Valutazione dell'integrità del checkpoint dell'assemblaggio del mandrino negli ovociti di topo
Summary
L’errore nella segregazione cromosomica è una caratteristica comune negli ovociti. Pertanto, lo studio del punto di controllo dell’assemblaggio del fuso fornisce importanti indizi sui meccanismi necessari per produrre uova sane. Il presente protocollo descrive tre saggi complementari per valutare l’integrità del checkpoint di assemblaggio del fuso negli ovociti di topo.
Abstract
L’aneuploidia è la principale anomalia genetica che causa l’aborto spontaneo precoce e il fallimento della gravidanza negli esseri umani. La maggior parte degli errori nella segregazione cromosomica che danno origine all’aneuploidia si verificano durante la meiosi negli ovociti, ma il motivo per cui la meiosi degli ovociti è soggetta a errori non è ancora completamente compreso. Durante la divisione cellulare, le cellule prevengono gli errori nella segregazione cromosomica attivando il punto di controllo dell’assemblaggio del fuso (SAC). Questo meccanismo di controllo si basa sul rilevamento degli attacchi cinetocomeri-microtubuli (MT) e sul rilevamento della tensione generata dalle fibre del mandrino. Quando i KT non sono attaccati, il SAC viene attivato e impedisce la progressione del ciclo cellulare. Il SAC viene attivato prima dalla chinasi MPS1, che innesca il reclutamento e la formazione del complesso del checkpoint mitotico (MCC), composto da MAD1, MAD2, BUB3 e BUBR1. Quindi, l’MCC si diffonde nel citoplasma e sequestra CDC20, un attivatore del complesso/ciclosoma che promuove l’anafase (APC/C). Una volta che i KT si attaccano ai microtubuli e i cromosomi sono allineati alla piastra di metafase, il SAC viene silenziato, CDC20 viene rilasciato e l’APC / C viene attivato, innescando la degradazione di ciclina B e Securin, consentendo così l’insorgenza dell’anafase. Rispetto alle cellule somatiche, il SAC negli ovociti non è altrettanto efficace perché le cellule possono subire anafase nonostante abbiano KT non attaccati. Capire perché il SAC è più permissivo e se questa permissività è una delle cause degli errori di segregazione cromosomica negli ovociti richiede ancora ulteriori indagini. Il presente protocollo descrive le tre tecniche per valutare in modo completo l’integrità del SAC negli ovociti di topo. Queste tecniche includono l’uso del nocodazolo per depolimerizzare MT per valutare la risposta SAC, il monitoraggio del silenziamento del SAC seguendo la cinetica della distruzione della Securin e la valutazione del reclutamento di MAD2 in KT mediante immunofluorescenza. Insieme, queste tecniche sondano i meccanismi necessari per produrre uova sane fornendo una valutazione completa dell’integrità del SAC.
Introduction
L’aneuploidia, che deriva da errori nella segregazione cromosomica, è la principale causa di aborti precoci ed è altamente legata agli errori nella meiosi1. La meiosi si distingue dalla mitosi perché consiste in due cicli di divisione cellulare senza una fase di replicazione del DNA intermedia. Nella meiosi I, i cromosomi omologhi si separano mentre i cromatidi fratelli rimangono insieme. Negli ovociti, questo passaggio è soggetto a errori, portando alla produzione di uova aneuploidi2.
Per prevenire errori di segregazione cromosomica, la maggior parte dei tipi di cellule attiva un meccanismo di sorveglianza che mette in pausa il ciclo cellulare, chiamato checkpoint di assemblaggio del fuso (SAC). Questo meccanismo rileva gli attaccamenti cinetocomeri-microtubuli (MT) e la tensione viene generata quando i cromosomi sono orientati in modo bipolare3. I cinetocori non collegati innescano una risposta SAC che inizia con il reclutamento di MPS1, il regolatore principale del SAC, ai cinetocori 3,4. MPS1 avvia il reclutamento di altri componenti SAC, fungendo da piattaforma per formare il complesso del checkpoint mitotico (MCC). L’MCC, composto da MAD1, MAD2, BUB3 e BUBR1, si diffonde nel citoplasma e inibisce l’attivazione di APC/C sequestrando il suo attivatore CDC20. Una volta che tutti i cinetocori sono stabilmente attaccati alle MT e i cromosomi sono allineati alla piastra metafase, il SAC viene silenziato e l’MCC si smonta e rilascia CDC20, consentendo così l’attivazione APC / C. L’APC/C attivo degrada Securin e Cyclin B, due passaggi chiave per innescare l’insorgenza dell’anafase 5,6. Nelle cellule somatiche, il SAC è rigoroso perché è attivato da un singolo cinetocore non attaccato ed è sufficiente per indurre l’arresto del ciclo cellulare6. Tuttavia, durante la meiosi ovocitaria, il SAC è più permissivo e gli ovociti possono entrare in anafase I con uno o più cinetocori non attaccati 6,7,8,9,10. Capire perché il SAC è più permissivo negli ovociti è un’area di interesse costante nel campo. I meccanismi che causano difetti nell’attivazione del SAC o nel silenziamento del SAC potrebbero portare a errori nella segregazione cromosomica o all’arresto prolungato del ciclo cellulare e alla morte cellulare. Pertanto, valutare i meccanismi che mantengono l’integrità del SAC negli ovociti è importante per comprendere il processo di formazione di uova sane ed euploidi.
