Summary
Este protocolo presenta un sistema optimizado de bioensayo de hojas sueltas para evaluar la efectividad de hongos entomopatógenos (EPF) contra el pulgón de la mostaza (Lipaphis erysimi (Kalt.)), un insecto partenogenético. El método describe el proceso de recopilación de datos durante los experimentos con placas de Petri, lo que permite a los investigadores medir de manera consistente la virulencia de EPF contra pulgones de la mostaza y otros insectos partenogenéticos.
Abstract
El pulgón de la mostaza (L. erysimi) es una plaga que infesta varios cultivos crucíferos y transmite virus de plantas. Para lograr un manejo ecológico de plagas, los hongos entomopatógenos (EPF) son agentes potenciales de control microbiano para controlar esta plaga. Por lo tanto, es necesario realizar un cribado de virulencia de los aislados de EPF en condiciones de placa de Petri antes de la aplicación en campo. Sin embargo, el pulgón de la mostaza es un insecto partenogenético, lo que dificulta el registro de datos durante los experimentos con placas de Petri. Para abordar este problema, se desarrolló un sistema modificado para bioensayos de hojas separadas, utilizando un micropulverizador para inocular conidios en pulgones y evitar ahogamientos al facilitar el secado al aire después de la suspensión de esporas. El sistema mantuvo una alta humedad relativa durante todo el período de observación, y el disco foliar permaneció fresco durante más de diez días, lo que permitió la reproducción partenogenética de los pulgones. Para evitar la acumulación de crías, se implementó un proceso de eliminación diaria con un pincel para pintar. Este protocolo demuestra un sistema estable para evaluar la virulencia de los aislados de EPF contra pulgones de la mostaza u otros pulgones, lo que permite la selección de aislados potenciales para el control de pulgones.
Introduction
El pulgón de la mostaza (L. erysimi) es una plaga notoria que infesta una variedad de cultivos crucíferos, causando importantes pérdidas económicas1. Si bien se han recomendado varios insecticidas sistemáticos para combatir las infestaciones de pulgones, el uso frecuente de estos insecticidas plantea preocupaciones sobre la resistencia a los plaguicidas 2,3. Por lo tanto, en términos de manejo ecológico de plagas, los hongos entomopatógenos (EPF) podrían servir como una estrategia de control alternativa adecuada. El EPF es un patógeno de insectos con la capacidad de infectar a los huéspedes al penetrar en sus cutículas, lo que lo convierte en un potente agente para controlar pulgones y otros insectos chupadores de plantas4. Además, la EPF ha demostrado ser una técnica de manejo de plagas factible y sostenible, que ofrece beneficios como el antagonismo entre patógenos de plantas y la promoción del crecimiento de las plantas5.
El EPF puede obtenerse mediante cebos de suelo de insectos o aislado de cadáveres de insectos en el campo 6,7. Sin embargo, antes de seguir utilizando aislados de hongos, es necesario realizar un cribado de la patogenicidad. Se han realizado varios estudios sobre la eficacia de la EPF contra los pulgones, que son plagas importantes de los cultivos que pueden causar daños graves 8,9. Los pulgones de la mostaza, entre varias especies de pulgones, han sido probados para determinar su susceptibilidad a varias cepas de Beauveria spp., Metarhizium spp., Lecanicillium spp., Paecilomyces spp., e incluso Alternaria, que se conoce principalmente como un hongo saprófito y fitopatógeno, pero ha mostrado algunos efectos letales contra los pulgones de la mostaza10,11,12.
Para evaluar la eficacia de la EPF contra los pulgones en condiciones de laboratorio, los bioensayos pueden dividirse en dos partes principales: la cámara de inoculación y la inoculación fúngica. El protocolo actual describe la construcción de una cámara de inoculación, donde los pulgones pueden mantenerse utilizando varios métodos, como una hoja extirpada con un pecíolo envuelto en algodón húmedo, un disco de hoja extirpado con una placa de Petri forrada con papel de filtro humedecido, el mantenimiento directo en plantas en maceta o un disco de hoja extirpado incrustado en agar agua dentro de una placa de Petri o recipiente10. 11,13. Los métodos comunes para la inoculación de hongos incluyen la fumigación de conidios, la inmersión de pulgones en una suspensión de conidios, la inmersión de hojas en una suspensión de conidios y la inoculación de endófitos de plantas11,14,15,16. Si bien existen varios métodos de inoculación, los bioensayos deben simular las condiciones de aplicación en el campo. Por ejemplo, en el caso del método de inmersión foliar12,17, se puede evaluar la eficiencia de la EPF, pero dado que los pulgones infestan las hojas cargadas de hongos, el lado dorsal del pulgón, que es un sitio de penetración preferencial, generalmente no se expone al hongo.
Para evaluar el efecto afidicida de la FEP en condiciones de laboratorio, este protocolo sugiere utilizar el método de hojas separadas descrito por Yokomi y Gottwald18 con algunas modificaciones, seguido de la inoculación de conidios con un microaspersor. Este método mantiene aproximadamente el 100% de humedad en la cámara de bioensayo durante al menos siete días sin requerir reposición adicional de agua18,19. Además, confinar a los pulgones a una superficie asegura su exposición a la fumigación de conidios y facilita las observaciones20. Sin embargo, los pulgones pueden atascarse en la superficie expuesta del agar mientras se mueven dentro de la cámara de inoculación. Además, el registro de datos en el experimento de la placa de Petri con pulgones de la mostaza, que son insectos partenogenéticos, puede ser un desafío debido a su rápido desarrollo y reproducción. Es difícil distinguir entre los adultos inoculados y su progenie sin extirpación. Los detalles de cómo proceder con este paso rara vez se mencionan, y algunos factores inconsistentes, como el área de consumo de hojas, deben optimizarse.
