마우스 난 모세포의 스핀들 어셈블리 체크 포인트 무결성 평가
Summary
염색체 분리의 오류는 난 모세포에서 공통적 인 특징입니다. 따라서 스핀들 어셈블리 체크 포인트를 연구하면 건강한 알을 생산하는 데 필요한 메커니즘에 대한 중요한 단서를 얻을 수 있습니다. 본 프로토콜은 마우스 난모세포에서 스핀들 어셈블리 체크포인트 무결성을 평가하기 위한 세 가지 보완 분석을 설명합니다.
Abstract
이배체는 인간의 조기 유산과 임신 실패를 유발하는 주요 유전적 이상입니다. 이수성을 유발하는 염색체 분리의 대부분의 오류는 난 모세포에서 감수 분열 중에 발생하지만 난 모세포 감수 분열이 오류가 발생하기 쉬운 이유는 아직 완전히 이해되지 않았습니다. 세포 분열 중에 세포는 스핀들 어셈블리 체크포인트(SAC)를 활성화하여 염색체 분리의 오류를 방지합니다. 이 제어 메커니즘은 키네토코어(KT)-미세소관(MT) 부착물을 감지하고 스핀들 섬유에서 발생하는 장력을 감지하는 데 의존합니다. KT가 부착되지 않으면 SAC가 활성화되어 세포주기 진행을 방지합니다. SAC는 먼저 MPS1 키나아제에 의해 활성화되며, 이는 MAD1, MAD2, BUB3 및 BUBR1로 구성된 유사분열 체크포인트 복합체(MCC)의 모집 및 형성을 유발합니다. 그런 다음 MCC는 세포질로 확산되어 아나페이즈 촉진 복합체/사이클로솜(APC/C) 활성제인 CDC20을 격리합니다. KT가 미세소관에 부착되고 염색체가 중기 판에 정렬되면 SAC가 침묵하고 CDC20이 방출되며 APC/C가 활성화되어 사이클린 B와 세큐린의 분해를 유발하여 후기가 시작됩니다. 체세포와 비교할 때, 난 모세포의 SAC는 세포가 부착되지 않은 KT를 가지고 있음에도 불구하고 퇴보를 겪을 수 있기 때문에 효과적이지 않습니다. SAC가 더 관대 한 이유와이 방임성이 난 모세포에서 염색체 분리 오류의 원인 중 하나인지 이해하려면 여전히 추가 조사가 필요합니다. 본 프로토콜은 마우스 난모세포에서 SAC 무결성을 종합적으로 평가하기 위한 세 가지 기술을 기술한다. 이러한 기술에는 노코다졸을 사용하여 MT를 해중합하여 SAC 반응을 평가하고, Securin 파괴의 동역학에 따라 SAC 침묵을 추적하고, 면역형광법에 의한 KT로의 MAD2 모집 평가가 포함됩니다. 이러한 기술을 함께 조사하여 SAC 무결성에 대한 완전한 평가를 제공하여 건강한 난자를 생산하는 데 필요한 메커니즘을 조사합니다.
Introduction
염색체 분리의 오류로 인해 발생하는 이배체는 조기 유산의 주요 원인이며 감수 분열1의 실수와 밀접한 관련이 있습니다. 감수 분열은 개입 DNA 복제 단계없이 두 차례의 세포 분열로 구성되기 때문에 유사 분열과 구별됩니다. 감수 분열 I에서는 상동 염색체가 분리되고 자매 염색분체는 함께 유지됩니다. 난 모세포에서이 단계는 오류가 발생하기 쉽고 이수성 알 생산2.
염색체 분리 오류를 방지하기 위해 대부분의 세포 유형은 스핀들 어셈블리 체크포인트(SAC)라고 하는 세포 주기를 일시 중지하는 감시 메커니즘을 활성화합니다. 이 메커니즘은 키네토코어(KT)-미세소관(MT) 부착물을 감지하고 염색체가 양극성 방식으로 배향될 때 장력이 생성됩니다3. 부착되지 않은 키네토코어는 SAC의 마스터 레귤레이터인 MPS1을 키네토코레스 3,4에 모집하는 것으로 시작하는 SAC 반응을 트리거합니다. MPS1은 유사분열 체크포인트 복합체(MCC)를 형성하는 플랫폼 역할을 하는 다른 SAC 구성 요소의 모집을 시작합니다. MAD1, MAD2, BUB3 및 BUBR1로 구성된 MCC는 세포질로 확산되고 활성제 CDC20을 격리하여 APC/C 활성화를 억제합니다. 모든 키네토코레가 MT에 안정적으로 부착되고 염색체가 중기 플레이트에서 정렬되면 SAC가 침묵되고 MCC가 CDC20을 분해 및 방출하여 APC/C 활성화를 허용합니다. 활성 APC/C는 아나페이즈 발병 5,6을 유발하는 두 가지 주요 단계인 Securin과 Cyclin B를 분해합니다. 체세포에서 SAC는 부착되지 않은 단일 키네토코어에 의해 활성화되고 세포 주기 정지를 유도하기에 충분하기 때문에 엄격합니다6. 그러나, 난 모세포 감수 분열 동안, SAC는보다 관대하며, 난 모세포는 하나 이상의 부착되지 않은 키네 토코 레스 6,7,8,9,10으로 아나 페이즈 I에 들어갈 수있다. SAC가 난 모세포에서 더 관대 한 이유를 이해하는 것은이 분야에서 지속적인 초점 영역입니다. SAC 활성화 또는 SAC 침묵에 결함을 일으키는 메커니즘은 염색체 분리 또는 장기간의 세포주기 정지 및 세포 사멸에 오류를 초래할 수 있습니다. 따라서 난 모세포에서 SAC 무결성을 유지하는 메커니즘을 평가하는 것은 건강한 유배체 난자를 형성하는 과정을 이해하는 데 중요합니다.
