Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Betyg L-DOPA-inducerad dyskinesier i den ensidigt 6-OHDA-lesionerade råttmodellen av Parkinsons sjukdom

Published: October 4, 2021 doi: 10.3791/62924
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1
1Department of Psychology, Faculty of Philosophy, Sciences and Letters of Ribeirão Preto, University of São Paulo
* These authors contributed equally

Summary

Gnagare modeller av L-DOPA-inducerad dyskinesier är ovärderliga verktyg för att identifiera terapeutiska ingrepp för att dämpa utvecklingen eller lindra de manifestationer som uppstår på grund av upprepad administrering av L-DOPA. Detta protokoll visar hur man inducerar och analyserar dyskinetisk-liknande rörelser i den ensidigt 6-OHDA-lesionerade råttmodellen av Parkinsons sjukdom.

Abstract

L-DOPA-inducerade dyskinesier (LIDs) hänvisar till motoriska komplikationer som uppstår vid långvarig administrering av L-DOPA till patienter med Parkinsons sjukdom (PD). Det vanligaste mönstret som observerats i kliniken är toppdosdyskinesi som består av kliniska manifestationer av choreiforma, dystoniska och ballistiska rörelser. 6-hydroxidopamin (6-OHDA) råtta modell av PD efterliknar flera egenskaper hos LIDs. Efter upprepad administrering av L-DOPA, 6-OHDA-lesionerade råttor uppvisar dyskinetiska-liknande rörelser (t.ex., onormala ofrivilliga rörelser, AIMs). Detta protokoll visar hur man inducerar och analyserar AIM hos 6-OHDA-lesionerade råttor med 90% -95% dopaminerg utarmning i den nigrostriatala vägen. Upprepad administrering (3 veckor) av L-DOPA (5 mg/kg, i kombination med 12,5 mg/kg benserazid) kan inducera utvecklingen av AIMs. Tidsförloppsanalysen avslöjar en signifikant ökning av AIM vid 30-90 min (toppdos dyskinesi). Gnagarmodeller av LIDs är ett viktigt prekliniskt verktyg för att identifiera effektiva antidyskinetiska ingrepp.

Introduction

Dopaminprekursorn L-3,4-dihydroxifenylalanin (L-DOPA) representerar den mest effektiva behandlingen för motoriska symtom på Parkinsons sjukdom (PD)1. L-DOPA-behandling kan lindra motoriska symtom i samband med PD men förlorar effektivitet med tiden. Motoriska fluktuationer såsom "avslitningsfluktuation" eller "försämring i slutet av dosen" manifesteras kliniskt som en förkortad varaktighet av effekten av enstaka L-DOPA-doser2. I andra fall består kliniska manifestationer av långsamma vridande rörelser och onormala ställningar (dystoni)3 och uppträder när dopaminnivåerna är låga (dystoni utanför perioden)4. Å andra sidan, L-DOPA-inducerade dyskinesier (LIDs) visas när dopaminnivåer i plasma och hjärnan är höga5.

LIDs producerar försvagande biverkningar som inkluderar motoriska komplikationer som choreiform, dystoniska och ballistiska6-rörelser. När de väl är etablerade inträffar LIDs efter varje L-DOPA-administrering. Motoriska komplikationer förekommer hos 40%-50% av PD-patienter som genomgår L-DOPA-behandling i 5 år, och förekomsten ökar under åren7. Även om de patofysiologiska mekanismerna som är involverade i utvecklingen av LIDs hos PD-patienter ännu inte är helt klarlagda, är omfattningen av dopaminerg denervation, pulserande L-DOPA-administrering, nedströms förändringar i striatala proteiner och gener och avvikelser i icke-dopamin-sändarsystem faktorer som bidrar till utvecklingen av dessa oönskade biverkningar 6,8,9,10.

Neurotoxinet 6-hydroxidopamin (6-OHDA) är ett väl karakteriserat verktyg för att studera PD hos gnagare11,12,13,14. Eftersom 6-OHDA inte passerar blod-hjärnbarriären måste den injiceras direkt i den nigrostriatala vägen. 6-OHDA-inducerad dopaminerg utarmning är koncentrations- och platsberoende15. Ensidig administrering av 6-OHDA vid det mediala framhjärnknippet (MFB) kan ge allvarliga (>90%) nigrostriatala skador hos gnagare16,17,18,19. Kronisk administrering av L-DOPA till svåra ensidigt 6-OHDA-lesionerade gnagare orsakar uppkomsten av dyskinetiska-liknande rörelser som kallas onormala ofrivilliga rörelser (AIMs). Dyskinetiska rörelser hos gnagare delar liknande molekylära, funktionella och farmakologiska mekanismer relaterade till LIDs hos PD-patienter5. Därför är 6-OHDA-lesionerade råttor20 och möss21 värdefulla prekliniska modeller för att studera LIDs. Vid kroniskt behandling (7-21 dagar) med terapeutiska doser av L-DOPA (5-20 mg/kg) visar ensidigt 6-OHDA-lesionerade råttor och möss en gradvis utveckling av AIM som påverkar frambenen, bålen och orofaciala muskler kontralateralt till lesionen 17,18,19,20,22,23,24 . Dessa rörelser presenteras vid en tidsförlopp som liknar L-DOPA-inducerad toppdosdyskinesier hos PD-patienter25 och kännetecknas av hyperkinetiska rörelser och dystoni5. AIM poängsätts vanligtvis baserat på deras svårighetsgrad (t.ex. när ett specifikt AIM är närvarande) och amplitud (t.ex. kännetecknad av amplituden för varje rörelse)5,23,25.