Este protocolo demuestra un sistema estable para el cribado de la virulencia de los aislados de EPF frente a los pulgones de la mostaza, lo que permite la selección de posibles aislados frente a varias especies de pulgones de una extensa biblioteca de EPF. Se pueden identificar pulgones recolectados en el campo y se puede establecer una población de laboratorio suficiente de pulgones de la mostaza para evaluar el efecto afidicida de varios aislados de hongos utilizando una metodología fácil y factible con resultados consistentes. Los pulgones han desarrollado múltiples mecanismos evolutivos en respuesta a las intensas y repetidas presiones antropogénicas en los agroecosistemas, lo que plantea desafíos para la seguridad alimentaria9. Por lo tanto, este método descrito podría extenderse para evaluar posibles aislados de EPF frente a varias especies de pulgones.
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Protocol
NOTA: El diagrama de flujo completo se muestra en la Figura 1.
1. Recolección y mantenimiento del pulgón de la mostaza
- Recolección de pulgones de la mostaza
- Voltee las hojas y verifique visualmente si hay infestación de pulgones de la mostaza en los cultivos crucíferos en el campo.
- Registre la información del sitio de muestreo (es decir, GPS) y la(s) planta(s) huésped(es), y confirme el historial de aplicaciones de insecticidas con los agricultores.
- Use un aspirador de insectos o un pincel fino para pintar (consulte la Tabla de materiales) para recolectar alrededor de 50 pulgones de mostaza en un tubo de centrífuga de 50 ml de cultivos crucíferos en el campo y lleve la muestra al laboratorio dentro de las 3 h.
- Prepare una placa de Petri de mantenimiento temporal con hojas crucíferas extirpadas y papel de filtro infiltrado de agua en la parte inferior.
- Coloque los cinco pulgones en la placa de Petri de mantenimiento temporal a temperatura ambiente (25 ± 2 °C) con una humedad relativa del 70% y fotoperiodo de 12:12 h (claro:oscuro) durante 14 días para confirmar que el pulgón no tiene enemigos naturales antes de seguir criando.
NOTA: Para garantizar que los pulgones recolectados en el campo estén libres de enemigos naturales como avispas parasitoides u hongos entomopatógenos, es crucial confirmar la ausencia de estos organismos antes de continuar con la cría.
- Mantenimiento de pulgones de la mostaza
NOTA: Para mantener los pulgones de la mostaza, use hojas crucíferas sin pesticidas (incluido el biopesticida).- Proporcionar un suministro estable y suficiente de hojas crucíferas (unos 25cm2).
NOTA: Obtenga las hojas de crucíferas en el mercado o cultive las plantas. Antes de la cría masiva a largo plazo de pulgones de la mostaza, se podían probar varios tipos diferentes de crucíferas para encontrar una crucífera adecuada. Una vez fijada la especie de la hoja crucífera, no la cambies. En este estudio se utilizó Komatsuna (Brassica rapa var. perviridis) en etapa de 6-7 hojas (ver Tabla de Materiales). Además, deseche las 2-3 hojas más viejas. - Agregue agua antes de que el papel de filtro en la parte inferior esté completamente seco.
- Observe diariamente la densidad de población de los pulgones de la mostaza. La población debería crecer a 2-3 veces después de 7 días.
- Cuando aumente el número de pulgones, corte las hojas originalmente extirpadas con pulgones de mostaza en 4-6 trozos más pequeños y coloque cada trozo de hoja pequeña con pulgones de mostaza en una placa de Petri con hojas frescas extirpadas y papel de filtro infiltrado en agua.
- Colocar la placa de Petri en una incubadora a 25 °C con un fotoperiodo de 12:12 h (claro:oscuro) y observar diariamente la densidad de población de pulgones de la mostaza.
- Retire las hojas originales extirpadas después de que la mayoría de los pulgones migren a hojas frescas extirpadas antes de que las hojas originales se pudran.
- Proporcionar un suministro estable y suficiente de hojas crucíferas (unos 25cm2).
2. Identificación molecular del pulgón de la mostaza
NOTA: Para confirmar la especie de pulgón de la mostaza recolectado en campo, se realizó la identificación molecular utilizando dos marcadores moleculares: la región amplificada caracterizada por secuencia (SCAR) basada en A05Le diseñada por Lu et al.21, y la región de la subunidad 1 (COI) de la citocromo oxidasa del pulgón de la mostaza del pulgón de la mostaza.
- Extracción de ADN genómico del pulgón de la mostaza
- Recoja aproximadamente 50 pulgones en un tubo de centrífuga de 1,5 ml.
NOTA: Los pulgones utilizados para la identificación molecular deben ser descendientes de un solo pulgón, y también se pueden agrupar varias etapas en el mismo tubo para la extracción de ADN. - Homogeneizar los pulgones con un mortero de pellets y extraer el ADN utilizando el kit de aislamiento de ADN genómico Gene-Spin siguiendo las instrucciones del fabricante (ver Tabla de materiales).
- Eluir el ADN genómico con 50 μL de agua precalentada libre de nucleasas.
- Recoja aproximadamente 50 pulgones en un tubo de centrífuga de 1,5 ml.
