Evaluation der Integrität des Spindel-Assemblierungs-Checkpoints in Maus-Eizellen
Summary
Fehler in der Chromosomentrennung sind ein häufiges Merkmal bei Eizellen. Daher gibt die Untersuchung des Spindelanordnungs-Checkpoints wichtige Hinweise auf die Mechanismen, die zur Produktion gesunder Eier erforderlich sind. Das vorliegende Protokoll beschreibt drei komplementäre Assays zur Beurteilung der Integrität des Spindelaufbau-Checkpoints in Maus-Oozyten.
Abstract
Aneuploidie ist die häufigste genetische Anomalie, die beim Menschen zu frühen Fehlgeburten und Schwangerschaftsversagen führt. Die meisten Fehler in der Chromosomentrennung, die zu Aneuploidie führen, treten während der Meiose in Eizellen auf, aber warum die Eizellmeiose fehleranfällig ist, ist noch nicht vollständig geklärt. Während der Zellteilung verhindern Zellen Fehler in der Chromosomentrennung, indem sie den Spindle Assembly Checkpoint (SAC) aktivieren. Dieser Kontrollmechanismus beruht auf der Erkennung von Kinetochor (KT)-Mikrotubuli (MT) und der Erfassung der von Spindelfasern erzeugten Spannung. Wenn KTs nicht gebunden sind, wird der SAC aktiviert und verhindert das Fortschreiten des Zellzyklus. Das SAC wird zuerst durch die MPS1-Kinase aktiviert, die die Rekrutierung und Bildung des mitotischen Checkpoint-Komplexes (MCC) auslöst, der aus MAD1, MAD2, BUB3 und BUBR1 besteht. Dann diffundiert das MCC in das Zytoplasma und sequestriert CDC20, einen anaphasenfördernden Komplex/Zyklosom-Aktivator (APC/C). Sobald KTs an Mikrotubuli gebunden sind und die Chromosomen an der Metaphasenplatte ausgerichtet sind, wird der SAC zum Schweigen gebracht, CDC20 wird freigesetzt und der APC/C wird aktiviert, wodurch der Abbau von Cyclin B und Securin ausgelöst wird, wodurch der Beginn der Anaphase ermöglicht wird. Im Vergleich zu somatischen Zellen ist die SAC in Eizellen nicht so effektiv, da Zellen trotz ungebundener KTs eine Anaphase durchlaufen können. Um zu verstehen, warum die SAC freizügiger ist und ob diese Permissivität eine der Ursachen für Chromosomentrennungsfehler in Eizellen ist, bedarf es noch weiterer Untersuchungen. Das vorliegende Protokoll beschreibt die drei Techniken zur umfassenden Beurteilung der SAC-Integrität in Maus-Eizellen. Diese Techniken umfassen die Verwendung von Nocodazol zur Depolymerisierung von MTs zur Bewertung der SAC-Antwort, die Verfolgung der SAC-Stummschaltung durch Verfolgung der Kinetik der Securin-Zerstörung und die Bewertung der Rekrutierung von MAD2 zu KTs durch Immunfluoreszenz. Zusammen untersuchen diese Techniken Mechanismen, die benötigt werden, um gesunde Eier zu produzieren, indem sie eine vollständige Bewertung der SAC-Integrität liefern.
Introduction
Aneuploidie, die durch Fehler in der Chromosomentrennung entsteht, ist die Hauptursache für frühe Fehlgeburten und steht in engem Zusammenhang mit Fehlern in der Meiose1. Die Meiose unterscheidet sich von der Mitose dadurch, dass sie aus zwei Zellteilungsrunden ohne einen dazwischenliegenden DNA-Replikationsschritt besteht. In der Meiose I trennen sich homologe Chromosomen, während Schwesterchromatiden zusammen bleiben. In Eizellen ist dieser Schritt fehleranfällig und führt zur Produktion von aneuploiden Eizellen2.