6-OHDA-lesionerade gnagarmodeller av LIDs presenterar ansiktsgiltighet (dvs. modellen har flera egenskaper som ser ut som det mänskliga tillståndet)5,11,26,27,28. Gnagare AIMs, liknande det som förekommer hos PD-patienter, ses som hyperkinetiska (framben och orolinguala) och dystoniska (axiella) rörelser29 och efterliknar toppdos dyskinesi. På molekylär och funktionell nivå delar gnagarmodeller många patologiska egenskaper med PD-patienter5, såsom uppreglering av FosB/ΔFosB 19,26,30,31,32,33 och serotonintransportör (SERT)34,35 . När det gäller prediktiv validitet uppvisar läkemedel som minskar LIDs hos PD-patienter (t.ex. N-metyl-D-aspartat (NMDA) receptorantagonisten amantadin) antidyskinetisk effekt i gnagarmodellen 22,36,37,38,39.

Gnagarnas AIMS-skattningsskala skapades baserat på fyra AIM-undertyper som inkluderar AIM som påverkar huvud, nacke och bål (axiella AMM), hyperkinetiska frambensrörelser (lem-AIM) och dyskinetisk-liknande orolinguala rörelser (orolinguala AIM). Även om kontralateral rotation (lokomotiv AIMs) också finns i ensidigt skadade gnagare 20,22,23,25,40, har den inte poängsatts som en dyskinetiskliknande rörelse eftersom den kanske inte representerar ett specifikt mått på LIDs 22,37,41.

Här kommer vi att beskriva hur man inducerar och analyserar dyskinetiskliknande rörelser (axiella, lemmar och orolinguala AMM) i den svåra (>90%) ensidigt 6-OHDA-lesionerade råttmodellen av PD. Vi organiserade vårt protokoll baserat på tidigare litteratur och vår laboratorieexpertis.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alla experiment utfördes i enlighet med etikkommittén vid fakulteten för filosofi, vetenskap och brev från Ribeirão Preto (CEUA/FFCLRP 18.5.35.59.5).

1. 6-OHDA lesion

  1. Använd Sprague-Dawley hanråttor som väger 200-250 g i början av experimenten (6 veckor). Inhys djuren (2-3 per bur) under normala laboratorieförhållanden (12:12 h ljus/mörk cykel, lampor tända kl. 06.00, temperaturkontrollerade anläggningar (22–24 °C), med mat och vatten tillgängligt ad libitum.
    OBS: En fullständig beskrivning av hur man genererar allvarliga 6-OHDA-lesionerade råttor beskrivs någon annanstans42.
  2. Acklimatisera djuren på lämpligt sätt innan ett försöksförfarande inleds.
  3. Administrera (intraperitonealt, i.p.) noradrenalintransportörhämmaren imipramin (20 mg/kg, upplöst i 0,9% saltlösning) 30 min före operationen.
    OBS: Imipramin administrering kommer att öka 6-OHDA selektivitet för dopaminerga nervceller.
  4. Administrera ketamin/xylazin (70/10 mg/kg) intraperitonealt.
  5. Se till att djuret är djupt bedövat av bristen på respons på tåklämman och placerad i ett benäget läge i den stereotaxiska apparaten på toppen av en värmedyna.
  6. Ta bort pälsen på huvudet och desinficera det kirurgiska området 3 gånger, alternerande mellan en jodbaserad skrubba och alkohol.
  7. Använd en skalpell för att göra ett snitt (ca 1 cm) i regionen där mikroinjektionen kommer att inträffa.
  8. Rengör skalleregionen med bomullspinne och se till att Bregma och Lambda exponeras.
  9. Se till att MFB stereotaxiska koordinater tas från bregma43,44,45: -4,3 mm främre, 1,6 mm lateral (höger sida) och 8,3 mm ventral (från dura mater).
  10. Administrera 6-OHDA med en hastighet av 0,4 μl/min (10 μg i 4 μl saltlösning innehållande 0,1 % askorbinsyra) ensidigt i den högra mediala framhjärnbunten (MFB) med en 50 μl Hamilton-glasspruta.
  11. I slutet av operationen, suturera hårbotten snitt och rehydrera djuret med varm (~ 37 ° C) steril 0,9% saltlösning (~ 10 ml / kg, s.c.).
  12. Ta bort djuret från den stereotaxiska ramen och placera det i en uppvärmd återhämtningsbur. Övervaka tills medvetandet återfås.
  13. Bedöm effektiviteten av den dopaminerga lesionen 4 veckor efter lesionen med hjälp av ett stegtest46,47.
    OBS: I detta test bedöms akinesi i frambenet kontralateralt till lesionen genom antalet justeringssteg med forepaw kontralateralt till lesionen. Råttor som uppvisar tre eller färre justeringssteg med det kontralaterala frambenet ingår i studien som förmodade allvarligt 6-OHDA-lesionerade råttor48.

2. L-DOPA kronisk behandling

  1. Starta den kroniska behandlingen på måndag, 4 veckor efter 6-OHDA-lesionen.
    OBS: Eftersom AIMs kommer att videofilmas i 3 på varandra följande dagar per vecka (onsdag, torsdag och fredag) i 3 veckor, rekommenderas att behandlingen påbörjas på måndag.
  2. Behandla råttorna med nyberedd L-DOPA (via subkutan (s.c.), 1 ml/kg) plus benserazidhydroklorid (5 mg/kg respektive 12,5 mg/kg) i 3 veckor, en gång dagligen från måndag till fredag45.
    OBS: När de väl är etablerade kommer AIMs att manifesteras med varje administrering av L-DOPA. Därför är administrering av L-DOPA 2-4 gånger i veckan efter 3-veckors induktionsperiod tillräcklig för att upprätthålla ett stabilt uttryck av AIMs48.