- Amplificación por PCR y secuenciación de ADN
- Amplificar las secuencias de ADN diana a partir del ADN genómico de pulgones utilizando la mezcla maestra de PCR (2x) con pares de cebadores A05LeF/A05LeR y LeCO1F/LeCO1R (Tabla 1) con diferentes programas de PCR21.
NOTA: La reacción de PCR con un volumen total de 20 μL se compone de 2 μL de plantilla de ADN genómico de pulgón, 1 μL de cebadores directos y 1 μL inversos, 10 μL de mezcla maestra de PCR (ver Tabla de materiales) y 6 μL ddH2O. - Realizar la PCR en termociclador (ver Tabla de Materiales) con el siguiente programa: 94 °C durante 5 min, 25 ciclos de 94 °C durante 45 s, 61 °C (para A05LeF/A05LeR) y 58 °C (para LeCO1F/LeCO1R) durante 45 s, 72 °C durante 1 min, seguido de una extensión final de 72 °C durante 5 min.
- Analizar el producto de PCR mediante electroforesis en gel de agarosa al 1% para confirmar la identidad del pulgón de la mostaza (Figura 2).
NOTA: Si el par de cebadores A05LeF/A05LeR amplifica con éxito el tamaño correcto del fragmento de ADN, ha identificado de manera convincente el pulgón recolectado en el campo como pulgón mostaza21. Los pares de cebadores se enumeran en la Tabla 2. - Purifique el producto de PCR del amplicón COI del pulgón de la mostaza utilizando un kit de gel/PCR disponible en el mercado siguiendo las instrucciones del fabricante (consulte la Tabla de materiales) y secuencie el producto de PCR utilizando un servicio de secuenciación comercial.
- Amplificar las secuencias de ADN diana a partir del ADN genómico de pulgones utilizando la mezcla maestra de PCR (2x) con pares de cebadores A05LeF/A05LeR y LeCO1F/LeCO1R (Tabla 1) con diferentes programas de PCR21.
- Análisis de secuencias
NOTA: De acuerdo con Lu et al.21, la flexión del ADN de A05Le es un fragmento de ADN específico del pulgón mostaza; por lo tanto, no es necesario secuenciar más el producto de PCR A05Le.- Compruebe la calidad de lectura del software Chromas (consulte la Tabla de materiales) después de obtener la secuencia de LeCO1.
- Recorte las lecturas de baja calidad ascendentes y descendentes abriendo un archivo fasta (o txt) y eliminando directamente las lecturas de baja calidad.
- Envíe la secuencia recortada a NCBI web BLAST (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) utilizando los parámetros predeterminados.
NOTA: Si los tamaños de amplicón de los conjuntos de cebadores A05Le y LeCO1 son correctos, teóricamente, la búsqueda de blastos de secuencia en las bases de datos estándar del NCBI debe coincidir con el pulgón mostaza.
3. Preparación de hongos entomopatógenos
NOTA: El EPF utilizado en este estudio se muestra en la Tabla 1.
- Recuperación de EPF a partir de una biblioteca fúngica
- Descongelar el stock de hongos conservados (conidios suspendidos en glicerina al 30%) del congelador a -80 °C.
- Transfiera una pequeña cantidad (aproximadamente 10 μL) de la suspensión de conidios a una placa de agar dextrosa Sabouraud (SDA) de 6 cm 1/4 (0,75 g de caldo de dextrosa Sabouraud con 1,5 g de agar por cada 100 ml ddH2O) y extiéndalo uniformemente utilizando un esparcidor celular en una campana de flujo laminar.
- Selle la placa de Petri con una película de parafina e incube en la oscuridad a 25 °C durante 10-14 días.
- Vuelva a cultivar los aislados de hongos rayando la masa fúngica en una placa de 1/4 de SDA e incubando los hongos en la oscuridad a 25 °C durante 10-14 días antes de cosechar los conidios22.
NOTA: El cultivo de hongos debe usarse aproximadamente 10 días antes de inocular los pulgones. No se recomienda el uso de cultivos de EPF de más de 14 días de antigüedad en la prueba de virulencia.
- Preparación de suspensión de conidios
- Raspe los conidios del cultivo de hongos de 10-14 días de edad en una placa de 1/4 de SDA inoculando el asa después de agregar 2-3 mL 0.03% Tween 80 (ver Tabla de Materiales).
- Recoja la suspensión de hongos en un tubo de centrífuga.
- Agite la solución a la velocidad más alta, cuente el número de conidios con un hemocitómetro bajo un microscopio óptico y ajuste la concentración de la suspensión de conidios a 108 conidios/ml.
- Transfiera la suspensión de conidios a un microrociador esterilizado por UV.
NOTA: Vuelva a colocar en vórtice la suspensión de los conidios antes de transferirla, ya que los conidios son propensos a precipitar. El micropulverizador debe exponerse a la radiación ultravioleta en una campana de flujo laminar durante 30 minutos antes de su uso.
4. Detección de virulencia contra el pulgón de la mostaza
- Preparación de adultos recién emergidos
- Mueva a los adultos ápteros (sin alas) y alados (alados) de la placa de Petri de cría a las hojas recién extirpadas para reproducir nuevas progenies de la misma edad. Retirar los adultos después de 24 h para evitar el hacinamiento y minimizar la producción de progenies aladas23,24. Solo se utilizarán adultos ápteros en experimentos posteriores.
- Cría progenies hasta la etapa adulta y elimina las progenies que no se desarrollan en la etapa adulta después de 48 h (Figura 3) para evitar la variación de edad entre pulgones para el experimento. Además, elimine a los adultos alados.
