Avaliação da Integridade do Ponto de Verificação da Montagem do Fuso em Oócitos de Rato
Summary
O erro na segregação cromossômica é uma característica comum nos ovócitos. Portanto, estudar o ponto de verificação de montagem do fuso dá pistas importantes sobre os mecanismos necessários para produzir ovos saudáveis. O presente protocolo descreve três ensaios complementares para avaliar a integridade do ponto de verificação da montagem do fuso em ovócitos de rato.
Abstract
A aneuploidia é a principal anormalidade genética que causa aborto espontâneo precoce e falha na gravidez em humanos. A maioria dos erros na segregação cromossômica que dão origem à aneuploidia ocorre durante a meiose em ovócitos, mas por que a meiose de ovócitos é propensa a erros ainda não é totalmente compreendida. Durante a divisão celular, as células evitam erros na segregação cromossômica ativando o ponto de verificação de montagem do fuso (SAC). Este mecanismo de controle baseia-se na detecção de ligações cinetócoro-microtúbulo (MT) e na detecção da tensão gerada pelas fibras do fuso. Quando os KTs são desconectados, o SAC é ativado e impede a progressão do ciclo celular. O SAC é ativado primeiramente pela MPS1 quinase, que desencadeia o recrutamento e a formação do complexo de pontos de verificação mitóticos (CCM), composto por MAD1, MAD2, BUB3 e BUBR1. Em seguida, o CCM se difunde no citoplasma e sequestra o CDC20, um ativador de complexo/ciclossomo promotor de anáfases (APC/C). Uma vez que os KTs se ligam aos microtúbulos e os cromossomos são alinhados na placa metafásica, o SAC é silenciado, o CDC20 é liberado e o APC/C é ativado, desencadeando a degradação da ciclina B e da securina, permitindo assim o início da anáfase. Em comparação com as células somáticas, o SAC nos oócitos não é tão eficaz porque as células podem sofrer anáfase, apesar de terem KTs desligados. Entender por que o SAC é mais permissivo e se essa permissividade é uma das causas dos erros de segregação cromossômica nos oócitos ainda precisa de mais investigação. O presente protocolo descreve as três técnicas para avaliar de forma abrangente a integridade do SAC em ovócitos de camundongos. Essas técnicas incluem o uso de nocodazol para despolimerizar MTs para avaliar a resposta do SAC, o rastreamento do silenciamento do SAC seguindo a cinética da destruição da Securin e a avaliação do recrutamento de MAD2 para KTs por imunofluorescência. Juntas, essas técnicas investigam os mecanismos necessários para produzir óvulos saudáveis, fornecendo uma avaliação completa da integridade do SAC.
Introduction
A aneuploidia, que surge de erros na segregação cromossômica, é a principal causa de abortos espontâneos precoces e está altamente ligada a erros na meiose1. A meiose é distinta da mitose porque consiste em duas rodadas de divisão celular sem uma etapa intermediária de replicação do DNA. Na meiose I, os cromossomos homólogos se separam, enquanto as cromátides irmãs permanecem juntas. Nos ovócitos, essa etapa é propensa a erros, levando à produção de óvulos aneuploides2.
Para evitar erros de segregação cromossômica, a maioria dos tipos de células ativa um mecanismo de vigilância que pausa o ciclo celular, chamado de ponto de verificação de montagem do fuso (SAC). Esse mecanismo detecta os anexos cinetócoro (KT)-microtúbulo (MT) e a tensão é gerada quando os cromossomos são orientados de maneira bipolar3. Os cinetocoros não anexados desencadeiam uma resposta SAC que começa com o recrutamento do MPS1, o regulador mestre do SAC, para os cinetocoros 3,4. O MPS1 inicia o recrutamento de outros componentes do SAC, atuando como uma plataforma para formar o complexo de ponto de verificação mitótico (CCM). O CCM, composto por MAD1, MAD2, BUB3 e BUBR1, difunde-se no citoplasma e inibe a ativação da APC/C sequestrando seu ativador CDC20. Uma vez que todos os cinetocoros estão estáveis ligados aos MTs e os cromossomos estão alinhados na placa de metáfase, o SAC é silenciado e o MCC desmonta e libera o CDC20, permitindo assim a ativação do APC/C. A APC/C ativa degrada a Securin e a Ciclina B, dois passos fundamentais no desencadeamento do início da anáfase 5,6. Nas células somáticas, o SAC é rigoroso porque é ativado por um único cinetócoro desanexado e é suficiente para induzir a parada do ciclo celular6. Entretanto, durante a meiose dos ovócitos, o SAC é mais permissivo, e os ovócitos podem entrar na anáfase I com um ou mais cinetocoros não ligados 6,7,8,9,10. Entender por que o SAC é mais permissivo em ovócitos é uma área contínua de foco no campo. Mecanismos que causam defeitos na ativação do SAC ou silenciamento do SAC podem levar a erros na segregação cromossômica ou parada prolongada do ciclo celular e morte celular. Portanto, avaliar os mecanismos que mantêm a integridade do SAC em oócitos é importante para entender o processo de formação de ovos euploides saudáveis.