3. AIMs inspelning och poängsättning

  1. Utför experiment mellan 09:00 h och 17:00 h. Se till att prövaren är helt omedveten om råttornas identitet och farmakologiska behandling.
  2. Placera försiktigt råttan i en transparent cylinder (20 cm diameter x 40 cm lång) och låt den acklimatisera sig i minst 15 min. Se till att golvet är täckt med sängmaterialet. Speglar måste placeras bakom cylindern så att experimenten kan observera djuret från alla möjliga vinklar.
    OBS: Om det finns mer än en råtta per experiment, använd en cylinder för varje råtta. Manipulation av djuren mellan sessioner kan störa beteendeanalysen.
  3. Placera en högupplöst videokamera på ett sätt som gynnar visning av axiella, lemmar och orolinguala AMM. Eftersom rotationsbeteende är närvarande under dessa experimentella förhållanden, kommer speglarna bakom cylindern att möjliggöra spårning av AIM i en 360 ° vinkel. Använd ett stativ eller fäst kameran direkt på bänken.
    OBS: Orolingual AIMs kan vara utmanande att göra poäng, särskilt om det finns en hög förekomst av rotationsbeteende. Att spela in videor med kameran placerad något under planet där djuren befinner sig i 15 ° vinkel hjälper till att observera denna rörelseundertyp.
  4. Ta försiktigt bort djuret från cylindern och administrera L-DOPA (5 mg/kg kombinerat med 12,5 mg/kg benserazid, s.c.).
  5. Sätt tillbaka djuret i cylindern och starta en timer för att spåra AIM efter L-DOPA-injektion. Använd en videokamera för att spela in AIM i 180 minuter efter injektionen av L-DOPA. Även om analysen kan utföras genom direkt observation av djuret, föredras offline-poängsättning.
    OBS: Se till att timern också är videofilmad så att AIMs kan poängsättas vid exakta tidpunkter efter L-DOPA-administration.
  6. Poängsätt AIM med 30 minuters intervall upp till 180 min injektion efter L-DOPA (se tabell 1 för definitioner) som ursprungligen beskrevs20,23. Poängen måste ges under 1-2 minuters epoker och klassificeras som axiella, lemmar eller orolinguala (figur 1).
  7. Observera noggrant varje AIM och attributpoäng för svårighetsgrad och amplitud. Använd tabell 1 för instruktioner. Inkludera inte normala beteenden, som uppfödning, sniffning, grooming och gnagning i betyget. Det kommer att finnas totalt sex observationsperioder (30, 60, 90, 120, 150 och 180 min).
UNDERTYPER
Axiell: vridning av huvud, nacke och bagageutrymme
Limb: ofrivilliga rörelser av både distala och proximala framben
Orolingual: ofrivilliga rörelser i orofaciala muskler
STRÄNGHET
0: Frånvarande
1: Tillfällig (med avbrott, närvarande i mindre än hälften av observationstiden)
2: Frekvent (med avbrott men närvarande i mer än hälften av observationstiden)
3: Kontinuerlig men avbruten av yttre sensoriska stimuli
4: Kontinuerlig och inte avbruten av yttre sensoriska stimuli
AMPLITUD
Axial
1: Torsion av huvud och nacke i ca 30° vinkel
2: Torsion av huvud och nacke vid cirka 30 ° < vinkel ≤ 60 °
3: Torsion av huvud, nacke och övre bagageutrymme vid cirka 60 ° < vinkel ≤ 90 °
4: Torsion av huvud, nacke och bål i > 90 ° vinkel, vilket ofta får råttan att tappa balansen
Lem
1: Små ofrivilliga rörelser i det distala frambenet
2: Rörelser med låg amplitud som orsakar translokation av både distala och proximala framben
3: Ofrivilliga rörelser i hela lemmen, inklusive axelmuskler
4: Starka lem- och axelrörelser, som ofta liknar ballism
Orolingual
1: Små ofrivilliga rörelser i orofaciala muskler
2: Orofaciala rörelser med hög amplitud med tungutsprång

Tabell 1: Definition av AIMS och betygskriterier.

Figure 1
Figur 1: Sekvens av foton som visar varje AIM-undertyp. (A till A'") Axiell AIM som visar dystoniska rörelser i olika vinklar (A: 30° vinkel, A': 30° < vinkel ≤ 60°, A": 60° < vinkel ≤ 90°, och A'": > 90° vinkel). (B till B") Limb AIM (svarta pilar) som visar ofrivilliga rörelser av distala (B och B ') och hela frambenet (inklusive axel, B"). (C) Orolingual AIM (röd pil) med hög amplitud med tungutsprång. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

4. Analys av data

  1. Beräkna axiala, lemmar eller orolinguala AIM-subtyper genom att multiplicera svårighetsgraden och amplitudpoängen för varje observationsperiod efter administrering av L-DOPA (dvs. sex observationsperioder) som tidigare beskrivits20. Den teoretiska maximala poäng som ett djur kan ackumulera under en testsession är 240 (högsta poäng per observationsperiod är 40, se tabell 1 för detaljer).
  2. Plotta AIM-poäng för alla de sex observationsperioder som registrerats på onsdag, torsdag och fredag under de 3 veckorna av kronisk L-DOPA-administrering (figur 2). AIM kan summeras för att ange varje djurs maximala poäng på varje poängdag (figur 3) eller varje vecka (figur 4) under de 3 veckorna av kronisk administrering av L-DOPA.
  3. Kontrollera om data har en fördelning nära det normala innan du väljer den statistiska analysmetoden.
    OBS: AIMs betygsskalor består av ordinära data och kan analyseras med icke-parametrisk statistik. Parametriska tester används ofta när man jämför AIMs-poäng mellan experimentella grupper efter upprepade testsessioner40.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Även om de AIMS-mönster som observerats hos råttor är enklare och begränsade jämfört med de som observerats hos människor och icke-mänskliga primater, reproducerar denna modell både hyperkinetiska och dystoniska rörelser inducerade av kronisk L-DOPA-administrering. Här presenterar vi data som samlats in från en grupp (n = 10) av ensidigt 6-OHDA-lesionerade råttor kroniskt behandlade med L-DOPA (5 mg/kg kombinerat med 12,5 mg/kg benserazid) i 3 veckor (måndag till fredag). Observera att de data som presenteras i figur 2, figur 3 och figur 4 kommer från samma djur.