- Preparación de la cámara de inoculación
NOTA: Se recomienda preparar primero hojas crucíferas de 9 cm de diámetro, para que el disco de la hoja pueda incrustarse en el agar agua antes de la solidificación.- Limpie las hojas crucíferas con agua del grifo, elimine la suciedad y los residuos, y cualquier otro artrópodo si está presente.
- Limpie el exceso de agua con una toalla de papel y verifique si hay otros artrópodos en la superficie de las hojas crucíferas con un microscopio estereoscópico. Retira los artrópodos que estén presentes.
- Corta un disco de hoja de 9 cm de diámetro, ya sea presionando directamente la placa de Petri inferior sobre la hoja como un molde o usando unas tijeras.
NOTA: Si las hojas tienen menos de 9 cm de diámetro, combine un par de hojas extirpadas. - Prepare agar agua al 1,5% para cada placa de Petri calentando y disolviendo 450 mg de agar (ver Tabla de Materiales) en 30 mL ddH2O usando microondas.
NOTA: La cantidad de agar agua al 1,5% se puede ajustar en función de la escala del experimento. - Vierta 30 ml de agar agua al 1,5% en la placa de Petri de 9 cm antes de la solidificación en la campana de flujo laminar, y luego espere a que el agar se enfríe a ~ 40 °C hasta que la superficie del agar esté semisolidificada.
NOTA: Compruebe si la superficie está semisolidificada agitando suavemente la placa de Petri horizontalmente. - Coloque el disco de la hoja, con la superficie abaxial hacia arriba, encima del agar agua, incrustando el disco de la hoja en el agar.
NOTA: Minimice la exposición de la superficie del agar. - Después de que el agar agua se haya solidificado por completo, cierre la tapa de la placa de Petri.
NOTA: Abra la tapa para que el agua se vaporice si se condensan muchas gotas en la cubierta inmediatamente. - Coloque 20 adultos ápteros en el disco de la hoja.
NOTA: Se recomienda operar bajo un microscopio estereoscópico para evitar daños en sus piezas bucales.
- Inoculación y observación de EPF
- Abra la tapa de la cámara de inoculación y rocíe 0,3 ml de suspensión de conidios (a partir del paso 3.2) directamente sobre los pulgones y el disco de la hoja desde unos 15 cm por encima del disco de la hoja.
NOTA: Vuelva a colocar en vórtice la suspensión de conidios antes de rociar. Las áreas de pulverización deben probarse antes del experimento, ya que pueden variar entre los diferentes pulverizadores. En este caso, se recomienda 0,3 ml con una distancia de 15 cm. El área de pulverización debe cubrir todo el disco de la hoja y una capa delgada de suspensión de conidios debe cubrir el disco de la hoja. Si las gotitas convergen en el agua estancada de la hoja, se debe disminuir el volumen de inoculación. Limpie la mesa con etanol al 70% antes de la inoculación y entre el uso de diferentes aislados. - Espere a que la suspensión de conidios se seque y luego cierre la tapa para evitar que los pulgones de la mostaza se ahoguen.
NOTA: Los pulgones rara vez deambulan durante el experimento; Sin embargo, sigue siendo necesario asegurarse de que los pulgones no se escapen. - Sellar la cámara de inoculación con una película de parafina para mantener una humedad relativa elevada y colocar la cámara de inoculación en una incubadora a 25 °C con fotoperiodo 12:12 h (claro:oscuro).
- Abra la tapa de la cámara de inoculación para contar la mortalidad bajo un microscopio estereoscópico cada 12 h durante 5 días.
- Limpie la melaza adherida a la cubierta con una toalla de papel y retire los pulgones recién emergidos con un pincel fino para pintar. Limpie la tapa con agua del grifo cada 24 h.
NOTA: El período de observación puede variar para diferentes especies de pulgones en función de la longevidad adulta. - Mantenga el cadáver en el disco de la hoja para la micosis para confirmar el éxito de la inoculación.
- Abra la tapa de la cámara de inoculación y rocíe 0,3 ml de suspensión de conidios (a partir del paso 3.2) directamente sobre los pulgones y el disco de la hoja desde unos 15 cm por encima del disco de la hoja.
- Confirmación de la tasa de germinación de los conidios
NOTA: Este paso es opcional. Confirmar la tasa de germinación de los conidios por pares al realizar el cribado de virulencia para asegurar la actividad de los conidios.- Deje caer una gota de suspensión de conidios de 5 μL en 1/4 SDA para tres repeticiones.
- Después de 18 h, calcule la tasa de germinación con el microscopio óptico. Cuente al menos 100 esporas al azar en una sola gota para confirmar la tasa de germinación de hongos.
NOTA: Normalmente, la tasa de germinación de los aislados utilizados en el experimento debe ser superior al 90%.
5. Bioensayo de aislados seleccionados de EPF
NOTA: Los aislados de EPF que mostraron alta virulencia, que se seleccionaron en el paso 4, se sometieron a un bioensayo contra pulgones de la mostaza utilizando cuatro concentraciones de suspensiones de conidios (que oscilaron entre 104 y 107 conidios/mL).
- Preparación de suspensión de conidios
- Repita el paso 3.1 para recuperar los aislados EPF seleccionados.
- Repita el paso 3.2 para preparar cuatro concentraciones de suspensión de conidios, incluyendo 104, 105,10 6 y 107 conidios/mL.
- Preparación de adultos recién emergidos
- Repita el paso 4.1 para preparar a los adultos recién emergidos.
- Preparación de la cámara de inoculación
- Repita el paso 4.1. para preparar la cámara de inoculación.
