Calificación de discinesias inducidas por L-DOPA en el modelo de rata lesionada unilateralmente con 6-OHDA de la enfermedad de Parkinson

Summary

Los modelos de roedores de discinesias inducidas por L-DOPA son herramientas invaluables para identificar intervenciones terapéuticas para atenuar el desarrollo o aliviar las manifestaciones que surgen debido a la administración repetida de L-DOPA. Este protocolo demuestra cómo inducir y analizar movimientos discinéticos en el modelo de rata con lesión unilateral de 6-OHDA de la enfermedad de Parkinson.

Abstract

Las discinesias inducidas por L-DOPA (LID) se refieren a complicaciones motoras que surgen de la administración prolongada de L-DOPA a pacientes con enfermedad de Parkinson (EP). El patrón más común observado en la clínica es la discinesia de dosis máxima, que consiste en manifestaciones clínicas de movimientos coreiformes, distónicos y balísticos. El modelo de rata 6-hidroxidopamina (6-OHDA) de PD imita varias características de los LID. Después de la administración repetida de L-DOPA, las ratas con lesión de 6-OHDA exhiben movimientos discinéticos (por ejemplo, movimientos involuntarios anormales, AIMs). Este protocolo demuestra cómo inducir y analizar AIMs en ratas con lesión 6-OHDA con 90% -95% de depleción dopaminérgica en la vía nigroestriatal. La administración repetida (3 semanas) de L-DOPA (5 mg/kg, combinado con 12,5 mg/kg de benserazida) puede inducir el desarrollo de AIMs. El análisis del curso del tiempo revela un aumento significativo de los MIA a los 30-90 min (discinesia de dosis máxima). Los modelos de LID en roedores son una herramienta preclínica importante para identificar intervenciones antidiscinéticas efectivas.

Introduction

El precursor de la dopamina L-3,4-dihidroxifenilalanina (L-DOPA) representa el tratamiento más eficaz para los síntomas motores de la enfermedad de Parkinson (EP)¹. La terapia con L-DOPA puede mejorar los síntomas motores asociados con la EP, pero pierde efectividad con el tiempo. Las fluctuaciones motoras como la “fluctuación de desgaste” o el “deterioro al final de la dosis” se manifiestan clínicamente como una duración más corta del efecto de dosis únicas de L-DOPA². En otros casos, las manifestaciones clínicas consisten en movimientos de torsión lentos y posturas anormales (distonía)³ y ocurren cuando los niveles de dopamina son bajos (distonía fuera del período)⁴. Por otro lado, las discinesias inducidas por L-DOPA (LID) aparecen cuando los niveles de dopamina en el plasma y el cerebro son altos⁵.

Los LID producen efectos secundarios debilitantes que incluyen complicaciones motoras como movimientos coreiformes, distónicos y balísticos⁶. Una vez establecido, LIDs ocurren después de cada administración de L-DOPA. Las complicaciones motoras ocurren en el 40%-50% de los pacientes con EP sometidos a terapia con L-DOPA durante 5 años, y la incidencia aumenta a lo largo de los años⁷. Aunque los mecanismos fisiopatológicos implicados en el desarrollo de LID en pacientes con EP aún no están completamente dilucidados, el grado de denervación dopaminérgica, la administración pulsátil de L-DOPA, los cambios posteriores en las proteínas y genes estriatales y las anomalías en los sistemas transmisores no dopaminérgicos son factores que contribuyen al desarrollo de estos efectos secundarios no deseados 6,8,9,10.

La neurotoxina 6-hidroxidopamina (6-OHDA) es una herramienta bien caracterizada para estudiar la EP en roedores^11,12,13,14. Dado que el 6-OHDA no cruza la barrera hematoencefálica, debe inyectarse directamente en la vía nigroestriatal. La depleción dopaminérgica inducida por 6-OHDA depende de la concentración y del sitio¹⁵. La administración unilateral de 6-OHDA en el haz prosencéfalo medial (MFB) puede producir daño nigroestriatal severo (>90%) en roedores^16,17,18,19. La administración crónica de L-DOPA a roedores graves con lesión unilateral de 6-OHDA causa la aparición de movimientos discinéticos llamados movimientos involuntarios anormales (AIM). Los movimientos similares a los discinéticos en roedores comparten mecanismos moleculares, funcionales y farmacológicos similares relacionados con las LID en pacientes con EP⁵. Por lo tanto, las ratas con lesión 6-OHDA²⁰ y los ratones²¹ son modelos preclínicos valiosos para estudiar las LID. Cuando se tratan crónicamente (7-21 días) con dosis terapéuticas de L-DOPA (5-20 mg/kg), las ratas y ratones lesionados unilateralmente con 6-OHDA muestran un desarrollo gradual de AIMs que afectan las extremidades anteriores, el tronco y los músculos orofaciales contralaterales a la lesión 17,18,19,20,22,23,24 . Esos movimientos se presentan en un curso de tiempo similar a las discinesias de dosis pico inducidas por L-DOPA en pacientes con EP²⁵ y se caracterizan por movimientos hipercinéticos y distonía⁵. Los AIM generalmente se puntúan en función de su gravedad (por ejemplo, cuando un AIM específico está presente) y amplitud (por ejemplo, caracterizada por la amplitud de cada movimiento)5,23,25.

Los modelos de LID de roedores lesionados con 6-OHDA presentan validez facial (es decir, el modelo tiene varias características que se parecen a la condición humana)5,11,26,27,28. Los AIM de roedores, similares a lo que ocurre en pacientes con EP, se consideran movimientos hipercinéticos (extremidad anterior y orolinguales) y distónicos (axiales)²⁹ e imitan la discinesia de dosis máximas. A nivel molecular y funcional, los modelos de roedores comparten muchas características patológicas con los pacientes con EP⁵, como la regulación positiva de FosB/ΔFosB 19,26,30,31,32,33 y transportador de serotonina (SERT)^34,35 . En cuanto a la validez predictiva, los fármacos que reducen las LID en pacientes con EP (p. ej., el antagonista del receptor N-metil-D-aspartato (NMDA) amantadina) presentan eficacia antidiscinética en el modelo de roedores 22,36,37,38,39.

La escala de calificación de AIMs para roedores se creó en base a cuatro subtipos de AIMs que incluyen AIMs que afectan la cabeza, el cuello y el tronco (AIMs axiales), movimientos hipercinéticos de las extremidades anteriores (AIMs de extremidades) y movimientos orolinguales tipo discinéticos (AIMs orolinguales). Aunque la rotación contralateral (AIM locomotora) también está presente en roedores lesionados unilateralmente 20,22,23,25,40, no ha sido calificada como un movimiento de tipo discinético ya que puede no representar una medida específica de LIDs 22,37,41.

Aquí, describiremos cómo inducir y analizar movimientos similares a los discinéticos (AIM axiales, de extremidades y orolinguales) en el modelo de EP de rata severa (>90%) con lesión unilateral de 6-OHDA. Organizamos nuestro protocolo basándonos en la literatura previa y nuestra experiencia en laboratorio.

Protocol

Todos los experimentos fueron realizados de acuerdo con el Comité de Ética de la Facultad de Filosofía, Ciencias y Letras de Ribeirão Preto (CEUA/FFCLRP 18.5.35.59.5). 1. Lesión 6-OHDA Utilice ratas macho Sprague-Dawley que pesen 200-250 g al comienzo de los experimentos (6 semanas). Alojar a los animales (2-3 por jaula) en condiciones estándar de laboratorio (12:12 h ciclo de luz/oscuridad, luces encendidas a las 06:00 h, instalaciones con temperatura controla…

Representative Results

Aunque los patrones AIMs observados en ratas son más simples y limitados en comparación con los observados en humanos y primates no humanos, este modelo reproduce movimientos hipercinéticos y distónicos inducidos por la administración crónica de L-DOPA. Aquí presentamos los datos recogidos de un grupo (n = 10) de ratas lesionadas unilateralmente con 6-OHDA tratadas crónicamente con L-DOPA (5 mg/kg combinado con 12,5 mg/kg de benserazida) durante 3 semanas (de lunes a viernes). Tenga en cuenta que los datos presen…

Discussion

Este protocolo demuestra cómo inducir y analizar AIMs en el modelo de rata de PD inducida por microinyección unilateral de 6-OHDA en el MFB. La administración crónica diaria de dosis bajas de L-DOPA (5 mg/kg, combinada con 12,5 mg/kg de benserazida) produjo el desarrollo de AIMs durante las 3 semanas de tratamiento. El análisis temporal reveló un aumento significativo de AIMs, y la discinesia de dosis máxima se observa entre 30 y 90 min después de la administración de L-DOPA. Los AIM son movimientos repetitivos …

Materials

6-hydroxydopamine hydrobromide	Sigma-Aldrich, USA	H6507	Neurotoxin that produces degeneration of catecholaminergic terminals
Benzerazide hydrochloride	Sigma	B7283	Peripheral dopa-decarboxylase inhibitor
Camera Bullet IR Turbo HD (HD-TVI)  2.8mm B	HIKVISION	DS-2CE16C0T-IRP	Camera used to record all behavior
Imipramine hidrochloride	Alfa Aesar	J63723	Norepinephrine transporter inhibitor (NET) used to protect noradrenergic neurons from 6-OHDA
Ketamine hydrochloride	Ceva Animal Health		Anesthesia for surgical intervention
L-3,4-dihydroxyphenylalanine (L-DOPA) methyl ester (hydrochloride)	Cayman Chemical Company	16149	Dopamine precursor
Mirrors			Used to observe the behavior of animals during experiments in all directions
Needles 0.30 x 13 mm	PrecisionGlide		Needles used to inject drugs
Sodium chloride (NaCl)	Samtec		Salt
Syringes 1 ml Sterile	BD Plastipak		Syringes used to inject drugs
Transparent cylinders			Used to record animal behavior during experiments
Xylazine hydrochloride	Ceva Animal Health		Sedative, analgesic and muscle relaxant for surgical intervention