マウス卵母細胞における紡錘体アセンブリチェックポイント完全性の評価
Summary
染色体分配の誤りは、卵母細胞に共通する特徴です。したがって、紡錘体アセンブリのチェックポイントを研究することは、健康な卵を生産するために必要なメカニズムについての重要な手がかりを与えます。本プロトコルは、マウス卵母細胞における紡錘体アセンブリチェックポイント完全性を評価するための3つの相補的アッセイを記載する。
Abstract
異数性は、ヒトの早期流産および妊娠不全を引き起こす主要な遺伝的異常である。異数性を引き起こす染色体分配のほとんどのエラーは、卵母細胞の減数分裂中に発生しますが、卵母細胞の減数分裂がエラーを起こしやすい理由はまだ完全には理解されていません。細胞分裂中、細胞は紡錘体アセンブリチェックポイント(SAC)を活性化することにより、染色体分配のエラーを防ぎます。この制御メカニズムは、動原体(KT)-微小管(MT)付着の検出と、紡錘体繊維によって発生する張力の検出に依存しています。KTが結合解除されると、SACが活性化され、細胞周期の進行が妨げられます。SACは最初にMPS1キナーゼによって活性化され、MAD1、MAD2、BUB3、およびBUBR1で構成される有糸分裂チェックポイント複合体(MCC)の動員と形成を引き起こします。次に、MCCは細胞質に拡散し、後期促進複合体/サイクロソーム(APC / C)アクチベーターであるCDC20を隔離します。KTが微小管に付着し、染色体が中期プレートに整列すると、SACがサイレンシングされ、CDC20が放出され、APC/Cが活性化され、サイクリンBとセクリンの分解が引き起こされ、後期発症が起こります。体細胞と比較して、卵母細胞のSACは、KTが付着していないにもかかわらず細胞が後期を迎えることができるため、それほど効果的ではありません。 SACがより寛容である理由と、この寛容性が卵母細胞の染色体分配エラーの原因の1つであるかどうかを理解することは、さらに調査する必要があります。本プロトコルは、マウス卵母細胞におけるSAC完全性を包括的に評価するための3つの技術を記載する。これらの技術には、ノコダゾールを使用してMTを解重合してSAC応答を評価すること、セクリン破壊の速度論を追跡することによってSACサイレンシングを追跡すること、免疫蛍光によるKTへのMAD2の動員を評価することが含まれます。これらの技術を組み合わせることで、SACの完全性を完全に評価することにより、健康な卵子を生産するために必要なメカニズムを調査します。
Introduction
染色体分配の誤りから生じる異数性は、早期流産の主な原因であり、減数分裂の間違いと強く関連しています1。減数分裂は、DNA複製ステップを介さずに2ラウンドの細胞分裂で構成されるため、有糸分裂とは異なります。減数分裂Iでは、相同染色体は分離し、姉妹染色分体は一緒に残ります。卵母細胞では、このステップはエラーが発生しやすく、異数性卵の生成につながります2。
染色体分配エラーを防ぐために、ほとんどの細胞タイプは、スピンドルアセンブリチェックポイント(SAC)と呼ばれる細胞周期を一時停止する監視メカニズムを活性化します。このメカニズムは、動原体(KT)-微小管(MT)の付着を感知し、染色体が双極性に配向すると張力が発生します3。接続されていない動原体は、SACのマスターレギュレーターであるMPS1の動原体3,4への採用から始まるSAC応答をトリガーします。MPS1は、他のSACコンポーネントのリクルートを開始し、有糸分裂チェックポイント複合体(MCC)を形成するためのプラットフォームとして機能します。MCCは、MAD1、MAD2、BUB3、およびBUBR1で構成され、細胞質に拡散し、アクチベーターCDC20を隔離することによりAPC/C活性化を阻害します。すべての動原体がMTに安定して結合し、染色体が中期プレートに整列すると、SACがサイレンシングされ、MCCがCDC20を分解して放出し、APC/C活性化が可能になります。活性APC / Cは、後期発症を引き起こす2つの重要なステップであるセクリンとサイクリンBを分解します5,6。体細胞では、SACは単一の未付着の動原体によって活性化され、細胞周期停止を誘導するのに十分であるため、厳格です6。しかしながら、卵母細胞減数分裂の間、SACはより寛容であり、卵母細胞は1つ以上の未付着の動原体6、7、8、9、10で後期Iに入ることができる。SACが卵母細胞においてより寛容である理由を理解することは、この分野で進行中の焦点分野です。SAC活性化またはSACサイレンシングに欠陥を引き起こすメカニズムは、染色体分配のエラーまたは長期の細胞周期停止および細胞死につながる可能性があります。したがって、卵母細胞のSAC完全性を維持するメカニズムを評価することは、健康な倍数体の卵を形成するプロセスを理解するために重要です。
このプロトコルは、チェックポイントのさまざまな重要なステップを調べることにより、マウス卵母細胞減数分裂におけるSAC完全性を包括的に評価する技術について説明しています。まず、SAC活性化誘導後のSAC応答の評価について説明する。この活性化は、MTs11を解重合する薬物であるノコダゾールを使用して、付着していない動原体を生成することによって達成されます。第二に、SACサイレンシングをモニタリングする方法は、卵母細胞成熟中のSecurin分解のダイナミクスを追跡することによって説明されています。最後に、免疫蛍光ベースのアッセイを使用して、MCC成分の1つであるMAD2の動原体への動員を測定します。一緒に、これらのアッセイは、卵母細胞の減数分裂成熟中のSACの完全性を包括的に評価します。
Protocol
Representative Results
Discussion
紡錘体アセンブリチェックポイントは、染色体分配エラーを防ぐために設計された細胞分裂中の重要な制御メカニズムです。これにより、セルは不適切なKT-MTアタッチメントを修正するのに十分な時間を確保できます。卵母細胞の減数分裂はエラーが発生しやすいプロセスであり、染色体の誤分離のほとんどは減数分裂I中に発生し、ヒトの早期流産と不妊の主な原因である異数性卵の生成に?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