- Inoculación y observación de EPF
- Repita el paso 4.3. para realizar la inoculación y observación de EPF con las cuatro concentraciones de suspensión de conidios, respectivamente.
6. Análisis estadístico
- Cálculo de la mortalidad corregida
- Calcule la mortalidad corregida utilizando la fórmula25 de Abbott, como se muestra a continuación:
Mortalidad corregida (%) = [(MT− M C) × 100%] / (100− MC)
MT representa la mortalidad del grupo de tratamiento y MC representa la mortalidad del grupo de control.
NOTA: La mortalidad del grupo control no debe ser superior al 20%. - Abra la plataforma de software SPSS (ver Tabla de Materiales), cree variables que incluyan "tratamiento" y "cor_mor" (que representan la mortalidad corregida) e ingrese los resultados calculados para la inoculación de diferentes aislados en el mismo punto de tiempo con la misma concentración inoculada.
- Seleccione Analizar, Comparar medias y proporciones, Prueba T de muestras independientes en SPSS para un análisis de prueba t independiente.
- En SPSS, introduzca el tratamiento en el cuadro "Variable de agrupación" y cor_mor en "Variable(s) de prueba". Defina grupos por diferentes aislados de hongos. Presione OK para analizar.
- Calcule la mortalidad corregida utilizando la fórmula25 de Abbott, como se muestra a continuación:
- Cálculo de la mediana del tiempo letal (LT 50) y de la mediana de la concentración letal (LC50)
- Abra el SPSS, cree las variables "total", "respuesta" y "duración"/"concentración", e introduzca el resultado registrado en la hoja de cálculo.
- Seleccione Analizar, Regresión, Probit en SPSS para calcular LT 50 y/o LC50.
NOTA: Si la mortalidad acumulada no supera el 50% eventualmente, no se puede estimar LT 50 y/o LC50. - Ingrese el total en el cuadro "Total observado", la respuesta en el cuadro "Frecuencia de respuesta ", la duración/concentración en el cuadro "Covariable(s)". Presione OK para analizar.
NOTA: Por lo general, presione Opciones y establezca el "Nivel de significación para el uso del factor de heterogeneidad" en 0.05.
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Representative Results
El diagrama de flujo presentado ilustra la condición estable de los pulgones de la mostaza desde la recolección en el campo hasta el cribado de virulencia. El mantenimiento de pulgones procedentes de la recolección en campo garantizó un aumento estable de las colonias de pulgones con un suministro adecuado de alimentos. Los pulgones recolectados en el campo se confirmaron como pulgones de la mostaza mediante el uso de marcadores moleculares, incluido el tamaño del amplicón de PCR y la secuenciación de LeCO1. El cribado de virulencia, realizado mediante el método de hojas separadas, reveló una tasa de supervivencia constante para los pulgones de la mostaza, y el grupo de control mostró una tasa de supervivencia del 85% (Figura 4).
Durante el cribado de virulencia, Cc-NCHU-213 demostró la capacidad más rápida para matar pulgones, lo que resultó en una mortalidad del 50% y el 90% a los 3 días y 4,5 días después de la inoculación (d.p.i.), respectivamente (Figura 4). Sin embargo, se observaron diferentes capacidades para matar pulgones entre los cinco aislados de B. bassiana. Bb-NCHU-141, -143 y -153 exhibieron capacidades lentas para matar pulgones, con solo un 5% de mortalidad a los 3 d.p.i., incluso cuando se excluyeron los efectos de la fumigación con 0,03% de Tween 80 u otros factores letales (Figura 4). Por lo tanto, se empleó la fórmula de mortalidad corregida para normalizar la mortalidad de control. La mayoría de los aislados de EPF contra pulgones de la mostaza exhibieron tasas de mortalidad corregidas superiores al 70% dentro de los 5 d.p.i., excepto Pl-NCHU-152 (Tabla 3). Entre estos aislados de EPF, Bb-NCHU-286 demostró la tasa de mortalidad más alta del 100% (Tabla 3). Además, se observó micosis de EPF en cadáveres de pulgones de la mostaza infectados con Metarhizium spp., Beauveria spp., Purpureocillium lilacinum y Cordyceps cateniannulata durante el tamizaje de virulencia, lo que indica la efectividad de este sistema (Figura 5).
Sobre la base de los resultados del cribado de virulencia, se seleccionaron dos aislados de EPF, a saber, Mb-NCHU-197 y Cc-NCHU-213, que presentaban una rápida actividad de muerte de insectos (40% y 50% de mortalidad a 3 d.p.i., respectivamente), para el bioensayo contra pulgones de la mostaza. Los resultados demostraron mortalidades corregidas significativamente diferentes para Mb-NCHU-197 y Cc-NCHU-213 a los 3 y 4 d.p.i. con una inoculación de 107 conidios/mL (Figura 6). En el ensayo LT50, el tratamiento con 107 conidios/ml de Cc-NCHU-213 mostró una duración significativamente más corta en comparación con otros tratamientos (Tabla 4). Además, el valor de CL50 de Cc-NCHU-213 (9,32 × 104) fue menor que el de Mb-NCHU-213 (2,30 × 10 5), lo que indica que Cc-NCHU-213 posee mayor virulencia contra pulgones de la mostaza (Tabla 5).