Questo protocollo descrive le tecniche per valutare in modo completo l’integrità del SAC nella meiosi degli ovociti di topo esaminando diversi passaggi critici del checkpoint. In primo luogo, viene descritta la valutazione della risposta SAC dopo aver indotto l’attivazione del SAC. Questa attivazione si ottiene generando cinetocori non attaccati utilizzando nocodazolo, un farmaco che depolimerizza MTs11. In secondo luogo, un metodo per monitorare il silenziamento del SAC è descritto monitorando la dinamica della degradazione della Securin durante la maturazione degli ovociti. Infine, un saggio basato sull’immunofluorescenza viene impiegato per misurare il reclutamento di MAD2, uno dei componenti MCC, nei cinetori. Insieme, questi test valutano in modo completo l’integrità del SAC durante la maturazione meiotica degli ovociti.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il checkpoint di assemblaggio del mandrino è un meccanismo di controllo critico durante la divisione cellulare progettato per prevenire errori di segregazione cromosomica. Consente alla cellula di avere abbastanza tempo per correggere gli attacchi KT-MT impropri. La meiosi negli ovociti è un processo soggetto a errori, in cui la maggior parte della mis-segregazione cromosomica si verifica durante la meiosi I, portando alla generazione di uova aneuploidi che sono la principale causa di aborti precoci e infertilità nell…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Il finanziamento per questo progetto è stato fornito dal National Institutes of Health (R35GM136340 a KS).
Materials
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A4503 | |
| DAPI | Life Technologies | D1306 | |
| Dimethyl-sulfoxide (DMSO) | Sigma | D5879 | |
| Donkey-anti-rabbit-Alexa-568 | Life Technologies | A10042 | |
| EVOS FL Auto Imaging System | Life Technologies | Fluorescence microscope | |
| EVOS Onstage Incubator | Life Technologies | Incubator chamber | |
| Glass Bottom 96- well plates N 1.5 uncoated | MatTek Corporation | P96G-1.5-5-F | |
| goat-anti-human-Alexa-633 | Life Technologies | A21091 | |
| HEPES | Sigma | H3537 | |
| Human anti-ACA | Antibodies Incorporated | 15-234 | Dilution 1/30 |
| ImageJ | NIH | ||
| KCl | Sigma | P5405 | |
| KH2PO4 | Sigma | P5655 | |
| Leica SP8 equipped with a 63×, 1.40 NA oil immersion objective | Leica | ||
| MgSO4·7H20 | Sigma | M7774 | |
| Milrinone | Sigma | M4659 | |
| Na2HPO4 | Sigma | S2429 | |
| NaCl | Sigma | S5886 | |
| NaN3 | Sigma | S2002 | |
| Nocodazole | Sigma | M1404 | |
| Paraformaldhyde (PFA) | Sigma | P6148 | |
| PIPES | Sigma | P6757 | |
| Rabbit anti- MAD2 | Biolegend | 924601 | Dilution 1/1000; previously Covance #PRB-452C |
| Reversine | Cayman Chemical | 10004412 | |
| Triton-X | Sigma | 274348 | |
| Tween-20 | Sigma | X100 | |
| Vectashield | Vector laboratories | H-1000 |
References
- Gruhn, J. R., et al. Chromosome errors in human eggs shape natural fertility over reproductive life span. Science. 365 (6460), 1466-1469 (2019).
- Nagaoka, S. I., Hassold, T. J., Hunt, P. A. Human aneuploidy: mechanisms and new insights into an age-old problem. Nature Reviews. Genetics. 13 (7), 493-504 (2012).
- Musacchio, A. The molecular biology of spindle assembly checkpoint signaling dynamics. Current Biology. 25 (20), 1002-1018 (2015).
- Lara-Gonzalez, P., Westhorpe, F. G., Taylor, S. S. The spindle assembly checkpoint. Current Biology. 22 (22), 966-980 (2012).
- London, N., Biggins, S. Signalling dynamics in the spindle checkpoint response. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (11), 736-748 (2014).
- Kuhn, J., Dumont, S. Mammalian kinetochores count attached microtubules in a sensitive and switch-like manner. Journal of Cell Biology. 218 (11), 3583-3596 (2019).
- Jones, K. T., Lane, S. I. R. Molecular causes of aneuploidy in mammalian eggs. Development. 140 (18), 3719-3730 (2013).