Figur 2 visar tidsförloppsanalysen för poäng som tillämpas på axiella, lemmar och orolinguala AIM under 3 veckors kronisk L-DOPA-administrering. Varje AIM-poängundertyp vid en specifik observationsperiod rapporteras som multiplikationen av svårighetsgrad och amplitudpoäng i denna analys. Denna typ av analys kan vara lämplig för att utforska effekten av läkemedel som stör den tidsmässiga profilen för AIMs.Observera att L-DOPA-inducerad toppdosdyskinesier uppträder mellan 30-90 min med en gradvis minskning efter 120 min efter injektion (Figur 2).

Figure 2
Figur 2: Tidsförloppsanalys som visar axiella, lemmar och orolinguala AIM under 3 veckors kronisk administrering av L-DOPA (5 mg/kg kombinerat med 12,5 mg/kg benserazid) till 6-OHDA-lesionerade råttor. (A) Axiella, (B) lemmar och (C) orolinguala AIM poängsattes på onsdag, torsdag och fredag under 3 veckors kronisk L-DOPA-administrering. Varje AIM-subtyp rapporteras som multiplikation av svårighetsgrad gånger amplitud för var och en av de sex observationsperioderna. Varje AIM-subtyp kan analyseras individuellt eller summeras enligt vad som anges i (D). Observera att den högsta svårighetsgraden av AIMs gradvis kommer att öka under den första veckan av kronisk L-DOPA administrering. Data uttrycks som medelvärde ± SEM (n = 10). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 3 visar summan av AIM-poäng som presenteras för alla de sex observationsperioder som visas i figur 2 (datauppsättningar är färgkodade för enkla jämförelser). Denna analys indikerar varje djurs maximala poäng på varje poängdag (onsdag, torsdag, och fredag) under de 3 veckorna av kronisk L-DOPA administrering. Denna typ av analys kan vara fördelaktig för att utforska effekten av föreningar med potentiella antidyskinetiska profiler, särskilt eftersom AIMs poäng är stabila under vecka 2 och 3 av kronisk L-DOPA-administrering. Dessutom kan veckovisa AIMS-poäng (figur 4) genereras från summan av poäng som tillskrivs 6-OHDA-lesionerade råttor på onsdag, torsdag och fredag.

Figure 3
Figur 3: Summan av axiella, lemmar och orolinguala AIM på individuella poängdagar under 3 veckors kronisk administrering av L-DOPA (5 mg/kg kombinerat med 12,5 mg/kg benserazid) till 6-OHDA-lesionerade råttor. I den här figuren summerades AIM-poäng som presenterades i var och en av de sex observationsperioderna (se detaljer i figur 2-legenden). Enskilda datauppsättningar färgkodades för att jämföras med de data som visas i figur 2. Denna analys indikerar varje djurs maximala poäng på varje poängdag (onsdag - W, torsdag - T och fredag - F) efter 3 veckors kronisk L-DOPA-administrering. (A) Axiell, (B) lem och (C) Orolingual AIMs. (D) Summan av axiella, lemmar och orolinguala AIM. Envägs upprepade åtgärder ANOVA och Holm-Sidak post-hoc test avslöjade att AIMs ökar gradvis över kronisk administrering av L-DOPA. Observera att AIMs-poängen är stabila under vecka 2 och 3 av kronisk L-DOPA-administrering (*p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001 jämfört med onsdag (W) vecka 1). Data uttrycks som medelvärde ± SEM (n = 10). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4: Summan av veckovisa axiella, lemmar och orolinguala AIM under kronisk administrering av L-DOPA (5 mg/kg kombinerat med 12,5 mg/kg benserazid) till 6-OHDA-lesionerade råttor. I den här figuren summerades AIM:er som poängsattes varje vecka (onsdag, torsdag och fredag - se figur 3). Denna analys indikerar varje djurs maximala poäng på varje vecka av kronisk L-DOPA administrering. (A) Axiell, (B) lem och (C) Orolingual AIMs. (D) Summan av axiella, lemmar och orolinguala AIM. Envägs upprepade åtgärder ANOVA och Holm-Sidak post-hoc test avslöjade att AIMs ökar jämfört med kronisk administrering av L-DOPA (*p < 0,05 jämfört med vecka 1). Data uttrycks som medelvärde ± SEM (n = 10). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Detta protokoll visar hur man inducerar och analyserar AIM i råttmodellen av PD inducerad genom ensidig mikroinjektion av 6-OHDA i MFB. Kronisk daglig administrering av låga doser av L-DOPA (5 mg/kg, i kombination med 12,5 mg/kg benserazid) gav upphov till utveckling av AIM under de 3 veckorna av behandlingen. Temporal analys avslöjade en signifikant ökning av AIMs, och toppdosdyskinesi observeras mellan 30 och 90 min efter administrering av L-DOPA. AIM är repetitiva och meningslösa rörelser som påverkar axiala, lemmar och orolinguala muskler. Protokollet och de data som presenteras här överensstämmer med den tidigare litteraturen 22,23,49,50,51.

Den axiella, lemmade och orolinguala AIM-klassificeringsskalan är mycket känslig eftersom den betygsätter den tid (dvs. svårighetsgrad) som gnagarna visar dyskinetiska rörelser och indikerar amplituden för dessa rörelser20. AIM-poäng kan uttryckas i olika tidsupplösningar (se figur 2, figur 3, figur 4)17,18,19,52. Flera studier har behandlat rollen av L-DOPA dosering på utvecklingen av AIMs. Kronisk administrering av lägre doser av L-DOPA (5-20 mg/kg) gynnar en gradvis utveckling av AIMs framför behandlingen, medan höga doser av L-DOPA (25 mg/kg eller mer) resulterar i en snabb och robust utveckling av AIMs 23,25,27,53. Intressant nog kan en andel av svåra 6-OHDA-lesionerade djur inte utveckla AIM (eller ha mycket låga AIMS-poäng) efter kronisk administrering av låga doser av L-DOPA40,49,53. Det är också viktigt att överväga L-DOPA: s administreringsväg. Även om AIMs delar liknande debut, tidsprofil och svårighetsgradgrad 40, har det visats att dos-misslyckandeepisoder ofta inträffade hos råttor som behandlades intraperitonealt27. Också, i.p. administrering av L-DOPA producerade interindividuella variationer i plasmanivåer, en effekt som inte observerades efter s.c. injektioner27.

I denna studie var AIM tydliga hos djur med allvarlig nigrostriatal skada (över 90% av dopaminerg utarmning). Massiv förlust av striatal dopaminerg innervation kännetecknas av en minskning av antalet justeringssteg som utförs med frambenet kontralateralt till lesionen48. Därför rekommenderar vi stegtestet för att välja djur med förmodade allvarliga 6-OHDA-lesioner vid nigrostriatal väg. Amfetamininducerat rotationstest används vanligtvis för att välja förmodade 6-OHDA-lesionerade råttor. Amfetamin ökar dopaminfrisättningen i det intakta striatumet, och därmed ökar den befintliga obalansen mellan det innerverade och denerverade striatumet. En intressant studie utförd på 312 6-OHDA-lesionerade råttor11 avslöjade emellertid ingen korrelation mellan amfetamininducerad rotation och tyrosinhydroxylaspositiva celler i ipsilateral substantia nigra pars compacta. Samma studie visade en dålig korrelation mellan amfetamininducerad rotation och svårighetsgraden av AIMs.

Det finns ett tydligt samband mellan fenomenologin hos AIMs och mönstret för nigrostriatal dopaminerg utarmning20. 6-OHDA-råttmodellen av PD som vi använde i detta protokoll utvecklar allvarlig ensidig utarmning av nigrostriatala dopaminterminaler efter 6-OHDA-infusion i MFB. Helt dopamin-utarmade 6-OHDA-lesionerade råttor har en högre förekomst av AIMs jämfört med delvis dopamin-utarmade djur. En detaljerad analys av striatalt uttryck av neuropeptiderna dynorfin och enkefalin efter 6-OHDA-lesion och kronisk L-DOPA-administrering beskrivs någon annanstans45 och överensstämmer med tidigare litteratur23,25. På molekylär nivå delar dyskinetiska gnagare molekylära markörer associerade med dyskinesi som är uppenbar i icke-mänskliga primatmodeller av PD- och PD-patienter, såsom striatal uppreglering av ΔFosB-transkriptionsfaktor 26,32,33,54. Gnagarmodellen av PD visar också ökad mikrovesseldensitet i striatum som svar på L-DOPA-behandling55 på ett liknande sätt observerat hos putamen hos PD-patienter56. Gnagarmodeller av LIDs svarar på antidyskinetiska farmakologiska metoder som används i kliniken, såsom NMDA-receptorantagonisten amantadin 22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34, 35,36,37, 38,39. Sammantaget bekräftar dessa bevis ansiktsgiltigheten och prediktiv validitet hos 6-OHDA-råttmodellen för att karakterisera patofysiologin hos LIDs och för screening av föreningar med antidyskinetiska egenskaper. Mössmodellen av LIDs är också ett värdefullt verktyg för att studera flera aspekter av LIDs hos transgena möss. Protokoll för mössmodellen av LIDs finns i artiklar från olika forskargrupper 30,57,58.

Det är viktigt att notera att den 6-OHDA-lesionerade gnagarmodellen av LIDs har begränsningar. 6-OHDA-inducerad dopaminerg utarmning är akut jämfört med den progressiva karaktären av nigrostriatal utarmning hos PD-patienten5. Det kan också vara utmanande att hitta ett utmärkt terapeutiskt fönster för att använda ett antidyskinetiskt läkemedel hos patienter eftersom ökad dosering av ett läkemedel kan störa den positiva effekten som produceras av L-DOPA eller inducera biverkningar som kanske inte har observerats i djurmodellen59,60. En annan begränsning av råttmodellen av LIDs är bristen på fysisk likhet mellan AIM hos gnagare och manifestationen av de choreiforma rörelserna som observerats hos patienter och icke-mänskliga primater 10,61,62. En annan potentiell begränsning av protokollet som presenteras här är att AIM poängsätts var 30: e minut efter administrering av L-DOPA, men detta problem kan hanteras om experimentet videobandar alla djur i 180 minuter efter L-DOPA-administrering. Experimenteraren kan sedan justera poängprotokollet för mer frekvent poängsättning (t.ex. var 10: e eller 20: e minut). Detta tillvägagångssätt är fördelaktigt i experiment som kräver en mer dynamisk bild av AIM: s tidsförlopp (t.ex. kombinationen av AIMS-poäng och in vivo elektrofysiologiska eller neurokemiska inspelningar).

Sammanfattningsvis reproducerar 6-OHDA-råttmodellen av LID sjukdomens patofysiologi och utvecklar AIM som kan moduleras av läkemedel som används kliniskt. Även om det har begränsningar, representerar 6-OHDA-råttmodellen av LID fortfarande ett ovärderligt prekliniskt verktyg för att identifiera effektiva antidyskinetiska ingrepp med translationell potential.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har inga intressekonflikter.

Acknowledgments

Detta arbete stöddes av São Paulo Research Foundation (FAPESP, bidrag 2017/00003-0). Vi är tacksamma för samordningen för förbättring av personal inom högre utbildning (CAPES). Vi tackar Dr. Anthony R. West, Dr. Heinz Steiner och Dr. Kuei Y. Tseng för stöd och mentorskap.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
6-hydroxydopamine hydrobromide Sigma-Aldrich, USA H6507 Neurotoxin that produces degeneration of catecholaminergic terminals
Benzerazide hydrochloride Sigma B7283 Peripheral dopa-decarboxylase inhibitor
Camera Bullet IR Turbo HD (HD-TVI)  2.8mm B HIKVISION DS-2CE16C0T-IRP Camera used to record all behavior
Imipramine hidrochloride Alfa Aesar J63723 Norepinephrine transporter inhibitor (NET) used to protect noradrenergic neurons from 6-OHDA
Ketamine hydrochloride Ceva Animal Health Anesthesia for surgical intervention
L-3,4-dihydroxyphenylalanine (L-DOPA) methyl ester (hydrochloride) Cayman Chemical Company 16149 Dopamine precursor
Mirrors Used to observe the behavior of animals during experiments in all directions
Needles 0.30 x 13 mm PrecisionGlide Needles used to inject drugs
Sodium chloride (NaCl) Samtec Salt
Syringes 1 ml Sterile BD Plastipak Syringes used to inject drugs
Transparent cylinders Used to record animal behavior during experiments
Xylazine hydrochloride Ceva Animal Health Sedative, analgesic and muscle relaxant for surgical intervention

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Jenner, P. Molecular mechanisms of L-DOPA-induced dyskinesia. Nature Reviews. Neuroscience. 9 (9), 665-677 (2008).
  2. Nutt, J. G. Levodopa-induced dyskinesia: review, observations, and speculations. Neurology. 40 (2), 340-345 (1990).
  3. Luquin, M. R., Scipioni, O., Vaamonde, J., Gershanik, O., Obeso, J. A. Levodopa-induced dyskinesias in Parkinson's disease: clinical and pharmacological classification. Movement Disorders: Official Journal of the Movement Disorder Society. 7 (2), 117-124 (1992).
  4. Fabbrini, G., Brotchie, J. M., Grandas, F., Nomoto, M., Goetz, C. G. Levodopa-induced dyskinesias. Movement Disorders: Official Journal of the Movement Disorder Society. 22 (10), 1379 (2007).
  5. Cenci, M. A., Crossman, A. R. Animal models of l-dopa-induced dyskinesia in Parkinson's disease. Movement Disorders: Official Journal of the Movement Disorder Society. 33 (6), 889-899 (2018).
  6. Bastide, M. F., et al. Pathophysiology of L-dopa-induced motor and non-motor complications in Parkinson's disease. Progress in Neurobiology. 132, 96-168 (2015).
  7. Manson, A., Stirpe, P., Schrag, A. Levodopa-induced-dyskinesias clinical features, incidence, risk factors, management and impact on quality of life. Journal of Parkinson's Disease. 2 (3), 189-198 (2012).
  8. Grandas, F., Galiano, M. L., Tabernero, C. Risk factors for levodopa-induced dyskinesias in Parkinson's disease. Journal of Neurology. 246 (12), 1127-1133 (1999).
  9. Schrag, A., Quinn, N. Dyskinesias and motor fluctuations in Parkinson's disease. A community-based study. Brain: A Journal of Neurology. 123, Pt 11 2297-2305 (2000).
  10. Bezard, E., Brotchie, J. M., Gross, C. E. Pathophysiology of levodopa-induced dyskinesia: potential for new therapies. Nature Reviews. Neuroscience. 2 (8), 577-588 (2001).
  11. Tronci, E., Shin, E., Björklund, A., Carta, M. Amphetamine-induced rotation and L-DOPA-induced dyskinesia in the rat 6-OHDA model: a correlation study. Neuroscience Research. 73 (2), 168-172 (2012).
  12. Duty, S., Jenner, P. Animal models of Parkinson's disease: a source of novel treatments and clues to the cause of the disease. British Journal of Pharmacology. 164 (4), 1357-1391 (2011).
  13. Ungerstedt, U. 6-Hydroxy-dopamine induced degeneration of central monoamine neurons. European Journal of Pharmacology. 5 (1), 107-110 (1968).
  14. Ungerstedt, U. Postsynaptic supersensitivity after 6-hydroxy-dopamine induced degeneration of the nigro-striatal dopamine system. Acta Physiologica Scandinavica. Supplementum. 367, 69-93 (1971).
  15. Kirik, D., Rosenblad, C., Bjorklund, A. Characterization of behavioral and neurodegenerative changes following partial lesions of the nigrostriatal dopamine system induced by intrastriatal 6-hydroxydopamine in the rat. Experimental Neurology. 152, 259-277 (1998).
  16. Zahm, D. S. Compartments in rat dorsal and ventral striatum revealed following injection of 6-hydroxydopamine into the ventral mesencephalon. Brain Research. 552 (1), 164-169 (1991).
  17. Padovan-Neto, F. E., Echeverry, M. B., Tumas, V., Del-Bel, E. A. Nitric oxide synthase inhibition attenuates L-DOPA-induced dyskinesias in a rodent model of Parkinson's disease. Neuroscience. 159 (3), 927-935 (2009).
  18. Padovan-Neto, F. E., et al. Antidyskinetic effect of the neuronal nitric oxide synthase inhibitor is linked to decrease of FosB/deltaFosB expression. Neuroscience Letters. 541, 126-131 (2013).
  19. Padovan-Neto, F. E., Cavalcanti-Kiwiatkoviski, R., Carolino, R. O., Anselmo-Franci, J., Del Bel, E. Effects of prolonged neuronal nitric oxide synthase inhibition on the development and expression of L-DOPA-induced dyskinesia in 6-OHDA-lesioned rats. Neuropharmacology. 89, 87-99 (2015).
  20. Winkler, C., Kirik, D., Björklund, A., Cenci, M. A. L-DOPA-induced dyskinesia in the intrastriatal 6-hydroxydopamine model of parkinson's disease: relation to motor and cellular parameters of nigrostriatal function. Neurobiology of Disease. 10 (2), 165-186 (2002).
  21. Francardo, V., et al. Impact of the lesion procedure on the profiles of motor impairment and molecular responsiveness to l-DOPA in the 6-hydroxydopamine mouse model of Parkinson's disease. Neurobiology of Disease. 42, 327-340 (2011).
  22. Lundblad, M., et al. Pharmacological validation of behavioural measures of akinesia and dyskinesia in a rat model of Parkinson's disease. The European Journal of Neuroscience. 15 (1), 120-132 (2002).
  23. Cenci, M. A., Lee, C. S., Björklund, A. L-DOPA-induced dyskinesia in the rat is associated with striatal overexpression of prodynorphin- and glutamic acid decarboxylase mRNA. The European Journal of Neuroscience. 10 (8), 2694-2706 (1998).
  24. Henry, B., Crossman, A. R., Brotchie, J. M. Characterization of enhanced behavioral responses to L-DOPA following repeated administration in the 6-hydroxydopamine-lesioned rat model of Parkinson's disease. Experimental Neurology. 151 (2), 334-342 (1998).
  25. Lee, C. S., Cenci, M. A., Schulzer, M., Björklund, A. Embryonic ventral mesencephalic grafts improve levodopa-induced dyskinesia in a rat model of Parkinson's disease. Brain: A Journal of Neurology. 123, Pt 7 1365-1379 (2000).
  26. Andersson, M., Hilbertson, A., Cenci, M. A. Striatal fosB expression is causally linked with l-DOPA-induced abnormal involuntary movements and the associated upregulation of striatal prodynorphin mRNA in a rat model of Parkinson's disease. Neurobiology of Disease. 6 (6), 461-474 (1999).
  27. Lindgren, H. S., Rylander, D., Ohlin, K. E., Lundblad, M., Cenci, M. A. The "motor complication syndrome" in rats with 6-OHDA lesions treated chronically with L-DOPA: relation to dose and route of administration. Behavioural Brain Research. 177 (1), 150-159 (2007).
  28. Animal Models of Movement Disorders: volume I, Neuromethods. Lane, E. L., Dunnett, S. 61, Springer Science+Business Media. (2011).
  29. Carlsson, T., Carta, M., Winkler, C., Björklund, A., Kirik, D. Serotonin neuron transplants exacerbate l-DOPA-induced dyskinesias in a rat model of Parkinson's disease. Journal of Neuroscience. 27 (30), 8011-8022 (2007).
  30. Lundblad, M., Picconi, B., Lindgren, H., Cenci, M. A. A model of L-DOPA-induced dyskinesia in 6-hydroxydopamine lesioned mice: relation to motor and cellular parameters of nigrostriatal function. Neurobiology of Disease. 16 (1), 110-123 (2004).
  31. Fasano, S., et al. Inhibition of Ras-guanine nucleotide-releasing factor 1 (Ras-GRF1) signaling in the striatum reverts motor symptoms associated with L-dopa-induced dyskinesia. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (50), 21824-21829 (2010).
  32. Berton, O., et al. Striatal overexpression of DeltaJunD resets L-DOPA-induced dyskinesia in a primate model of Parkinson disease. Biological Psychiatry. 66 (6), 554-561 (2009).
  33. Lindgren, H. S., et al. Putaminal upregulation of FosB/ΔFosB-like immunoreactivity in Parkinson's disease patients with dyskinesia. Journal of Parkinson's Disease. 1 (4), 347-357 (2011).
  34. Rylander, D., et al. Maladaptive plasticity of serotonin axon terminals in levodopa-induced dyskinesia. Annals of Neurology. 68 (5), 619-628 (2010).
  35. Smith, R., et al. The role of pallidal serotonergic function in Parkinson's disease dyskinesias: a positron emission tomography study. Neurobiology of Aging. 36 (4), 1736-1742 (2015).
  36. Lundblad, M., et al. Pharmacological validation of a mouse model of l-DOPA-induced dyskinesia. Experimental Neurology. 194 (1), 66-75 (2005).
  37. Dekundy, A., Lundblad, M., Danysz, W., Cenci, M. A. Modulation of L-DOPA-induced abnormal involuntary movements by clinically tested compounds: further validation of the rat dyskinesia model. Behavioural Brain Research. 179 (1), 76-89 (2007).
  38. Blanchet, P. J., Konitsiotis, S., Chase, T. N. Amantadine reduces levodopa-induced dyskinesias in parkinsonian monkeys. Movement Disorders: Official Journal of the Movement Disorder Society. 13 (5), 798-802 (1998).
  39. Verhagen Metman, I., et al. Amantadine as treatment for dyskinesias and motor fluctuations in Parkinson's disease. Neurology. 50 (5), 1323-1326 (1998).
  40. Cenci, M. A., Lundblad, M. Ratings of L-DOPA-induced dyskinesia in the unilateral 6-OHDA lesion model of Parkinson's disease in rats and mice. Current Protocols in Neuroscience. , Chapter 9, Unit 9 25 (2007).
  41. Dupre, K. B., et al. Effects of coincident 5- HT1A receptor stimulation and NMDA receptor antagonism on L-DOPA-induced dyskinesia and rotational behaviors in the hemi-parkinsonian rat. Psychopharmacology (Berl). 199 (1), 99-108 (2008).
  42. Guimarães, P. R., Bariotto-dos-Santos, K., Ribeiro, D. L., Padovan-Neto, F. E. The 6-hydroxydopamine (6-OHDA) rat model of Parkinson's disease. Journal of Visualized Experiments: JoVE. , (2021).
  43. Paxinos, G., Watson, C. The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates. , Academic Press. New York. (1998).
  44. Tseng, K. Y., et al. Inhibition of striatal soluble guanylyl cyclase-cGMP signaling reverses basal ganglia dysfunction and akinesia in experimental parkinsonism. PloS One. 6 (11), 27187 (2011).
  45. Padovan-Neto, F. E., et al. Selective regulation of 5-HT1B serotonin receptor expression in the striatum by dopamine depletion and repeated L-DOPA treatment: Relationship to L-DOPA-induced dyskinesias. Molecular Neurobiology. 57 (2), 736-751 (2020).
  46. Olsson, M., Nikkhah, G., Bentlage, C., Bjorklund, A. Forelimb akinesia in the rat Parkinson model: Differential effects of dopamine agonists and nigral transplants as assessed by a new stepping test. Journal of Neuroscience. 15, 3863-3875 (1995).
  47. Chang, J. W., Wachtel, S. R., Young, D., Kang, U. J. Biochemical and anatomical characterization of forepaw adjusting steps in rat models of Parkinson's disease lesions. Neuroscience. 88, 617-628 (1995).
  48. Jayasinghe, V. R., Flores-Barrera, E., West, A. R., Tseng, K. Y. Frequency-dependent corticostriatal disinhibition resulting from chronic dopamine depletion: Role of local striatal cGMP and GABAAR signaling. Cerebral Cortex. 27, 625-634 (2017).
  49. Picconi, B., et al. Loss of bidirectional striatal synaptic plasticity in L-DOPA-induced dyskinesia. Nature Neuroscience. 6 (5), 501-506 (2003).
  50. Carta, M., et al. Role of striatal L-DOPA in the production of dyskinesia in 6-hydroxydopamine lesioned rats. Journal of Neurochemistry. 96 (6), 1718-1727 (2006).
  51. Westin, J. E., Andersson, M., Lundblad, M., Cenci, M. A. Persistent changes in striatal gene expression induced by long-term L-DOPA treatment in a rat model of Parkinson's disease. The European Journal of Neuroscience. 14 (7), 1171-1176 (2001).
  52. Bariotto-Dos-Santos, K., et al. Repurposing an established drug: an emerging role for methylene blue in L-DOPA-induced dyskinesia. The European Journal of Neuroscience. 49 (6), 869-882 (2018).
  53. Lindgren, H. S., Lane, E. L. Rodent Models of l-DOPA-Induced Dyskinesia. Animal Models of Movement Disorders. Neuromethods. Lane, E., Dunnett, S. 61, Humana Press. (2011).
  54. Doucet, J., et al. Drug-drug interactions related to hospital admissions in older adults: A prospective study of 1000 patients. Journal of the American Geriatrics Society. 44, 944-948 (1996).
  55. Ohlin, K. E., et al. Vascular endothelial growth factor is upregulated by L-dopa in the parkinsonian brain: implications for the development of dyskinesia. Brain: A Journal of Neurology. 134, Pt 8 2339-2357 (2011).
  56. Jourdain, V. A., et al. Increased putamen hypercapnic vasoreactivity in levodopa-induced dyskinesia. JCI insight. 2 (20), 96411 (2017).
  57. Thiele, S. L., et al. Generation of a model of l-DOPA-induced dyskinesia in two different mouse strains. Journal of Neuroscience Methods. 197 (2), 193-208 (2011).
  58. Dos-Santos-Pereira, M., et al. Contributive role of TNF-α to L-DOPA-induced dyskinesia in a unilateral 6-OHDA lesion model of Parkinson's disease. Frontiers in Pharmacology. 11, 617085 (2021).
  59. Cenci, M. A., Ohlin, K. E., Odin, P. Current options and future possibilities for the treatment of dyskinesia and motor fluctuations in Parkinson's disease. CNS & Neurological Disorders Drug Targets. 10 (6), 670-684 (2011).
  60. Cenci, M. A. Presynaptic mechanisms of l-DOPA-induced dyskinesia: The findings, the debate, and the therapeutic implications. Frontiers in Neurology. 5, 242 (2014).
  61. Langston, J. W., Quik, M., Petzinger, G., Jakowec, M., Di Monte, D. A. Investigating levodopa-induced dyskinesias in the parkinsonian primate. Annals of Neurology. 47 (4), Suppl 1 79-89 (2000).
  62. Chase, T. N. Levodopa therapy: consequences of the nonphysiologic replacement of dopamine. Neurology. 50 (5), Suppl 5 17-25 (1998).

Tags

Biologi Fråga 176 Parkinsons sjukdom basala ganglier 6-hydroxidopamin L-DOPA-inducerad dyskinesier onormala ofrivilliga rörelser
Betyg L-DOPA-inducerad dyskinesier i den ensidigt 6-OHDA-lesionerade råttmodellen av Parkinsons sjukdom
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bariotto-dos-Santos, K., Ribeiro, D. … More

Bariotto-dos-Santos, K., Ribeiro, D. L., Guimarães, R. P., Padovan-Neto, F. E. Rating L-DOPA-Induced Dyskinesias in the Unilaterally 6-OHDA-Lesioned Rat Model of Parkinson's Disease. J. Vis. Exp. (176), e62924, doi:10.3791/62924 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter