Evaluación de la integridad del punto de control del ensamblaje del husillo en ovocitos de ratón
Summary
El error en la segregación cromosómica es una característica común en los ovocitos. Por lo tanto, estudiar el punto de control de ensamblaje del husillo da pistas importantes sobre los mecanismos necesarios para producir óvulos sanos. El presente protocolo describe tres ensayos complementarios para evaluar la integridad del punto de control del ensamblaje del huso en ovocitos de ratón.
Abstract
La aneuploidía es la principal anomalía genética que causa aborto espontáneo temprano y fracaso del embarazo en humanos. La mayoría de los errores en la segregación cromosómica que dan lugar a la aneuploidía ocurren durante la meiosis en los ovocitos, pero aún no se comprende completamente por qué la meiosis de los ovocitos es propensa a errores. Durante la división celular, las células evitan errores en la segregación cromosómica activando el punto de control de ensamblaje del huso (SAC). Este mecanismo de control se basa en la detección de accesorios cinetocoro (KT)-microtúbulos (MT) y en la detección de la tensión generada por las fibras del huso. Cuando los KT no están conectados, el SAC se activa y evita la progresión del ciclo celular. El SAC es activado primero por la quinasa MPS1, que desencadena el reclutamiento y la formación del complejo de punto de control mitótico (MCC), compuesto por MAD1, MAD2, BUB3 y BUBR1. Luego, el CCM se difunde en el citoplasma y secuestra CDC20, un activador del complejo/ciclosoma promotor de anafase (APC/C). Una vez que los KT se unen a los microtúbulos y los cromosomas se alinean en la placa de metafase, el SAC se silencia, se libera CDC20 y se activa el APC / C, lo que desencadena la degradación de la ciclina B y la securina, lo que permite el inicio de la anafase. En comparación con las células somáticas, el SAC en los ovocitos no es tan efectivo porque las células pueden sufrir anafase a pesar de tener KT no unidos. Comprender por qué el SAC es más permisivo y si esta permisividad es una de las causas de los errores de segregación cromosómica en los ovocitos aún necesita más investigación. El presente protocolo describe las tres técnicas para evaluar exhaustivamente la integridad de SAC en ovocitos de ratón. Estas técnicas incluyen el uso de nocodazol para despolimerizar MT para evaluar la respuesta SAC, rastrear el silenciamiento de SAC siguiendo la cinética de destrucción de Securin y evaluar el reclutamiento de MAD2 a KTs por inmunofluorescencia. Juntas, estas técnicas investigan los mecanismos necesarios para producir óvulos sanos al proporcionar una evaluación completa de la integridad de SAC.
Introduction
La aneuploidía, que surge de errores en la segregación cromosómica, es la principal causa de abortos espontáneos tempranos y está altamente relacionada con errores en la meiosis1. La meiosis es distinta de la mitosis porque consiste en dos rondas de división celular sin un paso intermedio de replicación del ADN. En la meiosis I, los cromosomas homólogos se separan mientras que las cromátidas hermanas permanecen juntas. En los ovocitos, este paso es propenso a errores, lo que lleva a la producción de huevos aneuploides2.
Para evitar errores de segregación cromosómica, la mayoría de los tipos de células activan un mecanismo de vigilancia que pausa el ciclo celular, llamado punto de control de ensamblaje del huso (SAC). Este mecanismo detecta las uniones cinetocoro (KT)-microtúbulos (MT) y la tensión se genera cuando los cromosomas están orientados de manera bipolar3. Los cinetocoros no unidos desencadenan una respuesta SAC que comienza con el reclutamiento de MPS1, el regulador maestro del SAC, para los cinetocoros 3,4. MPS1 inicia el reclutamiento de otros componentes del SAC, actuando como plataforma para formar el complejo de puntos de control mitóticos (MCC). El MCC, compuesto por MAD1, MAD2, BUB3 y BUBR1, se difunde en el citoplasma e inhibe la activación de APC/C secuestrando su activador CDC20. Una vez que todos los cinetocoros están unidos de manera estable a los MT y los cromosomas se alinean en la placa metafásica, el SAC se silencia y el MCC se desmonta y libera CDC20, lo que permite la activación de APC / C. La APC/C activa degrada la securina y la ciclina B, dos pasos clave para desencadenar el inicio de la anafase 5,6. En las células somáticas, el SAC es estricto porque es activado por un solo cinetocoro no unido y es suficiente para inducir la detención del ciclo celular6. Sin embargo, durante la meiosis ovocitaria, la SAC es más permisiva, y los ovocitos pueden entrar en anafase I con uno o más cinetocoros no unidos 6,7,8,9,10. Comprender por qué el SAC es más permisivo en ovocitos es un área de enfoque continuo en el campo. Los mecanismos que causan defectos en la activación de SAC o el silenciamiento de SAC podrían conducir a errores en la segregación cromosómica o detención prolongada del ciclo celular y muerte celular. Por lo tanto, evaluar los mecanismos que mantienen la integridad SAC en los ovocitos es importante para comprender el proceso de formación de óvulos euploides sanos.
Este protocolo describe técnicas para evaluar exhaustivamente la integridad de SAC en la meiosis de ovocitos de ratón mediante el examen de diferentes pasos críticos del punto de control. En primer lugar, se describe la evaluación de la respuesta SAC después de inducir la activación de SAC. Esta activación se logra mediante la generación de cinetocoros no unidos utilizando nocodazol, un fármaco que despolimeriza las MTs11. En segundo lugar, se describe un método para monitorear el silenciamiento de SAC mediante el seguimiento de la dinámica de la degradación de Securin durante la maduración de los ovocitos. Finalmente, se emplea un ensayo basado en inmunofluorescencia para medir el reclutamiento de MAD2, uno de los componentes del CCM, para los cinetocoros. Juntos, estos ensayos evalúan exhaustivamente la integridad de SAC durante la maduración meiótica de los ovocitos.
Protocol
Representative Results
Discussion
El punto de control de ensamblaje del husillo es un mecanismo de control crítico durante la división celular diseñado para evitar errores de segregación cromosómica. Permite que la célula tenga tiempo suficiente para corregir los accesorios KT-MT incorrectos. La meiosis en ovocitos es un proceso propenso a errores, donde la mayor parte de la mala segregación cromosómica ocurre durante la meiosis I, lo que lleva a la generación de óvulos aneuploides que son la principal causa de abortos espontáneos tempranos e …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
La financiación para este proyecto fue proporcionada por los Institutos Nacionales de Salud (R35GM136340 a KS).
Materials
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A4503 | |
| DAPI | Life Technologies | D1306 | |
| Dimethyl-sulfoxide (DMSO) | Sigma | D5879 | |
| Donkey-anti-rabbit-Alexa-568 | Life Technologies | A10042 | |
| EVOS FL Auto Imaging System | Life Technologies | Fluorescence microscope | |
| EVOS Onstage Incubator | Life Technologies | Incubator chamber | |
| Glass Bottom 96- well plates N 1.5 uncoated | MatTek Corporation | P96G-1.5-5-F | |
| goat-anti-human-Alexa-633 | Life Technologies | A21091 | |
| HEPES | Sigma | H3537 | |
| Human anti-ACA | Antibodies Incorporated | 15-234 | Dilution 1/30 |
| ImageJ | NIH | ||
| KCl | Sigma | P5405 | |
| KH2PO4 | Sigma | P5655 | |
| Leica SP8 equipped with a 63×, 1.40 NA oil immersion objective | Leica | ||
| MgSO4·7H20 | Sigma | M7774 | |
| Milrinone | Sigma | M4659 | |
| Na2HPO4 | Sigma | S2429 | |
| NaCl | Sigma | S5886 | |
| NaN3 | Sigma | S2002 | |
| Nocodazole | Sigma | M1404 | |
| Paraformaldhyde (PFA) | Sigma | P6148 | |
| PIPES | Sigma | P6757 | |
| Rabbit anti- MAD2 | Biolegend | 924601 | Dilution 1/1000; previously Covance #PRB-452C |
| Reversine | Cayman Chemical | 10004412 | |
| Triton-X | Sigma | 274348 | |
| Tween-20 | Sigma | X100 | |
| Vectashield | Vector laboratories | H-1000 |
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