- Gui, L., Homer, H. Spindle assembly checkpoint signalling is uncoupled from chromosomal position in mouse oocytes. Development. 139 (11), 1941-1946 (2012).
- Nagaoka, S. I., Hodges, C. A., Albertini, D. F., Hunt, P. A. Oocyte-specific differences in cell-cycle control create an innate susceptibility to meiotic errors. Current Biology. 21 (8), 651-657 (2011).
- Sebestova, J., Danylevska, A., Novakova, L., Kubelka, M., Anger, M. Lack of response to unaligned chromosomes in mammalian female gametes. Cell Cycle. 11 (16), 3011-3018 (2012).
- Vasquez, R. J., Howell, B., Yvon, A. M., Wadsworth, P., Cassimeris, L. Nanomolar concentrations of nocodazole alter microtubule dynamic instability in vivo and in vitro. Molecular Biology of the Cell. 8 (6), 973-985 (1997).
- Stein, P., Schindler, K. Mouse oocyte microinjection, maturation and ploidy assessment. Journal of Visualized Experiments. (53), e2851 (2011).
- Thomas, R. E., Thompson, J. G., Armstrong, D. T., Gilchrist, R. B. Effect of specific phosphodiesterase isoenzyme inhibitors during in vitro maturation of bovine oocytes on meiotic and developmental capacity. Biology of Reproduction. 71 (4), 1142-1149 (2004).
- Marin, D., Nguyen, A. L., Scott, R. T., Schindler, K. Using mouse oocytes to assess human gene function during meiosis I. Journal of Visualized Experiments. (134), e57442 (2018).
- Herbert, M., et al. Homologue disjunction in mouse oocytes requires proteolysis of securin and cyclin B1. Nature Cell Biology. 5 (11), 1023-1025 (2003).
- Solc, P., et al. Multiple requirements of PLK1 during Mouse oocyte maturation. PLoS One. 10 (2), 0116783 (2015).
- Blengini, C. S., Nguyen, A. L., Aboelenain, M., Schindler, K. Age-dependent integrity of the meiotic spindle assembly checkpoint in females requires Aurora kinase B. Aging Cell. 20 (11), 13489 (2021).
- Balboula, A. Z., et al. Haspin kinase regulates microtubule-organizing center clustering and stability through Aurora kinase C in mouse oocytes. Journal of Cell Science. 129 (19), 3648-3660 (2016).
- Nabti, I., Grimes, R., Sarna, H., Marangos, P., Carroll, J. Maternal age-dependent APC/C-mediated decrease in securin causes premature sister chromatid separation in meiosis II. Nature Communications. 8 (1), 15346 (2017).
- Blengini, C. S., Schindler, K. Immunofluorescence technique to detect subcellular structures critical to oocyte maturation. Methods in Molecular Biology. 1818, 67-76 (2018).
- Santaguida, S., Tighe, A., D’Alise, A. M., Taylor, S. S., Musacchio, A. Dissecting the role of MPS1 in chromosome biorientation and the spindle checkpoint through the small molecule inhibitor reversine. Journal of Cell Biology. 190 (1), 73-87 (2010).
- Musacchio, A. The molecular biology of spindle assembly checkpoint signaling dynamics. Current Biology. 25 (20), 1002-1018 (2015).
- Wassmann, K., Niault, T., Maro, B. Metaphase I arrest upon activation of the Mad2-dependent spindle checkpoint in mouse oocytes. Current Biology. 13 (18), 1596-1608 (2003).
- Hassold, T., Hall, H., Hunt, P. The origin of human aneuploidy: where we have been, where we are going. Human Molecular Genetics. 16, 203-208 (2007).
- Gui, L., Homer, H. Spindle assembly checkpoint signalling is uncoupled from chromosomal position in mouse oocytes. Development. 139 (11), 1941-1946 (2012).
- Homer, H. A., et al. Mad2 prevents aneuploidy and premature proteolysis of cyclin B and securin during meiosis I in mouse oocytes. Genes and Development. 19 (2), 202-207 (2005).
- Blengini, C. S., et al. Aurora kinase A is essential for meiosis in mouse oocytes. PLOS Genetics. 17 (4), 1009327 (2021).
- Hagting, A., et al. Human securin proteolysis is controlled by the spindle checkpoint and reveals when the APC/C switches from activation by Cdc20 to Cdh1. Journal of Cell Biology. 157 (7), 1125-1137 (2002).
- Rodriguez-Rodriguez, J. A., et al. Distinct roles of RZZ and Bub1-KNL1 in mitotic checkpoint signaling and kinetochore expansion. Current Biology. 28 (21), 3422-3429 (2018).
- Chambon, J. P., Hached, K., Wassmann, K. Chromosome spreads with centromere staining in mouse oocytes. Methods in Molecular Biology. 957, 203-212 (2013).