Um Fehler bei der Chromosomentrennung zu vermeiden, aktivieren die meisten Zelltypen einen Überwachungsmechanismus, der den Zellzyklus anhält, den sogenannten Spindle Assembly Checkpoint (SAC). Dieser Mechanismus erkennt Kinetochor (KT)-Mikrotubuli (MT) -Anhaftungen und die Spannung wird erzeugt, wenn Chromosomen bipolar ausgerichtet sind3. Ungebundene Kinetochoren lösen eine SAC-Reaktion aus, die mit der Rekrutierung von MPS1, dem Master-Regulator des SAC, zu den Kinetochoren 3,4 beginnt. MPS1 initiiert die Rekrutierung anderer SAC-Komponenten und fungiert als Plattform für die Bildung des mitotischen Checkpoint-Komplexes (MCC). Das MCC, bestehend aus MAD1, MAD2, BUB3 und BUBR1, diffundiert in das Zytoplasma und hemmt die APC/C-Aktivierung, indem es seinen Aktivator CDC20 sequestriert. Sobald alle Kinetochoren stabil an MTs gebunden sind und die Chromosomen an der Metaphasenplatte ausgerichtet sind, wird der SAC zum Schweigen gebracht, und der MCC zerlegt und setzt CDC20 frei, wodurch eine APC/C-Aktivierung ermöglicht wird. Aktives APC/C baut Securin und Cyclin B ab, zwei wichtige Schritte bei der Auslösung des Beginnsder Anaphase 5,6. In somatischen Zellen ist das SAC stringent, da es durch ein einzelnes, nicht gebundenes Kinetochor aktiviert wird und ausreicht, um einen Zellzyklusstillstand zu induzieren6. Während der Meiose der Oozyten ist die SAC jedoch freizügiger, und die Eizellen können mit einer oder mehreren ungebundenen Kinetochorenin die Anaphase I eintreten 6,7,8,9,10. Zu verstehen, warum die SAC in Eizellen freizügiger ist, ist ein fortlaufender Schwerpunkt in diesem Bereich. Mechanismen, die Defekte in der SAC-Aktivierung oder SAC-Stummschaltung verursachen, können zu Fehlern in der Chromosomentrennung oder zu einem verlängerten Zellzyklusstillstand und Zelltod führen. Daher ist die Bewertung der Mechanismen, die die SAC-Integrität in Eizellen aufrechterhalten, wichtig, um den Prozess der Bildung gesunder, euploider Eizellen zu verstehen.
Dieses Protokoll beschreibt Techniken zur umfassenden Bewertung der SAC-Integrität in der Meiose von Maus-Eizellen durch die Untersuchung verschiedener kritischer Schritte des Checkpoints. Zunächst wird die Auswertung der SAC-Antwort nach Induktion der SAC-Aktivierung beschrieben. Diese Aktivierung wird durch die Erzeugung von ungebundenen Kinetochoren unter Verwendung von Nocodazol erreicht, einem Medikament, das MTs11 depolymerisiert. Zweitens wird eine Methode zur Überwachung der SAC-Stummschaltung beschrieben, indem die Dynamik des Securin-Abbaus während der Eizellreifung verfolgt wird. Schließlich wird ein Immunfluoreszenz-basierter Assay verwendet, um die Rekrutierung von MAD2, einer der MCC-Komponenten, zu Kinetochoren zu messen. Zusammen bewerten diese Assays umfassend die SAC-Integrität während der meiotischen Reifung der Eizellen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Der Kontrollpunkt für die Spindelmontage ist ein kritischer Kontrollmechanismus während der Zellteilung, der Fehler bei der Chromosomentrennung verhindern soll. Dadurch hat die Zelle genügend Zeit, um unsachgemäße KT-MT-Anhänge zu korrigieren. Die Meiose in Eizellen ist ein fehleranfälliger Prozess, bei dem der größte Teil der Chromosomentrennung während der Meiose I auftritt, was zur Bildung von aneuploiden Eiern führt, die die Hauptursache für frühe Fehlgeburten und Unfruchtbarkeit beim Menschen sind<sup c…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Finanzierung für dieses Projekt wurde von den National Institutes of Health (R35GM136340 an KS) zur Verfügung gestellt.
Materials
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A4503 | |
| DAPI | Life Technologies | D1306 | |
| Dimethyl-sulfoxide (DMSO) | Sigma | D5879 | |
| Donkey-anti-rabbit-Alexa-568 | Life Technologies | A10042 | |
| EVOS FL Auto Imaging System | Life Technologies | Fluorescence microscope | |
| EVOS Onstage Incubator | Life Technologies | Incubator chamber | |
| Glass Bottom 96- well plates N 1.5 uncoated | MatTek Corporation | P96G-1.5-5-F | |
| goat-anti-human-Alexa-633 | Life Technologies | A21091 | |
| HEPES | Sigma | H3537 | |
| Human anti-ACA | Antibodies Incorporated | 15-234 | Dilution 1/30 |
| ImageJ | NIH | ||
| KCl | Sigma | P5405 | |
| KH2PO4 | Sigma | P5655 | |
| Leica SP8 equipped with a 63×, 1.40 NA oil immersion objective | Leica | ||
| MgSO4·7H20 | Sigma | M7774 | |
| Milrinone | Sigma | M4659 | |
| Na2HPO4 | Sigma | S2429 | |
| NaCl | Sigma | S5886 | |
| NaN3 | Sigma | S2002 | |
| Nocodazole | Sigma | M1404 | |
| Paraformaldhyde (PFA) | Sigma | P6148 | |
| PIPES | Sigma | P6757 | |
| Rabbit anti- MAD2 | Biolegend | 924601 | Dilution 1/1000; previously Covance #PRB-452C |
| Reversine | Cayman Chemical | 10004412 | |
| Triton-X | Sigma | 274348 | |
| Tween-20 | Sigma | X100 | |
| Vectashield | Vector laboratories | H-1000 |
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