이 프로토콜은 체크포인트의 여러 중요한 단계를 검사하여 마우스 난모세포 감수분열에서 SAC 무결성을 종합적으로 평가하는 기술을 설명합니다. 먼저, SAC 활성화 유도 후의 SAC 반응의 평가에 대해 설명한다. 이 활성화는MTs 11을 해중합하는 약물 인 노코다졸을 사용하여 부착되지 않은 키네토 코를 생성함으로써 달성됩니다. 둘째, SAC 침묵을 모니터링하는 방법은 난 모세포 성숙 동안 Securin 분해의 역학을 추적함으로써 설명됩니다. 마지막으로, 면역형광법 기반 분석을 사용하여 MCC 구성 요소 중 하나인 MAD2를 키네토코어에 동원합니다. 함께, 이러한 분석은 난 모세포 감수 분열 성숙 동안 SAC 무결성을 종합적으로 평가합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
스핀들 어셈블리 체크포인트는 염색체 분리 오류를 방지하기 위해 설계된 세포 분열 중 중요한 제어 메커니즘입니다. 이를 통해 셀은 부적절한 KT-MT 부착물을 교정할 수 있는 충분한 시간을 가질 수 있습니다. 난 모세포의 감수 분열은 오류가 발생하기 쉬운 과정으로, 대부분의 염색체 분리 오류가 감수 분열 I 중에 발생하여 인간의 조기 유산과 불임의 주요 원인 인 이수성 난자가 생성됩니다<sup c…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 프로젝트에 대한 자금은 국립 보건원 (R35GM136340에서 KS로)에서 제공했습니다.
Materials
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A4503 | |
| DAPI | Life Technologies | D1306 | |
| Dimethyl-sulfoxide (DMSO) | Sigma | D5879 | |
| Donkey-anti-rabbit-Alexa-568 | Life Technologies | A10042 | |
| EVOS FL Auto Imaging System | Life Technologies | Fluorescence microscope | |
| EVOS Onstage Incubator | Life Technologies | Incubator chamber | |
| Glass Bottom 96- well plates N 1.5 uncoated | MatTek Corporation | P96G-1.5-5-F | |
| goat-anti-human-Alexa-633 | Life Technologies | A21091 | |
| HEPES | Sigma | H3537 | |
| Human anti-ACA | Antibodies Incorporated | 15-234 | Dilution 1/30 |
| ImageJ | NIH | ||
| KCl | Sigma | P5405 | |
| KH2PO4 | Sigma | P5655 | |
| Leica SP8 equipped with a 63×, 1.40 NA oil immersion objective | Leica | ||
| MgSO4·7H20 | Sigma | M7774 | |
| Milrinone | Sigma | M4659 | |
| Na2HPO4 | Sigma | S2429 | |
| NaCl | Sigma | S5886 | |
| NaN3 | Sigma | S2002 | |
| Nocodazole | Sigma | M1404 | |
| Paraformaldhyde (PFA) | Sigma | P6148 | |
| PIPES | Sigma | P6757 | |
| Rabbit anti- MAD2 | Biolegend | 924601 | Dilution 1/1000; previously Covance #PRB-452C |
| Reversine | Cayman Chemical | 10004412 | |
| Triton-X | Sigma | 274348 | |
| Tween-20 | Sigma | X100 | |
| Vectashield | Vector laboratories | H-1000 |
References
- Gruhn, J. R., et al. Chromosome errors in human eggs shape natural fertility over reproductive life span. Science. 365 (6460), 1466-1469 (2019).
- Nagaoka, S. I., Hassold, T. J., Hunt, P. A. Human aneuploidy: mechanisms and new insights into an age-old problem. Nature Reviews. Genetics. 13 (7), 493-504 (2012).
- Musacchio, A. The molecular biology of spindle assembly checkpoint signaling dynamics. Current Biology. 25 (20), 1002-1018 (2015).
- Lara-Gonzalez, P., Westhorpe, F. G., Taylor, S. S. The spindle assembly checkpoint. Current Biology. 22 (22), 966-980 (2012).
- London, N., Biggins, S. Signalling dynamics in the spindle checkpoint response. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (11), 736-748 (2014).
- Kuhn, J., Dumont, S. Mammalian kinetochores count attached microtubules in a sensitive and switch-like manner. Journal of Cell Biology. 218 (11), 3583-3596 (2019).
