
Рисунок 2: Анализ временного курса, показывающий осевые, конечностные и оролингвальные АИМ в течение 3 недель хронического введения L-DOPA (5 мг / кг в сочетании с 12,5 мг / кг бенсеразида) крысам с поражением 6-OHDA. (A) Осевые, (B) конечности и (C) оролингвальные АИМы были оценены в среду, четверг и пятницу в течение 3 недель хронического приема L-DOPA. Каждый подтип AIM сообщается как умножение амплитуды времени тяжести на каждый из шести периодов наблюдения. Каждый подтип AIM может быть проанализирован индивидуально или суммирован, как указано в (D). Обратите внимание, что пиковая тяжесть АИМ будет постепенно увеличиваться в течение первой недели хронического приема L-DOPA. Данные выражаются как среднее ± SEM (n = 10). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

На рисунке 3 показана сумма оценок AIMs, представленных для всех шести периодов наблюдения, показанных на рисунке 2 (наборы данных имеют цветовую кодировку для удобства сравнения). Этот анализ указывает на максимальный балл каждого животного в каждый день подсчета очков (среда, четверг и пятница) в течение 3 недель хронического приема L-DOPA. Этот тип анализа может быть полезен для изучения влияния соединений с потенциальными антидискинетическими профилями, особенно потому, что показатели AIM стабильны в течение 2 и 3 недель хронического введения L-DOPA. Кроме того, еженедельные оценки AIMs (рисунок 4) могут быть сгенерированы из суммы баллов, приписываемых крысам с поражением 6 OHDA в среду, четверг и пятницу.

Figure 3
Рисунок 3: Сумма осевых, конечночных и оролингвальных АИМ в отдельные дни оценки в течение 3 недель хронического введения L-ДОФА (5 мг/кг в сочетании с 12,5 мг/кг бенсеразида) крысам с поражением 6-OHDA. На этом рисунке были суммированы оценки AIM, представленные в каждом из шести периодов наблюдения (см. подробности в легенде на рисунке 2 ). Отдельные наборы данных были обозначены цветом для сравнения с данными, показанными на рисунке 2. Этот анализ показывает максимальный балл каждого животного в каждый день подсчета очков (среда - W, четверг - T и пятница - F) после 3 недель хронического приема L-DOPA. (A) Осевые, (B) Лимбовые и (C) оролингвальные AIM. (D) Сумма осевых, конечностных и оролингвальных AIM. Односторонние повторные меры ANOVA и Holm-Sidak post-hoc test показали, что AIM постепенно увеличиваются по сравнению с хроническим введением L-DOPA. Обратите внимание, что показатели AIM стабильны в течение 2 и 3 недель хронического введения L-DOPA (*p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001 по сравнению со средой (W) на 1-й неделе). Данные выражаются как среднее ± SEM (n = 10). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 4
Рисунок 4: Сумма еженедельных осевых, конечностных и оролингвальных АИМ при хроническом введении L-ДОФА (5 мг/кг в сочетании с 12,5 мг/кг бенсеразида) крысам с поражением 6-OHDA. На этом рисунке суммировались AIM, набранные каждую неделю (среда, четверг и пятница - см. Рисунок 3). Этот анализ показывает максимальный балл каждого животного на каждую неделю хронического приема L-DOPA. (A) Осевые, (B) Лимбовые и (C) оролингвальные AIM. (D) Сумма осевых, конечностных и оролингвальных AIM. Односторонние повторные измерения ANOVA и Holm-Sidak после специального теста показали, что AIM увеличиваются по сравнению с хроническим введением L-DOPA (*p < 0,05 по сравнению с 1-й неделей). Данные выражаются как среднее ± SEM (n = 10). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Этот протокол демонстрирует, как индуцировать и анализировать AIM в крысиной модели PD, индуцированной односторонней микроинъекцией 6-OHDA в MFB. Хроническое ежедневное введение низких доз L-DOPA (5 мг/кг в сочетании с 12,5 мг/кг бенсеразида) приводило к развитию АИМ в течение 3 недель лечения. Временной анализ выявил значительное увеличение АИМ, а пиковая доза дискинезии наблюдается между 30 и 90 мин после введения L-DOPA. AIM - это повторяющиеся и бесцельные движения, влияющие на осевые, конечностные и оролингвальные мышцы. Протокол и представленные здесь данные согласуются с предыдущей литературой 22,23,49,50,51.