このプロジェクトの資金は、国立衛生研究所(R35GM136340からKS)によって提供されました。
Materials
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A4503 | |
| DAPI | Life Technologies | D1306 | |
| Dimethyl-sulfoxide (DMSO) | Sigma | D5879 | |
| Donkey-anti-rabbit-Alexa-568 | Life Technologies | A10042 | |
| EVOS FL Auto Imaging System | Life Technologies | Fluorescence microscope | |
| EVOS Onstage Incubator | Life Technologies | Incubator chamber | |
| Glass Bottom 96- well plates N 1.5 uncoated | MatTek Corporation | P96G-1.5-5-F | |
| goat-anti-human-Alexa-633 | Life Technologies | A21091 | |
| HEPES | Sigma | H3537 | |
| Human anti-ACA | Antibodies Incorporated | 15-234 | Dilution 1/30 |
| ImageJ | NIH | ||
| KCl | Sigma | P5405 | |
| KH2PO4 | Sigma | P5655 | |
| Leica SP8 equipped with a 63×, 1.40 NA oil immersion objective | Leica | ||
| MgSO4·7H20 | Sigma | M7774 | |
| Milrinone | Sigma | M4659 | |
| Na2HPO4 | Sigma | S2429 | |
| NaCl | Sigma | S5886 | |
| NaN3 | Sigma | S2002 | |
| Nocodazole | Sigma | M1404 | |
| Paraformaldhyde (PFA) | Sigma | P6148 | |
| PIPES | Sigma | P6757 | |
| Rabbit anti- MAD2 | Biolegend | 924601 | Dilution 1/1000; previously Covance #PRB-452C |
| Reversine | Cayman Chemical | 10004412 | |
| Triton-X | Sigma | 274348 | |
| Tween-20 | Sigma | X100 | |
| Vectashield | Vector laboratories | H-1000 |
References
- Gruhn, J. R., et al. Chromosome errors in human eggs shape natural fertility over reproductive life span. Science. 365 (6460), 1466-1469 (2019).
- Nagaoka, S. I., Hassold, T. J., Hunt, P. A. Human aneuploidy: mechanisms and new insights into an age-old problem. Nature Reviews. Genetics. 13 (7), 493-504 (2012).
- Musacchio, A. The molecular biology of spindle assembly checkpoint signaling dynamics. Current Biology. 25 (20), 1002-1018 (2015).
- Lara-Gonzalez, P., Westhorpe, F. G., Taylor, S. S. The spindle assembly checkpoint. Current Biology. 22 (22), 966-980 (2012).
- London, N., Biggins, S. Signalling dynamics in the spindle checkpoint response. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (11), 736-748 (2014).
- Kuhn, J., Dumont, S. Mammalian kinetochores count attached microtubules in a sensitive and switch-like manner. Journal of Cell Biology. 218 (11), 3583-3596 (2019).
- Jones, K. T., Lane, S. I. R. Molecular causes of aneuploidy in mammalian eggs. Development. 140 (18), 3719-3730 (2013).
- Gui, L., Homer, H. Spindle assembly checkpoint signalling is uncoupled from chromosomal position in mouse oocytes. Development. 139 (11), 1941-1946 (2012).