- Jones, K. T., Lane, S. I. R. Molecular causes of aneuploidy in mammalian eggs. Development. 140 (18), 3719-3730 (2013).
- Gui, L., Homer, H. Spindle assembly checkpoint signalling is uncoupled from chromosomal position in mouse oocytes. Development. 139 (11), 1941-1946 (2012).
- Nagaoka, S. I., Hodges, C. A., Albertini, D. F., Hunt, P. A. Oocyte-specific differences in cell-cycle control create an innate susceptibility to meiotic errors. Current Biology. 21 (8), 651-657 (2011).
- Sebestova, J., Danylevska, A., Novakova, L., Kubelka, M., Anger, M. Lack of response to unaligned chromosomes in mammalian female gametes. Cell Cycle. 11 (16), 3011-3018 (2012).
- Vasquez, R. J., Howell, B., Yvon, A. M., Wadsworth, P., Cassimeris, L. Nanomolar concentrations of nocodazole alter microtubule dynamic instability in vivo and in vitro. Molecular Biology of the Cell. 8 (6), 973-985 (1997).
- Stein, P., Schindler, K. Mouse oocyte microinjection, maturation and ploidy assessment. Journal of Visualized Experiments. (53), e2851 (2011).
- Thomas, R. E., Thompson, J. G., Armstrong, D. T., Gilchrist, R. B. Effect of specific phosphodiesterase isoenzyme inhibitors during in vitro maturation of bovine oocytes on meiotic and developmental capacity. Biology of Reproduction. 71 (4), 1142-1149 (2004).
- Marin, D., Nguyen, A. L., Scott, R. T., Schindler, K. Using mouse oocytes to assess human gene function during meiosis I. Journal of Visualized Experiments. (134), e57442 (2018).
- Herbert, M., et al. Homologue disjunction in mouse oocytes requires proteolysis of securin and cyclin B1. Nature Cell Biology. 5 (11), 1023-1025 (2003).
- Solc, P., et al. Multiple requirements of PLK1 during Mouse oocyte maturation. PLoS One. 10 (2), 0116783 (2015).
- Blengini, C. S., Nguyen, A. L., Aboelenain, M., Schindler, K. Age-dependent integrity of the meiotic spindle assembly checkpoint in females requires Aurora kinase B. Aging Cell. 20 (11), 13489 (2021).
- Balboula, A. Z., et al. Haspin kinase regulates microtubule-organizing center clustering and stability through Aurora kinase C in mouse oocytes. Journal of Cell Science. 129 (19), 3648-3660 (2016).
- Nabti, I., Grimes, R., Sarna, H., Marangos, P., Carroll, J. Maternal age-dependent APC/C-mediated decrease in securin causes premature sister chromatid separation in meiosis II. Nature Communications. 8 (1), 15346 (2017).
- Blengini, C. S., Schindler, K. Immunofluorescence technique to detect subcellular structures critical to oocyte maturation. Methods in Molecular Biology. 1818, 67-76 (2018).
- Santaguida, S., Tighe, A., D’Alise, A. M., Taylor, S. S., Musacchio, A. Dissecting the role of MPS1 in chromosome biorientation and the spindle checkpoint through the small molecule inhibitor reversine. Journal of Cell Biology. 190 (1), 73-87 (2010).
- Musacchio, A. The molecular biology of spindle assembly checkpoint signaling dynamics. Current Biology. 25 (20), 1002-1018 (2015).
- Wassmann, K., Niault, T., Maro, B. Metaphase I arrest upon activation of the Mad2-dependent spindle checkpoint in mouse oocytes. Current Biology. 13 (18), 1596-1608 (2003).
- Hassold, T., Hall, H., Hunt, P. The origin of human aneuploidy: where we have been, where we are going. Human Molecular Genetics. 16, 203-208 (2007).
- Gui, L., Homer, H. Spindle assembly checkpoint signalling is uncoupled from chromosomal position in mouse oocytes. Development. 139 (11), 1941-1946 (2012).
- Homer, H. A., et al. Mad2 prevents aneuploidy and premature proteolysis of cyclin B and securin during meiosis I in mouse oocytes. Genes and Development. 19 (2), 202-207 (2005).
- Blengini, C. S., et al. Aurora kinase A is essential for meiosis in mouse oocytes. PLOS Genetics. 17 (4), 1009327 (2021).
- Hagting, A., et al. Human securin proteolysis is controlled by the spindle checkpoint and reveals when the APC/C switches from activation by Cdc20 to Cdh1. Journal of Cell Biology. 157 (7), 1125-1137 (2002).
- Rodriguez-Rodriguez, J. A., et al. Distinct roles of RZZ and Bub1-KNL1 in mitotic checkpoint signaling and kinetochore expansion. Current Biology. 28 (21), 3422-3429 (2018).
- Chambon, J. P., Hached, K., Wassmann, K. Chromosome spreads with centromere staining in mouse oocytes. Methods in Molecular Biology. 957, 203-212 (2013).