Este protocolo descreve técnicas para avaliar de forma abrangente a integridade do SAC na meiose de ovócitos de camundongos, examinando diferentes etapas críticas do ponto de verificação. Primeiramente, descreve-se a avaliação da resposta do SAC após a indução da ativação do SAC. Essa ativação é obtida por meio da geração de cinetocoros desanexados utilizando nocodazol, fármaco que despolimeriza MTs11. Em segundo lugar, um método para monitorar o silenciamento de SAC é descrito rastreando a dinâmica da degradação de Securin durante a maturação de ovócitos. Finalmente, um ensaio baseado em imunofluorescência é empregado para medir o recrutamento de MAD2, um dos componentes do CCM, para cinetocoros. Juntos, esses ensaios avaliam de forma abrangente a integridade do SAC durante a maturação meiótica dos ovócitos.
Protocol
Representative Results
Discussion
O ponto de verificação de montagem do fuso é um mecanismo de controle crítico durante a divisão celular projetado para evitar erros de segregação cromossômica. Ele permite que a célula tenha tempo suficiente para corrigir anexos KT-MT inadequados. A meiose em oócitos é um processo propenso a erros, onde a maior parte da segregação incorreta cromossômica ocorre durante a meiose I, levando à geração de óvulos aneuploides que são a principal causa de abortos espontâneos precoces e infertilidade em humano…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
O financiamento para este projeto foi fornecido pelos Institutos Nacionais de Saúde (R35GM136340 para KS).
Materials
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A4503 | |
| DAPI | Life Technologies | D1306 | |
| Dimethyl-sulfoxide (DMSO) | Sigma | D5879 | |
| Donkey-anti-rabbit-Alexa-568 | Life Technologies | A10042 | |
| EVOS FL Auto Imaging System | Life Technologies | Fluorescence microscope | |
| EVOS Onstage Incubator | Life Technologies | Incubator chamber | |
| Glass Bottom 96- well plates N 1.5 uncoated | MatTek Corporation | P96G-1.5-5-F | |
| goat-anti-human-Alexa-633 | Life Technologies | A21091 | |
| HEPES | Sigma | H3537 | |
| Human anti-ACA | Antibodies Incorporated | 15-234 | Dilution 1/30 |
| ImageJ | NIH | ||
| KCl | Sigma | P5405 | |
| KH2PO4 | Sigma | P5655 | |
| Leica SP8 equipped with a 63×, 1.40 NA oil immersion objective | Leica | ||
| MgSO4·7H20 | Sigma | M7774 | |
| Milrinone | Sigma | M4659 | |
| Na2HPO4 | Sigma | S2429 | |
| NaCl | Sigma | S5886 | |
| NaN3 | Sigma | S2002 | |
| Nocodazole | Sigma | M1404 | |
| Paraformaldhyde (PFA) | Sigma | P6148 | |
| PIPES | Sigma | P6757 | |
| Rabbit anti- MAD2 | Biolegend | 924601 | Dilution 1/1000; previously Covance #PRB-452C |
| Reversine | Cayman Chemical | 10004412 | |
| Triton-X | Sigma | 274348 | |
| Tween-20 | Sigma | X100 | |
| Vectashield | Vector laboratories | H-1000 |
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