Évaluation de l’intégrité du point de contrôle de l’assemblage de la broche dans les ovocytes de souris
Summary
L’erreur dans la ségrégation chromosomique est une caractéristique commune dans les ovocytes. Par conséquent, l’étude du point de contrôle de l’assemblage de la broche donne des indices importants sur les mécanismes nécessaires pour produire des œufs sains. Le présent protocole décrit trois essais complémentaires pour évaluer l’intégrité du point de contrôle de l’assemblage de la broche dans les ovocytes de souris.
Abstract
L’aneuploïdie est la principale anomalie génétique causant une fausse couche précoce et un échec de grossesse chez l’homme. La plupart des erreurs dans la ségrégation chromosomique qui donnent lieu à l’aneuploïdie se produisent pendant la méiose dans les ovocytes, mais pourquoi la méiose ovocytaire est sujette aux erreurs n’est toujours pas entièrement comprise. Pendant la division cellulaire, les cellules préviennent les erreurs de ségrégation chromosomique en activant le point de contrôle de l’assemblage du fuseau (SAC). Ce mécanisme de contrôle repose sur la détection des attaches kinétochore (KT)-microtubule (MT) et la détection de la tension générée par les fibres de fuseau. Lorsque les KT ne sont pas attachés, le SAC est activé et empêche la progression du cycle cellulaire. Le SAC est activé d’abord par la kinase MPS1, qui déclenche le recrutement et la formation du complexe de points de contrôle mitotiques (MCC), composé de MAD1, MAD2, BUB3 et BUBR1. Ensuite, le MCC diffuse dans le cytoplasme et séquestre CDC20, un activateur du complexe/cyclosome favorisant l’anaphase (APC/C). Une fois que les KT se fixent aux microtubules et que les chromosomes sont alignés sur la plaque de métaphase, le SAC est réduit au silence, CDC20 est libéré et l’APC / C est activé, déclenchant la dégradation de la cycline B et de la sécurine, permettant ainsi l’apparition de l’anaphase. Comparé aux cellules somatiques, le SAC dans les ovocytes n’est pas aussi efficace parce que les cellules peuvent subir une anaphase malgré des KT non attachées. Comprendre pourquoi le SAC est plus permissif et si cette permissivité est l’une des causes des erreurs de ségrégation chromosomique dans les ovocytes nécessite encore des recherches plus approfondies. Le présent protocole décrit les trois techniques permettant d’évaluer de manière exhaustive l’intégrité des OAC dans les ovocytes de souris. Ces techniques comprennent l’utilisation du nocodazole pour dépolymériser les MT afin d’évaluer la réponse au SAC, le suivi du silençage du SAC en suivant la cinétique de destruction de la sécurine et l’évaluation du recrutement de MAD2 en KT par immunofluorescence. Ensemble, ces techniques sondent les mécanismes nécessaires pour produire des œufs sains en fournissant une évaluation complète de l’intégrité du SAC.
Introduction
L’aneuploïdie, qui résulte d’erreurs dans la ségrégation chromosomique, est la principale cause de fausses couches précoces et est fortement liée aux erreurs de la méiose1. La méiose est distincte de la mitose parce qu’elle consiste en deux cycles de division cellulaire sans étape intermédiaire de réplication de l’ADN. Dans la méiose I, les chromosomes homologues se séparent tandis que les chromatides sœurs restent ensemble. Dans les ovocytes, cette étape est sujette aux erreurs, conduisant à la production d’œufs aneuploïdes2.
Pour éviter les erreurs de ségrégation chromosomique, la plupart des types de cellules activent un mécanisme de surveillance qui interrompt le cycle cellulaire, appelé point de contrôle de l’assemblage du fuseau (SAC). Ce mécanisme détecte les attaches kinétochore (KT)-microtubule (MT) et la tension est générée lorsque les chromosomes sont orientés de manière bipolaire3. Les kinétochores non attachées déclenchent une réponse SAC qui commence par le recrutement de MPS1, le régulateur maître du SAC, aux kinétochores 3,4. MPS1 initie le recrutement d’autres composants du SAC, agissant comme une plate-forme pour former le complexe de points de contrôle mitotiques (MCC). Le MCC, composé de MAD1, MAD2, BUB3 et BUBR1, diffuse dans le cytoplasme et inhibe l’activation de l’APC/C en séquestrant son activateur CDC20. Une fois que tous les kinétochores sont fixés de manière stable aux MT et que les chromosomes sont alignés sur la plaque de métaphase, le SAC est réduit au silence et le MCC se désassemble et libère CDC20, permettant ainsi l’activation de l’APC / C. L’APC/C actif dégrade la sécurine et la cycline B, deux étapes clés dans le déclenchement de l’apparition de l’anaphase 5,6. Dans les cellules somatiques, le SAC est rigoureux car il est activé par un seul kinétochore non attaché et est suffisant pour induire l’arrêt du cycle cellulaire6. Cependant, au cours de la méiose ovocytaire, le SAC est plus permissif, et les ovocytes peuvent entrer en anaphase I avec une ou plusieurs kinétochores 6,7,8,9,10 non attachées. Comprendre pourquoi le SAC est plus permissif dans les ovocytes est un domaine d’intérêt continu dans le domaine. Les mécanismes qui causent des défauts dans l’activation du SAC ou le silençage SAC pourraient entraîner des erreurs dans la ségrégation chromosomique ou un arrêt prolongé du cycle cellulaire et la mort cellulaire. Par conséquent, l’évaluation des mécanismes qui maintiennent l’intégrité du SAC dans les ovocytes est importante pour comprendre le processus de formation d’œufs euploïdes sains.
Ce protocole décrit des techniques permettant d’évaluer de manière exhaustive l’intégrité du SAC dans la méiose ovocytaire de souris en examinant différentes étapes critiques du point de contrôle. Tout d’abord, l’évaluation de la réponse du SAC après avoir induit l’activation du SAC est décrite. Cette activation est obtenue en générant des kinétochores non attachées à l’aide de nocodazole, un médicament qui dépolymérise MTs11. Deuxièmement, une méthode de surveillance du silençage des SAC est décrite en suivant la dynamique de la dégradation de la sécurine pendant la maturation des ovocytes. Enfin, un test basé sur l’immunofluorescence est utilisé pour mesurer le recrutement de MAD2, l’un des composants du MCC, dans les kinétochores. Ensemble, ces tests évaluent de manière exhaustive l’intégrité du SAC au cours de la maturation méiotique des ovocytes.
Protocol
Representative Results
Discussion
Le point de contrôle de l’assemblage de la broche est un mécanisme de contrôle critique pendant la division cellulaire conçu pour prévenir les erreurs de ségrégation chromosomique. Cela permet à la cellule d’avoir suffisamment de temps pour corriger les attachements KT-MT inappropriés. La méiose dans les ovocytes est un processus sujet aux erreurs, où la plupart des erreurs de ségrégation chromosomiques se produisent pendant la méiose I, conduisant à la génération d’ovules aneuploïdes qui sont la …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Le financement de ce projet a été fourni par les National Institutes of Health (R35GM136340 à KS).
Materials
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A4503 | |
| DAPI | Life Technologies | D1306 | |
| Dimethyl-sulfoxide (DMSO) | Sigma | D5879 | |
| Donkey-anti-rabbit-Alexa-568 | Life Technologies | A10042 | |
| EVOS FL Auto Imaging System | Life Technologies | Fluorescence microscope | |
| EVOS Onstage Incubator | Life Technologies | Incubator chamber | |
| Glass Bottom 96- well plates N 1.5 uncoated | MatTek Corporation | P96G-1.5-5-F | |
| goat-anti-human-Alexa-633 | Life Technologies | A21091 | |
| HEPES | Sigma | H3537 | |
| Human anti-ACA | Antibodies Incorporated | 15-234 | Dilution 1/30 |
| ImageJ | NIH | ||
| KCl | Sigma | P5405 | |
| KH2PO4 | Sigma | P5655 | |
| Leica SP8 equipped with a 63×, 1.40 NA oil immersion objective | Leica | ||
| MgSO4·7H20 | Sigma | M7774 | |
| Milrinone | Sigma | M4659 | |
| Na2HPO4 | Sigma | S2429 | |
| NaCl | Sigma | S5886 | |
| NaN3 | Sigma | S2002 | |
| Nocodazole | Sigma | M1404 | |
| Paraformaldhyde (PFA) | Sigma | P6148 | |
| PIPES | Sigma | P6757 | |
| Rabbit anti- MAD2 | Biolegend | 924601 | Dilution 1/1000; previously Covance #PRB-452C |
| Reversine | Cayman Chemical | 10004412 | |
| Triton-X | Sigma | 274348 | |
| Tween-20 | Sigma | X100 | |
| Vectashield | Vector laboratories | H-1000 |
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