Оценка целостности контрольной точки сборки шпинделя в ооцитах мыши
Summary
Ошибка в сегрегации хромосом является общей чертой в ооцитах. Поэтому изучение контрольной точки сборки веретена дает важные подсказки о механизмах, необходимых для производства здоровых яиц. Настоящий протокол описывает три дополнительных анализа для оценки целостности контрольных точек сборки веретена в ооцитах мыши.
Abstract
Анеуплоидия является ведущей генетической аномалией, вызывающей ранний выкидыш и неудачу беременности у людей. Большинство ошибок в сегрегации хромосом, которые приводят к анеуплоидии, происходят во время мейоза в ооцитах, но почему мейоз ооцитов подвержен ошибкам, до сих пор не до конца понятно. Во время деления клеток клетки предотвращают ошибки в сегрегации хромосом, активируя контрольную точку сборки веретена (SAC). Этот механизм управления основан на обнаружении кинетохорных (КТ)-микротрубочек (МТ) креплений и зондировании напряжения, создаваемого волокнами шпинделя. Когда КТ не прикреплены, SAC активируется и предотвращает прогрессирование клеточного цикла. SAC активируется сначала киназой MPS1, которая запускает набор и формирование комплекса митотических контрольных точек (MCC), состоящего из MAD1, MAD2, BUB3 и BUBR1. Затем MCC диффундирует в цитоплазму и изолирует CDC20, активатор анафаз-стимулирующего комплекса/ циклосомы (APC / C). Как только KTs прикрепляются к микротрубочкам и хромосомы выравниваются на метафазной пластине, SAC заглушается, CDC20 высвобождается, а APC / C активируется, вызывая деградацию циклина B и Securin, тем самым позволяя анафазному началу. По сравнению с соматическими клетками, SAC в ооцитах не так эффективен, потому что клетки могут подвергаться анафазе, несмотря на наличие неприкрепленных КТ. Понимание того, почему SAC является более разрешительным и является ли эта разрешительность одной из причин ошибок сегрегации хромосом в ооцитах, все еще нуждается в дальнейшем изучении. Настоящий протокол описывает три метода всесторонней оценки целостности SAC в ооцитах мыши. Эти методы включают использование нокодазола для деполимеризации МТ для оценки реакции SAC, отслеживание глушения SAC путем отслеживания кинетики разрушения Securin и оценку набора MAD2 в KTs путем иммунофлуоресценции. Вместе эти методы исследуют механизмы, необходимые для производства здоровых яйцеклеток, обеспечивая полную оценку целостности SAC.
Introduction
Анеуплоидия, которая возникает из-за ошибок в сегрегации хромосом, является основной причиной ранних выкидышей и тесно связана с ошибками в мейозе1. Мейоз отличается от митоза тем, что он состоит из двух раундов деления клеток без промежуточного этапа репликации ДНК. При мейозе I гомологичные хромосомы разделяются, в то время как сестринские хроматиды остаются вместе. В ооцитах этот этап подвержен ошибкам, что приводит к производству анеуплоидных яиц2.
Чтобы предотвратить ошибки сегрегации хромосом, большинство типов клеток активируют механизм наблюдения, который приостанавливает клеточный цикл, называемый контрольной точкой сборки веретена (SAC). Этот механизм определяет прикрепления кинетохора (КТ)-микротрубочек (МТ), и напряжение генерируется, когда хромосомы ориентированы биполярным образом3. Неприкрепленные кинетохоры вызывают реакцию SAC, которая начинается с набора MPS1, главного регулятора SAC, в кинетохоры 3,4. MPS1 инициирует набор других компонентов SAC, выступая в качестве платформы для формирования комплекса митотических контрольных точек (MCC). MCC, состоящий из MAD1, MAD2, BUB3 и BUBR1, диффундирует в цитоплазму и ингибирует активацию APC / C путем секвестрации ее активатора CDC20. Как только все кинетохоры стабильно прикреплены к МТ и хромосомы выровнены на метафазной пластине, SAC заглушается, а MCC разбирается и высвобождает CDC20, тем самым позволяя активировать APC / C. Активный APC/C разлагает Securin и Cyclin B, два ключевых шага в запуске анафазного начала 5,6. В соматических клетках SAC является строгим, поскольку он активируется одним неприкрепленным кинетохором и достаточен для индуцирования остановки клеточного цикла6. Однако во время мейоза ооцитов SAC более разрешителен, и ооциты могут входить в анафазу I с одним или несколькими неприкрепленными кинетохорами 6,7,8,9,10. Понимание того, почему SAC является более разрешительным в ооцитах, является постоянной областью внимания в этой области. Механизмы, которые вызывают дефекты активации SAC или глушения SAC, могут привести к ошибкам в сегрегации хромосом или длительной остановке клеточного цикла и гибели клеток. Поэтому оценка механизмов, которые поддерживают целостность SAC в ооцитах, важна для понимания процесса формирования здоровых, эуплоидных яйцеклеток.