Figura 1: Diagrama de flujo experimental para el cribado de la virulencia de la EPF contra los pulgones de la mostaza. A) Establecimiento de un sistema de cría de pulgones de la mostaza. b) Preparación del EPF. (C) Inoculación de hongos. D) Análisis estadístico. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Electroforesis del ADN genómico del pulgón de la mostaza amplificado con los juegos de cebadores A05Le y Le CO1. La electroforesis se realizó en un gel de agarosa al 1%. M = escalera de ADN de 100 pb; bp = pares de bases. El asterisco rojo indica la curva objetivo de la amplificación por PCR. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Diferencias entre la ninfa áptera del cuarto estadio y el pulgón mostaza adulto. (A) Ninfa del cuarto estadio. (b) Adulto. Las tibias de las patas traseras de la ninfa del cuarto estadio son blanquecinas (marcadas con una flecha roja). Los pulgones recién emergidos se eliminaron con un cepillo fino de camello durante las pruebas de virulencia. Barra de escala = 1 mm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Mapa de calor de mortalidad de 13 aislados de EPF contra pulgones de la mostaza mediante el método de hojas separadas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Observación de micosis fúngica de 13 aislados de EPF. Mepe-NCHU-2 = Metarhizium pemphigi; Mp-NCHU-11 = Metarhizium pinghaense; Mb = Metarhizium baoshanense; Cc = Cordyceps cateniannulata; Ba = Beauveria australis; Bb = Beauveriabassiana; Pl = Purpureocillium lilacinum. Barra de escala = 1 mm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6: Mortalidad corregida de los aislados fúngicos Mb-NCHU-197 y Cc-NCHU-213 frente al pulgón de la mostaza. Las barras de error representan la desviación estándar (DE). Las mortalidades de Mb-NCHU-197 y Cc-NCHU-213 en el mismo punto de tiempo con la misma concentración inoculada se compararon mediante una prueba t independiente, y se encontró que las mortalidades marcadas con un asterisco fueron significativamente diferentes (p < 0,05). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Aislar | Especie | Host o fuente* | Ubicación |
| MP-NCHU-2 | Metarhizium pemphigi | suelo | Yilan |
| ML-NCHU-9 | Metarhizium lepidiotae | suelo | Yilan |
| MP-NCHU-11 | Metarhizium pinghaense | suelo | Yilan |
| Ba-NCHU-113 | Beauveria australis | suelo | Taichung |
| Bb-NCHU-141 | Beauveria bassiana | Hypothenemus hampei | Chiayi |
| Bb-NCHU-143 | Beauveria bassiana | Hypothenemus hampei | Chiayi |
| PL-NCHU-152 | Purpureocillium lilacinum | Tessaratoma papilosa | Chiayi |
| Bb-NCHU-153 | Beauveria bassiana | Rhynchophorus ferrugineus | Chunghua |
| Bb-NCHU-157 | Beauveria bassiana | Rhynchophorus ferrugineus | Chunghua |
| MB-NCHU-196 | Metarhizium baoshanense | suelo | Taichung |
| MB-NCHU-197 | Metarhizium baoshanense | suelo | Taichung |
| CC-NCHU-213 | Cordyceps cateniannulata | suelo | Taichung |
| Bb-NCHU-286 | Beauveria bassiana | Cerambycidae | Taichung |
Tabla 1: Aislamientos de EPF utilizados en este estudio.
| Nombre del cebador | Secuencia (5' - 3') | Tamaño del producto (pb) | Referencia | |
| A05Le | F-GGGTCTTGGATGGTGTGTG | 953 | Lu et al. [21] | |
| R-AGGGGTCTTGTCGCCATTTT | ||||
| LeCO1 | F-CTTTTCCCATGATCAATTTT | 593 | Este estudio | |
| R-ACGTAGTGGAAATGAGCAAC | ||||
Tabla 2: Pares de cebadores utilizados para la identificación molecular de pulgones de la mostaza.
| Aislar | Especie | Mortalidad corregida (%) |
| MP-NCHU-2 | Metarhizium pemphigi | 76.47 |
| ML-NCHU-9 | Metarhizium lepidiotae | 82.35 |
| MP-NCHU-11 | Metarhizium pinghaense | 76.47 |
| Ba-NCHU-113 | Beauveria australis | 82.35 |
| Bb-NCHU-141 | Beauveria bassiana | 88.24 |
| Bb-NCHU-143 | Beauveria bassiana | 88.24 |
| PL-NCHU-152 | Purpureocillium lilacinum | 35.29 |
| Bb-NCHU-153 | Beauveria bassiana | 82.35 |
| Bb-NCHU-157 | Beauveria bassiana | 88.24 |
| MB-NCHU-196 | Metarhizium baoshanense | 76.47 |
| MB-NCHU-197 | Metarhizium baoshanense | 88.24 |
| CC-NCHU-213 | Cordyceps cateniannulata | 94.12 |
| Bb-NCHU-286 | Beauveria bassiana | 100.00 |
Tabla 3: Tasas de mortalidad corregidas de 13 aislados de EPF contra pulgones de la mostaza a los 5 días después de la inoculación (d.p.i.).
| Aislar | Especie | Conc. (conidios/mL) | N* | LT50 (días)† | Límites de confianza del 95 % | Pendiente (SE) | X2 (df)‡ |
| MB-NCHU-197 | Metarhizium baoshanense | 104 | 60 | 3.816 A | 3.61–4.05 | 0.60 (0.05) | 15.64 (28) |
| 105 | 60 | 3.112 bd | 2.95–3.28 | 0.72 (0.05) | 14.61 (28) | ||
| 106 | 60 | 2.908 b | 2.76–3.06 | 0.85 (0.06) | 15.04 (28) | ||
| 107 | 60 | 2.549 C | 2.40–2.69 | 0.90 (0.06) | 24.31 (28) | ||
| CC-NCHU-213 | Cordyceps cateniannulata | 104 | 60 | 3.948 A | 3.71–4.23 | 0.53 (0.05) | 8.81 (28) |
| 105 | 60 | 3.237 d | 3.07–3.41 | 0.72 (0.05) | 22.86 (28) | ||
| 106 | 60 | 2.414 C | 2.28–2.54 | 1.08 (0.07) | 28.30 (28) | ||
| 107 | 60 | 2.132 e | 2.02–2.25 | 1.41 (0.10) | 28.96 (28) | ||
| *Número de insectos observados. | |||||||
| Los valores de †LT50 marcados con letras diferentes se consideraron significativamente diferentes, ya que sus límites de confianza del 95% no se superponían. | |||||||
| ‡X2, valor de Chi-cuadrado en la prueba de bondad de ajuste de Pearson; DF, grados de libertad | |||||||
Tabla 4: Valores de LT50 de los aislados fúngicos Mb-NCHU-197 y Cc-NCHU-213 frente a pulgones de la mostaza bajo diferentes concentraciones de conidios. *Número de insectos observados. †Los valores de LT50 marcados con letras diferentes se consideraron significativamente diferentes, ya que sus límites de confianza del 95% no se superponían. ‡X2, valor de Chi-cuadrado en la prueba de bondad de ajuste de Pearson; df: grados de libertad.
| Aislar | Especie | N* | CL50 (conidios/ml)† | Límites de confianza del 95 % | Slpoe (SE) | X2 (df)‡ |
| MB-NCHU-197 | Metarhizium baoshanense | 240 | 2.30 × 105 a | 8,63 × 104–5,70 × 105 | 0.43 (0.08) | 10.14 (10) |
| CC-NCHU-213 | Cordyceps cateniannulata | 240 | 9.32 × 104 a | 4,97 × 104–1,62 × 105 | 0.76 (0.09) | 4.33 (10) |
| *Número de insectos observados. | ||||||
| †Los valores de CL50 marcados con letras diferentes se consideraron significativamente diferentes, ya que sus límites de confianza del 95% no se superponían. | ||||||
| ‡X2, valor de Chi-cuadrado en la prueba de bondad de ajuste de Pearson; DF, grados de libertad | ||||||
Tabla 5: Valores de CL50 de los aislados fúngicos Mb-NCHU-197 y Cc-NCHU-213 contra pulgones de la mostaza. *Número de insectos observados. Los valores de †LC50 marcados con letras diferentes se consideraron significativamente diferentes, ya que sus límites de confianza del 95% no se superponían. ‡X2, valor de Chi-cuadrado en la prueba de bondad de ajuste de Pearson; df: grados de libertad.
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Discussion
Las crucíferas, un grupo de hortalizas, suelen estar infestadas por múltiples especies de pulgones, como el pulgón de la mostaza (L. erysimi) y el pulgón de la col (Brevicoryne brassicae)26. Ambas especies han sido reportadas en Taiwán27, y es posible que coexistan en el sitio de recolección. Para distinguir especies de pulgones estrechamente relacionadas, este estudio empleó una técnica de identificación molecular utilizando un juego de cebadores multiplex21. Mediante el diseño de un marcador molecular a partir del fragmento del gen COI del pulgón de la mostaza, identificamos con éxito el pulgón de la mostaza, confirmando así la fiabilidad del marcador molecular A05Le para este propósito21.
Las observaciones revelaron que distinguir entre las ninfas ápteras del cuarto estadio y los pulgones adultos de la mostaza basándose únicamente en su tamaño o morfología es un desafío sin experiencia. Sin embargo, una característica distintiva crucial es la tibia de las patas traseras, que aparece blanca en las ninfas del cuarto estadio, pero no en los adultos (Figura 3). Estudios previos sobre L. attenuatum, B. bassiana contra pulgones del algodón y M. brunneum contra pulgones verdes del durazno han demostrado que la muda puede ser una estrategia para evitar la infección28,29,30. Por lo tanto, la identificación errónea de los estadios de los pulgones puede dar lugar a errores en la evaluación de la virulencia, ya que la muda puede afectar a la eficacia de la FPE28,29,31. Para abordar este problema y garantizar una mayor exactitud y precisión en la evaluación de la virulencia, excluya los pulgones con porciones blanquecinas en las tibias de las patas traseras que no hayan alcanzado la etapa adulta a menos que se utilicen intencionadamente ninfas de pulgones. Estos pulgones no maduran completamente y pueden sufrir muda, lo que podría permitirles escapar del proceso de infección de EPF. Además, se recomienda un curso de tiempo de observación y registro de datos cada 12 h. El intervalo de 12 h es preferible para demostrar las diferencias entre múltiples aislados prometedores con capacidades similares de eliminación de pulgones y facilita el cálculo preciso de LT50. Sin embargo, el intervalo de tiempo puede ajustarse en función de los diferentes ciclos de vida de otras especies de insectos o determinarse mediante una prueba previa a pequeña escala.
Aunque el método de hojas separadas puede dejar una melaza mínima en el disco de la hoja, la mayor parte de la melaza se adhiere a la cubierta de la placa de Petri ya que el disco de la hoja está muy cerca. Es posible que se limpie o se lave durante el período de observación. Sin embargo, la melaza está indudablemente presente en el entorno práctico del cultivo de cultivos cuando los pulgones invaden32. La melaza presente en la cámara de inoculación puede simular de alguna manera la situación cuando el EPF se inocula en pulgones en el campo. Las cutículas de los pulgones contienen principalmente melaza, que sirve como fuente de nutrientes para el hongo y puede estimular la germinación de EPF16. Por lo tanto, la combinación de la aplicación de EPF y la producción de melaza por pulgones puede ser ventajosa.
Para confirmar que la muerte del pulgón se debe a una infección, los cadáveres generalmente se transfieren de la cámara de inoculación de EPF a papel de filtro húmedo o a un medio de cultivo para observar el crecimiento fúngico 11,14,33,34. Sin embargo, en este estudio, se utilizó agar agua en la cámara de inoculación para mantener una alta humedad, lo que permitió que los cadáveres de pulgones permanecieran en las hojas sin necesidad de moverlos para la observación del crecimiento fúngico. Aunque el método de la hoja separada proporciona información sobre el efecto afidicida de los aislados de EPF, todavía tiene limitaciones. El agar agua utilizado para mantener la condición del disco de la hoja puede hacer que los pulgones se atasquen mientras se mueven en la cámara de inoculación. Para abordar este problema, el porcentaje de agar agua se incrementó al 3%, proporcionando una superficie lo suficientemente firme como para que los pulgones rusos del trigo (Diuraphis noxia) caminaran sobre20. En este experimento, los pulgones de la mostaza fueron capaces de moverse cómodamente en superficies de agar agua con concentraciones que oscilaban entre el 1,5% y el 3%. Sin embargo, a medida que avanzaba el período de observación, algunos pulgones se quedaron atascados boca abajo con las patas hacia arriba y tuvieron que ser rescatados de nuevo al disco de la hoja. Esto puede deberse a las diferencias en el tamaño o la movilidad del pulgón, lo que indica que el aumento de la concentración de agar por sí solo puede no resolver el problema. Por lo tanto, asegúrese de que el disco de la hoja cubra completamente la superficie del agar utilizando una hoja que se ajuste mejor al tamaño de la placa de Petri, lo que puede ayudar a aliviar este problema. En comparación con el método de hojas separadas descrito por Yokomi y Gottwald18, este estudio ha mejorado en un aspecto mediante el uso de un tamaño de hoja que es aproximadamente un buen ajuste para la placa de Petri. Esto permite la cuantificación relativa del consumo de alimentos y minimiza la superficie expuesta del agar. Además, la hoja debe estar "incrustada" en el agar agua semisolidificada, mientras que en la referencia original, se describía como "colocada" en el agar agua18. Incrustar el disco de la hoja en el agar agua reduce la probabilidad de que los pulgones se adhieran a la superficie del agar y facilita la observación, ya que los pulgones están confinados a un lado.
Este protocolo proporciona instrucciones detalladas sobre cómo proceder con el método de hojas separadas y la inoculación de EPF, junto con algunas modificaciones que han facilitado las operaciones, las observaciones y los resultados consistentes. También establece un método estandarizado para seleccionar aislados de EPF contra plagas chupadoras de plantas en condiciones de laboratorio. Además, se puede realizar una comprobación estándar con productos eficaces conocidos o disponibles comercialmente para la futura comercialización de aislados de EPF.
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Disclosures
Los autores declaran que no existe ningún conflicto de intereses en este trabajo.
Acknowledgments
Esta investigación fue apoyada por 109-2313-B-005-048-MY3 del Ministerio de Ciencia y Tecnología (MOST).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 μL Inoculating Loop | NEST Scientific | 718201 | |
| 100 bp DNA Ladder III | Geneaid | DL007 | |
| 2x SuperRed PCR Master Mix | Biotools | TE-SR01 | |
| 50 mL centrifuge tube | Bioman Scientific | ET5050-12 | |
| 6 cm Petri dish | Alpha Plus Scientific | 16021 | |
| 6 mm insect aspirator | MegaView Science | BA6001 | |
| 70 mm filter paper NO.1 | Toyo Roshi Kaisha | ||
| 70% ethanol | |||
| 9 cm Petri dish | Alpha Plus Scientific | 16001 | |
| Agar | Bioman Scientific | AGR001.1 | Microbiology grade |
| Agarose | Bioman Scientific | PB1200 | |
| BioGreen Safe DNA Gel Buffer | Bioman Scientific | SDB001T | |
| Chromas | Technelysium | ||
| GeneDoc | |||
| GenepHlow Gel/PCR Kit | Geneaid | DFH300 | https://www.geneaid.com/data/files/1605861013102532959.pdf |
| Gene-Spin Genomic DNA Isolation Kit | Protech Technology | PT-GD112-V3 | http://www.protech-bio.com/UserFiles/file/Gene-Spin%20Genomic%20DNA%20Kit.pdf |
| Hemocytometer | Paul Marienfeld | 640030 | |
| Komatsuna leaves (Brassica rapa var. perviridis) | Tai Cheng Farm | 1-010-300410 | |
| Microsprayer | |||
| MiniAmp Thermal Cycler | Thermo Fisher Scientific | A37834 | |
| Mustard aphid (Lipaphis erysimi) | |||
| Painting brush | Tian Cheng brush company | 4716608400352 | |
| Parafilm M | Bemis | PM-996 | |
| Pellet pestle | Bioman Scientific | GT100R | |
| Sabouraud Dextrose Broth | HiMedia | MH033-500G | |
| SPSS Statistics | IBM | ||
| TAE buffer 50x | Bioman Scientific | TAE501000 | |
| Tween 80 | PanReac AppliChem | 142050.1661 |
References
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