- Nagaoka, S. I., Hodges, C. A., Albertini, D. F., Hunt, P. A. Oocyte-specific differences in cell-cycle control create an innate susceptibility to meiotic errors. Current Biology. 21 (8), 651-657 (2011).
- Sebestova, J., Danylevska, A., Novakova, L., Kubelka, M., Anger, M. Lack of response to unaligned chromosomes in mammalian female gametes. Cell Cycle. 11 (16), 3011-3018 (2012).
- Vasquez, R. J., Howell, B., Yvon, A. M., Wadsworth, P., Cassimeris, L. Nanomolar concentrations of nocodazole alter microtubule dynamic instability in vivo and in vitro. Molecular Biology of the Cell. 8 (6), 973-985 (1997).
- Stein, P., Schindler, K. Mouse oocyte microinjection, maturation and ploidy assessment. Journal of Visualized Experiments. (53), e2851 (2011).
- Thomas, R. E., Thompson, J. G., Armstrong, D. T., Gilchrist, R. B. Effect of specific phosphodiesterase isoenzyme inhibitors during in vitro maturation of bovine oocytes on meiotic and developmental capacity. Biology of Reproduction. 71 (4), 1142-1149 (2004).
- Marin, D., Nguyen, A. L., Scott, R. T., Schindler, K. Using mouse oocytes to assess human gene function during meiosis I. Journal of Visualized Experiments. (134), e57442 (2018).
- Herbert, M., et al. Homologue disjunction in mouse oocytes requires proteolysis of securin and cyclin B1. Nature Cell Biology. 5 (11), 1023-1025 (2003).
- Solc, P., et al. Multiple requirements of PLK1 during Mouse oocyte maturation. PLoS One. 10 (2), 0116783 (2015).
- Blengini, C. S., Nguyen, A. L., Aboelenain, M., Schindler, K. Age-dependent integrity of the meiotic spindle assembly checkpoint in females requires Aurora kinase B. Aging Cell. 20 (11), 13489 (2021).
- Balboula, A. Z., et al. Haspin kinase regulates microtubule-organizing center clustering and stability through Aurora kinase C in mouse oocytes. Journal of Cell Science. 129 (19), 3648-3660 (2016).
- Nabti, I., Grimes, R., Sarna, H., Marangos, P., Carroll, J. Maternal age-dependent APC/C-mediated decrease in securin causes premature sister chromatid separation in meiosis II. Nature Communications. 8 (1), 15346 (2017).
- Blengini, C. S., Schindler, K. Immunofluorescence technique to detect subcellular structures critical to oocyte maturation. Methods in Molecular Biology. 1818, 67-76 (2018).
- Santaguida, S., Tighe, A., D’Alise, A. M., Taylor, S. S., Musacchio, A. Dissecting the role of MPS1 in chromosome biorientation and the spindle checkpoint through the small molecule inhibitor reversine. Journal of Cell Biology. 190 (1), 73-87 (2010).
- Musacchio, A. The molecular biology of spindle assembly checkpoint signaling dynamics. Current Biology. 25 (20), 1002-1018 (2015).
- Wassmann, K., Niault, T., Maro, B. Metaphase I arrest upon activation of the Mad2-dependent spindle checkpoint in mouse oocytes. Current Biology. 13 (18), 1596-1608 (2003).
- Hassold, T., Hall, H., Hunt, P. The origin of human aneuploidy: where we have been, where we are going. Human Molecular Genetics. 16, 203-208 (2007).
- Gui, L., Homer, H. Spindle assembly checkpoint signalling is uncoupled from chromosomal position in mouse oocytes. Development. 139 (11), 1941-1946 (2012).
- Homer, H. A., et al. Mad2 prevents aneuploidy and premature proteolysis of cyclin B and securin during meiosis I in mouse oocytes. Genes and Development. 19 (2), 202-207 (2005).
- Blengini, C. S., et al. Aurora kinase A is essential for meiosis in mouse oocytes. PLOS Genetics. 17 (4), 1009327 (2021).
- Hagting, A., et al. Human securin proteolysis is controlled by the spindle checkpoint and reveals when the APC/C switches from activation by Cdc20 to Cdh1. Journal of Cell Biology. 157 (7), 1125-1137 (2002).
- Rodriguez-Rodriguez, J. A., et al. Distinct roles of RZZ and Bub1-KNL1 in mitotic checkpoint signaling and kinetochore expansion. Current Biology. 28 (21), 3422-3429 (2018).
- Chambon, J. P., Hached, K., Wassmann, K. Chromosome spreads with centromere staining in mouse oocytes. Methods in Molecular Biology. 957, 203-212 (2013).