Шкала оценки осевых, конечностных и оролингвальных AIMs очень чувствительна, поскольку она оценивает количество времени (т. Е. Тяжесть), в течение которого грызуны демонстрируют дискинетические движения, и указывает на амплитуду этих движений20. Оценки AIMs могут быть выражены в различных временных разрешениях (см. Рисунок 2, Рисунок 3, Рисунок 4)17,18,19,52. В нескольких исследованиях рассматривалась роль дозировки L-DOPA в разработке AIM. Хроническое введение более низких доз L-DOPA (5-20 мг / кг) способствует постепенному развитию АИМ по сравнению с лечением, в то время как высокие дозы L-DOPA (25 мг / кг или более) приводят к быстрому и устойчивому развитию АИМ 23,25,27,53. Интересно, что у части тяжелых 6-OHDA-пораженных животных может не развиваться AIM (или иметь очень низкие баллы AIM) после хронического введения низких доз L-DOPA 40,49,53. Также важно рассмотреть путь введения L-DOPA. Хотя AIM имеют сходное начало, временной профиль и степень тяжести40, было продемонстрировано, что эпизоды с недостаточностью дозы часто возникали у крыс, получавших внутрибрюшинноелечение 27. Кроме того, ип. введение L-DOPA вызывало межиндивидуальные вариации уровней в плазме, эффект, который не наблюдался после инъекцийs.c. 27.

В этом исследовании АИМ были очевидны у животных с тяжелым нигростриатальным повреждением (более 90% дофаминергического истощения). Массивная потеря полосатой дофаминергической иннервации характеризуется уменьшением числа корректирующих этапов, выполняемых передним краем контралатерально к поражению48. Поэтому мы рекомендуем ступенчатый тест для отбора животных с предполагаемыми тяжелыми поражениями 6-OHDA на нигростриатальном пути. Тест на вращение, вызванный амфетамином, обычно используется для отбора предполагаемых крыс с поражением 6-OHDA. Амфетамин увеличивает высвобождение дофамина в интактном полосатом теле и, таким образом, увеличивает существующий дисбаланс между иннервированным и денервированным полосатым телом. Тем не менее, интересное исследование, проведенное на 312 крысах с поражением 6 OHDA11 , не выявило корреляции между амфетамин-индуцированным вращением и положительными клетками тирозингидроксилазы в ipsilateral substantia nigra pars compacta. Это же исследование показало плохую корреляцию между ротацией, вызванной амфетамином, и тяжестью АИМ.

Существует четкая связь между феноменологией ИМ и паттерном нигростриатального дофаминергического истощения20. 6-OHDA крысиная модель PD, которую мы использовали в этом протоколе, развивает тяжелое одностороннее истощение нигростриатальных дофаминовых терминалов после инфузии 6-OHDA в MFB. Полностью истощенные дофамином 6-OHDA-пораженные крысы имеют более высокую частоту AIM по сравнению с частично истощенными дофамином животными. Подробный анализ стриатальной экспрессии нейропептидов динорфина и энкефалина после поражения 6-OHDA и хронического введения L-DOPA описан в другом месте45 и согласуется с предыдущей литературой23,25. На молекулярном уровне дискинетические грызуны разделяют молекулярные маркеры, связанные с дискинезией, очевидной в нечеловеческих моделях приматов пациентов с БП и БП, таких как стриатальная регуляция фактора транскрипции ΔFosB 26,32,33,54. Кроме того, модель БП для грызунов показывает повышенную плотность микрососудов в полосатом теле в ответ на лечение L-DOPA55 аналогичным образом, наблюдаемым в путамене пациентов с БП56. Грызунные модели ЛИДов реагируют на антидискинетические фармакологические подходы, используемые в клинике, такие как антагонист NMDA-рецепторов амантадин 22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34, 35,36,37, 38,39. В целом, эти доказательства подтверждают валидность лица и прогностическую валидность модели крыс 6-OHDA для характеристики патофизиологии LID и для скрининга соединений с антидискинетическими свойствами. Мышиная модель LID также является ценным инструментом для изучения нескольких аспектов LID у трансгенных мышей. Протоколы для мышиной модели LID можно найти в работах различных исследовательских групп 30,57,58.