Этот протокол описывает методы всесторонней оценки целостности SAC при мейозе ооцитов мыши путем изучения различных критических этапов контрольной точки. Во-первых, описана оценка ответа SAC после индуцирования активации SAC. Эта активация достигается путем генерации неприкрепленных кинетохоров с использованием нокодазола, препарата, который деполимеризует MTs11. Во-вторых, метод мониторинга глушения SAC описан отслеживанием динамики деградации Securin во время созревания ооцитов. Наконец, иммунофлуоресцентный анализ используется для измерения набора MAD2, одного из компонентов MCC, к кинетохорам. Вместе эти анализы всесторонне оценивают целостность SAC во время мейотического созревания ооцитов.
Protocol
Representative Results
Discussion
Контрольная точка сборки веретена является критическим механизмом управления во время деления клеток, предназначенным для предотвращения ошибок сегрегации хромосом. Это позволяет ячейке иметь достаточно времени для исправления неправильных насадок KT-MT. Мейоз в ооцитах является под?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Финансирование этого проекта было предоставлено Национальными институтами здравоохранения (R35GM136340 to KS).
Materials
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A4503 | |
| DAPI | Life Technologies | D1306 | |
| Dimethyl-sulfoxide (DMSO) | Sigma | D5879 | |
| Donkey-anti-rabbit-Alexa-568 | Life Technologies | A10042 | |
| EVOS FL Auto Imaging System | Life Technologies | Fluorescence microscope | |
| EVOS Onstage Incubator | Life Technologies | Incubator chamber | |
| Glass Bottom 96- well plates N 1.5 uncoated | MatTek Corporation | P96G-1.5-5-F | |
| goat-anti-human-Alexa-633 | Life Technologies | A21091 | |
| HEPES | Sigma | H3537 | |
| Human anti-ACA | Antibodies Incorporated | 15-234 | Dilution 1/30 |
| ImageJ | NIH | ||
| KCl | Sigma | P5405 | |
| KH2PO4 | Sigma | P5655 | |
| Leica SP8 equipped with a 63×, 1.40 NA oil immersion objective | Leica | ||
| MgSO4·7H20 | Sigma | M7774 | |
| Milrinone | Sigma | M4659 | |
| Na2HPO4 | Sigma | S2429 | |
| NaCl | Sigma | S5886 | |
| NaN3 | Sigma | S2002 | |
| Nocodazole | Sigma | M1404 | |
| Paraformaldhyde (PFA) | Sigma | P6148 | |
| PIPES | Sigma | P6757 | |
| Rabbit anti- MAD2 | Biolegend | 924601 | Dilution 1/1000; previously Covance #PRB-452C |
| Reversine | Cayman Chemical | 10004412 | |
| Triton-X | Sigma | 274348 | |
| Tween-20 | Sigma | X100 | |
| Vectashield | Vector laboratories | H-1000 |
References
- Gruhn, J. R., et al. Chromosome errors in human eggs shape natural fertility over reproductive life span. Science. 365 (6460), 1466-1469 (2019).
- Nagaoka, S. I., Hassold, T. J., Hunt, P. A. Human aneuploidy: mechanisms and new insights into an age-old problem. Nature Reviews. Genetics. 13 (7), 493-504 (2012).
- Musacchio, A. The molecular biology of spindle assembly checkpoint signaling dynamics. Current Biology. 25 (20), 1002-1018 (2015).
- Lara-Gonzalez, P., Westhorpe, F. G., Taylor, S. S. The spindle assembly checkpoint. Current Biology. 22 (22), 966-980 (2012).
- London, N., Biggins, S. Signalling dynamics in the spindle checkpoint response. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (11), 736-748 (2014).
- Kuhn, J., Dumont, S. Mammalian kinetochores count attached microtubules in a sensitive and switch-like manner. Journal of Cell Biology. 218 (11), 3583-3596 (2019).
- Jones, K. T., Lane, S. I. R. Molecular causes of aneuploidy in mammalian eggs. Development. 140 (18), 3719-3730 (2013).
- Gui, L., Homer, H. Spindle assembly checkpoint signalling is uncoupled from chromosomal position in mouse oocytes. Development. 139 (11), 1941-1946 (2012).
- Nagaoka, S. I., Hodges, C. A., Albertini, D. F., Hunt, P. A. Oocyte-specific differences in cell-cycle control create an innate susceptibility to meiotic errors. Current Biology. 21 (8), 651-657 (2011).
- Sebestova, J., Danylevska, A., Novakova, L., Kubelka, M., Anger, M. Lack of response to unaligned chromosomes in mammalian female gametes. Cell Cycle. 11 (16), 3011-3018 (2012).
- Vasquez, R. J., Howell, B., Yvon, A. M., Wadsworth, P., Cassimeris, L. Nanomolar concentrations of nocodazole alter microtubule dynamic instability in vivo and in vitro. Molecular Biology of the Cell. 8 (6), 973-985 (1997).
- Stein, P., Schindler, K. Mouse oocyte microinjection, maturation and ploidy assessment. Journal of Visualized Experiments. (53), e2851 (2011).
- Thomas, R. E., Thompson, J. G., Armstrong, D. T., Gilchrist, R. B. Effect of specific phosphodiesterase isoenzyme inhibitors during in vitro maturation of bovine oocytes on meiotic and developmental capacity. Biology of Reproduction. 71 (4), 1142-1149 (2004).
- Marin, D., Nguyen, A. L., Scott, R. T., Schindler, K. Using mouse oocytes to assess human gene function during meiosis I. Journal of Visualized Experiments. (134), e57442 (2018).
- Herbert, M., et al. Homologue disjunction in mouse oocytes requires proteolysis of securin and cyclin B1. Nature Cell Biology. 5 (11), 1023-1025 (2003).
- Solc, P., et al. Multiple requirements of PLK1 during Mouse oocyte maturation. PLoS One. 10 (2), 0116783 (2015).
- Blengini, C. S., Nguyen, A. L., Aboelenain, M., Schindler, K. Age-dependent integrity of the meiotic spindle assembly checkpoint in females requires Aurora kinase B. Aging Cell. 20 (11), 13489 (2021).
- Balboula, A. Z., et al. Haspin kinase regulates microtubule-organizing center clustering and stability through Aurora kinase C in mouse oocytes. Journal of Cell Science. 129 (19), 3648-3660 (2016).
- Nabti, I., Grimes, R., Sarna, H., Marangos, P., Carroll, J. Maternal age-dependent APC/C-mediated decrease in securin causes premature sister chromatid separation in meiosis II. Nature Communications. 8 (1), 15346 (2017).
- Blengini, C. S., Schindler, K. Immunofluorescence technique to detect subcellular structures critical to oocyte maturation. Methods in Molecular Biology. 1818, 67-76 (2018).
- Santaguida, S., Tighe, A., D’Alise, A. M., Taylor, S. S., Musacchio, A. Dissecting the role of MPS1 in chromosome biorientation and the spindle checkpoint through the small molecule inhibitor reversine. Journal of Cell Biology. 190 (1), 73-87 (2010).
- Musacchio, A. The molecular biology of spindle assembly checkpoint signaling dynamics. Current Biology. 25 (20), 1002-1018 (2015).
- Wassmann, K., Niault, T., Maro, B. Metaphase I arrest upon activation of the Mad2-dependent spindle checkpoint in mouse oocytes. Current Biology. 13 (18), 1596-1608 (2003).
- Hassold, T., Hall, H., Hunt, P. The origin of human aneuploidy: where we have been, where we are going. Human Molecular Genetics. 16, 203-208 (2007).
- Gui, L., Homer, H. Spindle assembly checkpoint signalling is uncoupled from chromosomal position in mouse oocytes. Development. 139 (11), 1941-1946 (2012).
- Homer, H. A., et al. Mad2 prevents aneuploidy and premature proteolysis of cyclin B and securin during meiosis I in mouse oocytes. Genes and Development. 19 (2), 202-207 (2005).
- Blengini, C. S., et al. Aurora kinase A is essential for meiosis in mouse oocytes. PLOS Genetics. 17 (4), 1009327 (2021).
- Hagting, A., et al. Human securin proteolysis is controlled by the spindle checkpoint and reveals when the APC/C switches from activation by Cdc20 to Cdh1. Journal of Cell Biology. 157 (7), 1125-1137 (2002).
- Rodriguez-Rodriguez, J. A., et al. Distinct roles of RZZ and Bub1-KNL1 in mitotic checkpoint signaling and kinetochore expansion. Current Biology. 28 (21), 3422-3429 (2018).
- Chambon, J. P., Hached, K., Wassmann, K. Chromosome spreads with centromere staining in mouse oocytes. Methods in Molecular Biology. 957, 203-212 (2013).