Важно отметить, что модель LID 6-OHDA-пораженных грызунов имеет ограничения. 6-OHDA-индуцированное дофаминергическое истощение является острым по сравнению с прогрессирующим характером нигростриатального истощения у пациента с БП5. Кроме того, может быть сложно найти отличное терапевтическое окно для использования антидискинетического препарата у пациентов, потому что увеличение дозировки препарата может повлиять на полезный эффект, производимый L-DOPA, или вызвать побочные эффекты, которые, возможно, не наблюдались в животной модели59,60. Другим ограничением крысиной модели ЛИДов является отсутствие физического сходства между AIM у грызунов и проявлением хореформных движений, наблюдаемых у пациентов и нечеловеческих приматов 10,61,62. Другим потенциальным ограничением протокола, представленного здесь, является то, что AIM набираются каждые 30 минут после введения L-DOPA, но эту проблему можно решить, если экспериментатор снимает на видео всех животных в течение 180 минут после введения L-DOPA. Затем экспериментатор может настроить протокол оценки для более частого подсчета баллов (например, каждые 10 или 20 минут). Этот подход выгоден в экспериментах, требующих более динамической картины временного хода АИМ (например, сочетание оценки AIM и электрофизиологических или нейрохимических записей in vivo).

В заключение, 6-OHDA крысиная модель LID воспроизводит патофизиологию заболевания и развивает AIM, которые могут модулироваться клинически используемыми препаратами. Несмотря на то, что она имеет ограничения, 6-OHDA крысиная модель LID по-прежнему представляет собой бесценный доклинический инструмент для выявления эффективных антидискинетических вмешательств с трансляционным потенциалом.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

У авторов нет конфликта интересов.

Acknowledgments

Эта работа была поддержана Исследовательским фондом Сан-Паулу (FAPESP, грант 2017/00003-0). Мы благодарны за Координацию по совершенствованию кадров высшего образования (CAPES). Мы благодарим д-ра Энтони Р. Уэста, д-ра Хайнца Штайнера и д-ра Куэй Й. Ценга за поддержку и наставничество.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
6-hydroxydopamine hydrobromide Sigma-Aldrich, USA H6507 Neurotoxin that produces degeneration of catecholaminergic terminals
Benzerazide hydrochloride Sigma B7283 Peripheral dopa-decarboxylase inhibitor
Camera Bullet IR Turbo HD (HD-TVI)  2.8mm B HIKVISION DS-2CE16C0T-IRP Camera used to record all behavior
Imipramine hidrochloride Alfa Aesar J63723 Norepinephrine transporter inhibitor (NET) used to protect noradrenergic neurons from 6-OHDA
Ketamine hydrochloride Ceva Animal Health Anesthesia for surgical intervention
L-3,4-dihydroxyphenylalanine (L-DOPA) methyl ester (hydrochloride) Cayman Chemical Company 16149 Dopamine precursor
Mirrors Used to observe the behavior of animals during experiments in all directions
Needles 0.30 x 13 mm PrecisionGlide Needles used to inject drugs
Sodium chloride (NaCl) Samtec Salt
Syringes 1 ml Sterile BD Plastipak Syringes used to inject drugs
Transparent cylinders Used to record animal behavior during experiments
Xylazine hydrochloride Ceva Animal Health Sedative, analgesic and muscle relaxant for surgical intervention

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Jenner, P. Molecular mechanisms of L-DOPA-induced dyskinesia. Nature Reviews. Neuroscience. 9 (9), 665-677 (2008).
  2. Nutt, J. G. Levodopa-induced dyskinesia: review, observations, and speculations. Neurology. 40 (2), 340-345 (1990).
  3. Luquin, M. R., Scipioni, O., Vaamonde, J., Gershanik, O., Obeso, J. A. Levodopa-induced dyskinesias in Parkinson's disease: clinical and pharmacological classification. Movement Disorders: Official Journal of the Movement Disorder Society. 7 (2), 117-124 (1992).
  4. Fabbrini, G., Brotchie, J. M., Grandas, F., Nomoto, M., Goetz, C. G. Levodopa-induced dyskinesias. Movement Disorders: Official Journal of the Movement Disorder Society. 22 (10), 1379 (2007).
  5. Cenci, M. A., Crossman, A. R. Animal models of l-dopa-induced dyskinesia in Parkinson's disease. Movement Disorders: Official Journal of the Movement Disorder Society. 33 (6), 889-899 (2018).
  6. Bastide, M. F., et al. Pathophysiology of L-dopa-induced motor and non-motor complications in Parkinson's disease. Progress in Neurobiology. 132, 96-168 (2015).
  7. Manson, A., Stirpe, P., Schrag, A. Levodopa-induced-dyskinesias clinical features, incidence, risk factors, management and impact on quality of life. Journal of Parkinson's Disease. 2 (3), 189-198 (2012).
  8. Grandas, F., Galiano, M. L., Tabernero, C. Risk factors for levodopa-induced dyskinesias in Parkinson's disease. Journal of Neurology. 246 (12), 1127-1133 (1999).
  9. Schrag, A., Quinn, N. Dyskinesias and motor fluctuations in Parkinson's disease. A community-based study. Brain: A Journal of Neurology. 123, Pt 11 2297-2305 (2000).
  10. Bezard, E., Brotchie, J. M., Gross, C. E. Pathophysiology of levodopa-induced dyskinesia: potential for new therapies. Nature Reviews. Neuroscience. 2 (8), 577-588 (2001).
  11. Tronci, E., Shin, E., Björklund, A., Carta, M. Amphetamine-induced rotation and L-DOPA-induced dyskinesia in the rat 6-OHDA model: a correlation study. Neuroscience Research. 73 (2), 168-172 (2012).
  12. Duty, S., Jenner, P. Animal models of Parkinson's disease: a source of novel treatments and clues to the cause of the disease. British Journal of Pharmacology. 164 (4), 1357-1391 (2011).
  13. Ungerstedt, U. 6-Hydroxy-dopamine induced degeneration of central monoamine neurons. European Journal of Pharmacology. 5 (1), 107-110 (1968).
  14. Ungerstedt, U. Postsynaptic supersensitivity after 6-hydroxy-dopamine induced degeneration of the nigro-striatal dopamine system. Acta Physiologica Scandinavica. Supplementum. 367, 69-93 (1971).
  15. Kirik, D., Rosenblad, C., Bjorklund, A. Characterization of behavioral and neurodegenerative changes following partial lesions of the nigrostriatal dopamine system induced by intrastriatal 6-hydroxydopamine in the rat. Experimental Neurology. 152, 259-277 (1998).
  16. Zahm, D. S. Compartments in rat dorsal and ventral striatum revealed following injection of 6-hydroxydopamine into the ventral mesencephalon. Brain Research. 552 (1), 164-169 (1991).
  17. Padovan-Neto, F. E., Echeverry, M. B., Tumas, V., Del-Bel, E. A. Nitric oxide synthase inhibition attenuates L-DOPA-induced dyskinesias in a rodent model of Parkinson's disease. Neuroscience. 159 (3), 927-935 (2009).
  18. Padovan-Neto, F. E., et al. Antidyskinetic effect of the neuronal nitric oxide synthase inhibitor is linked to decrease of FosB/deltaFosB expression. Neuroscience Letters. 541, 126-131 (2013).
  19. Padovan-Neto, F. E., Cavalcanti-Kiwiatkoviski, R., Carolino, R. O., Anselmo-Franci, J., Del Bel, E. Effects of prolonged neuronal nitric oxide synthase inhibition on the development and expression of L-DOPA-induced dyskinesia in 6-OHDA-lesioned rats. Neuropharmacology. 89, 87-99 (2015).
  20. Winkler, C., Kirik, D., Björklund, A., Cenci, M. A. L-DOPA-induced dyskinesia in the intrastriatal 6-hydroxydopamine model of parkinson's disease: relation to motor and cellular parameters of nigrostriatal function. Neurobiology of Disease. 10 (2), 165-186 (2002).
  21. Francardo, V., et al. Impact of the lesion procedure on the profiles of motor impairment and molecular responsiveness to l-DOPA in the 6-hydroxydopamine mouse model of Parkinson's disease. Neurobiology of Disease. 42, 327-340 (2011).
  22. Lundblad, M., et al. Pharmacological validation of behavioural measures of akinesia and dyskinesia in a rat model of Parkinson's disease. The European Journal of Neuroscience. 15 (1), 120-132 (2002).
  23. Cenci, M. A., Lee, C. S., Björklund, A. L-DOPA-induced dyskinesia in the rat is associated with striatal overexpression of prodynorphin- and glutamic acid decarboxylase mRNA. The European Journal of Neuroscience. 10 (8), 2694-2706 (1998).
  24. Henry, B., Crossman, A. R., Brotchie, J. M. Characterization of enhanced behavioral responses to L-DOPA following repeated administration in the 6-hydroxydopamine-lesioned rat model of Parkinson's disease. Experimental Neurology. 151 (2), 334-342 (1998).
  25. Lee, C. S., Cenci, M. A., Schulzer, M., Björklund, A. Embryonic ventral mesencephalic grafts improve levodopa-induced dyskinesia in a rat model of Parkinson's disease. Brain: A Journal of Neurology. 123, Pt 7 1365-1379 (2000).
  26. Andersson, M., Hilbertson, A., Cenci, M. A. Striatal fosB expression is causally linked with l-DOPA-induced abnormal involuntary movements and the associated upregulation of striatal prodynorphin mRNA in a rat model of Parkinson's disease. Neurobiology of Disease. 6 (6), 461-474 (1999).
  27. Lindgren, H. S., Rylander, D., Ohlin, K. E., Lundblad, M., Cenci, M. A. The "motor complication syndrome" in rats with 6-OHDA lesions treated chronically with L-DOPA: relation to dose and route of administration. Behavioural Brain Research. 177 (1), 150-159 (2007).
  28. Animal Models of Movement Disorders: volume I, Neuromethods. Lane, E. L., Dunnett, S. 61, Springer Science+Business Media. (2011).
  29. Carlsson, T., Carta, M., Winkler, C., Björklund, A., Kirik, D. Serotonin neuron transplants exacerbate l-DOPA-induced dyskinesias in a rat model of Parkinson's disease. Journal of Neuroscience. 27 (30), 8011-8022 (2007).
  30. Lundblad, M., Picconi, B., Lindgren, H., Cenci, M. A. A model of L-DOPA-induced dyskinesia in 6-hydroxydopamine lesioned mice: relation to motor and cellular parameters of nigrostriatal function. Neurobiology of Disease. 16 (1), 110-123 (2004).
  31. Fasano, S., et al. Inhibition of Ras-guanine nucleotide-releasing factor 1 (Ras-GRF1) signaling in the striatum reverts motor symptoms associated with L-dopa-induced dyskinesia. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (50), 21824-21829 (2010).
  32. Berton, O., et al. Striatal overexpression of DeltaJunD resets L-DOPA-induced dyskinesia in a primate model of Parkinson disease. Biological Psychiatry. 66 (6), 554-561 (2009).
  33. Lindgren, H. S., et al. Putaminal upregulation of FosB/ΔFosB-like immunoreactivity in Parkinson's disease patients with dyskinesia. Journal of Parkinson's Disease. 1 (4), 347-357 (2011).
  34. Rylander, D., et al. Maladaptive plasticity of serotonin axon terminals in levodopa-induced dyskinesia. Annals of Neurology. 68 (5), 619-628 (2010).
  35. Smith, R., et al. The role of pallidal serotonergic function in Parkinson's disease dyskinesias: a positron emission tomography study. Neurobiology of Aging. 36 (4), 1736-1742 (2015).
  36. Lundblad, M., et al. Pharmacological validation of a mouse model of l-DOPA-induced dyskinesia. Experimental Neurology. 194 (1), 66-75 (2005).
  37. Dekundy, A., Lundblad, M., Danysz, W., Cenci, M. A. Modulation of L-DOPA-induced abnormal involuntary movements by clinically tested compounds: further validation of the rat dyskinesia model. Behavioural Brain Research. 179 (1), 76-89 (2007).
  38. Blanchet, P. J., Konitsiotis, S., Chase, T. N. Amantadine reduces levodopa-induced dyskinesias in parkinsonian monkeys. Movement Disorders: Official Journal of the Movement Disorder Society. 13 (5), 798-802 (1998).
  39. Verhagen Metman, I., et al. Amantadine as treatment for dyskinesias and motor fluctuations in Parkinson's disease. Neurology. 50 (5), 1323-1326 (1998).
  40. Cenci, M. A., Lundblad, M. Ratings of L-DOPA-induced dyskinesia in the unilateral 6-OHDA lesion model of Parkinson's disease in rats and mice. Current Protocols in Neuroscience. , Chapter 9, Unit 9 25 (2007).
  41. Dupre, K. B., et al. Effects of coincident 5- HT1A receptor stimulation and NMDA receptor antagonism on L-DOPA-induced dyskinesia and rotational behaviors in the hemi-parkinsonian rat. Psychopharmacology (Berl). 199 (1), 99-108 (2008).
  42. Guimarães, P. R., Bariotto-dos-Santos, K., Ribeiro, D. L., Padovan-Neto, F. E. The 6-hydroxydopamine (6-OHDA) rat model of Parkinson's disease. Journal of Visualized Experiments: JoVE. , (2021).
  43. Paxinos, G., Watson, C. The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates. , Academic Press. New York. (1998).
  44. Tseng, K. Y., et al. Inhibition of striatal soluble guanylyl cyclase-cGMP signaling reverses basal ganglia dysfunction and akinesia in experimental parkinsonism. PloS One. 6 (11), 27187 (2011).
  45. Padovan-Neto, F. E., et al. Selective regulation of 5-HT1B serotonin receptor expression in the striatum by dopamine depletion and repeated L-DOPA treatment: Relationship to L-DOPA-induced dyskinesias. Molecular Neurobiology. 57 (2), 736-751 (2020).
  46. Olsson, M., Nikkhah, G., Bentlage, C., Bjorklund, A. Forelimb akinesia in the rat Parkinson model: Differential effects of dopamine agonists and nigral transplants as assessed by a new stepping test. Journal of Neuroscience. 15, 3863-3875 (1995).
  47. Chang, J. W., Wachtel, S. R., Young, D., Kang, U. J. Biochemical and anatomical characterization of forepaw adjusting steps in rat models of Parkinson's disease lesions. Neuroscience. 88, 617-628 (1995).
  48. Jayasinghe, V. R., Flores-Barrera, E., West, A. R., Tseng, K. Y. Frequency-dependent corticostriatal disinhibition resulting from chronic dopamine depletion: Role of local striatal cGMP and GABAAR signaling. Cerebral Cortex. 27, 625-634 (2017).
  49. Picconi, B., et al. Loss of bidirectional striatal synaptic plasticity in L-DOPA-induced dyskinesia. Nature Neuroscience. 6 (5), 501-506 (2003).
  50. Carta, M., et al. Role of striatal L-DOPA in the production of dyskinesia in 6-hydroxydopamine lesioned rats. Journal of Neurochemistry. 96 (6), 1718-1727 (2006).
  51. Westin, J. E., Andersson, M., Lundblad, M., Cenci, M. A. Persistent changes in striatal gene expression induced by long-term L-DOPA treatment in a rat model of Parkinson's disease. The European Journal of Neuroscience. 14 (7), 1171-1176 (2001).
  52. Bariotto-Dos-Santos, K., et al. Repurposing an established drug: an emerging role for methylene blue in L-DOPA-induced dyskinesia. The European Journal of Neuroscience. 49 (6), 869-882 (2018).
  53. Lindgren, H. S., Lane, E. L. Rodent Models of l-DOPA-Induced Dyskinesia. Animal Models of Movement Disorders. Neuromethods. Lane, E., Dunnett, S. 61, Humana Press. (2011).
  54. Doucet, J., et al. Drug-drug interactions related to hospital admissions in older adults: A prospective study of 1000 patients. Journal of the American Geriatrics Society. 44, 944-948 (1996).
  55. Ohlin, K. E., et al. Vascular endothelial growth factor is upregulated by L-dopa in the parkinsonian brain: implications for the development of dyskinesia. Brain: A Journal of Neurology. 134, Pt 8 2339-2357 (2011).
  56. Jourdain, V. A., et al. Increased putamen hypercapnic vasoreactivity in levodopa-induced dyskinesia. JCI insight. 2 (20), 96411 (2017).
  57. Thiele, S. L., et al. Generation of a model of l-DOPA-induced dyskinesia in two different mouse strains. Journal of Neuroscience Methods. 197 (2), 193-208 (2011).
  58. Dos-Santos-Pereira, M., et al. Contributive role of TNF-α to L-DOPA-induced dyskinesia in a unilateral 6-OHDA lesion model of Parkinson's disease. Frontiers in Pharmacology. 11, 617085 (2021).
  59. Cenci, M. A., Ohlin, K. E., Odin, P. Current options and future possibilities for the treatment of dyskinesia and motor fluctuations in Parkinson's disease. CNS & Neurological Disorders Drug Targets. 10 (6), 670-684 (2011).
  60. Cenci, M. A. Presynaptic mechanisms of l-DOPA-induced dyskinesia: The findings, the debate, and the therapeutic implications. Frontiers in Neurology. 5, 242 (2014).
  61. Langston, J. W., Quik, M., Petzinger, G., Jakowec, M., Di Monte, D. A. Investigating levodopa-induced dyskinesias in the parkinsonian primate. Annals of Neurology. 47 (4), Suppl 1 79-89 (2000).
  62. Chase, T. N. Levodopa therapy: consequences of the nonphysiologic replacement of dopamine. Neurology. 50 (5), Suppl 5 17-25 (1998).

Tags

Биология выпуск 176 болезнь Паркинсона базальные ганглии 6-гидроксидофамин L-DOPA-индуцированные дискинезии аномальные непроизвольные движения
Рейтинг L-DOPA-индуцированных дискинезий в одностороннем 6-OHDA-пораженном крысиной модели болезни Паркинсона
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bariotto-dos-Santos, K., Ribeiro, D. … More

Bariotto-dos-Santos, K., Ribeiro, D. L., Guimarães, R. P., Padovan-Neto, F. E. Rating L-DOPA-Induced Dyskinesias in the Unilaterally 6-OHDA-Lesioned Rat Model of Parkinson's Disease. J. Vis. Exp. (176), e62924, doi:10.3791/62924 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter