Summary
هنا ، نصف أداة متقدمة مصممة لمراقبة التخليق الحيوي للكلوروفيل خلال المراحل المبكرة من إزالة الشتلات من أرابيدوبسيس . توفر المنهجية الجديدة تصويرا غير جراحي مضان الكلوروفيل في الوقت الفعلي بدقة مكانية وزمانية عالية.
Abstract
التخليق الحيوي للكلوروفيل هو السمة المميزة لإزالة الاتساق ، وهي واحدة من أكثر المراحل دراماتيكية في دورة حياة النبات. يتم تشغيل عملية التخليق الحيوي للكلوروفيل التي يتم التحكم فيها بإحكام وديناميكية للغاية أثناء التحول من الظلام إلى الضوء في النباتات المزهرة. في الوقت الذي تتعرض فيه الشتلات المعزولة للآثار الأولى لأشعة الشمس ، يتم التحويل السريع (بترتيب ثوان) للبروتوكلوروفيليد إلى الكلوروفيليد بواسطة مجمعات بروتينية فريدة تقبل الضوء ، مما يؤدي عبر خطوات التمثيل الغذائي اللاحقة إلى إنتاج الكلوروفيل الذي يعمل بكامل طاقته. تشمل التقنيات القياسية لتحليل محتوى الكلوروفيل استخراج الصباغ من الأنسجة النباتية المنفصلة ، والتي لا تنطبق على دراسة مثل هذه العمليات السريعة. للتحقيق في حركية الكلوروفيل في الجسم الحي بدقة عالية ودقة مكانية زمانية في الساعات الأولى بعد إزالة العدوى المستحثة بالضوء ، تم تطوير أداة وبروتوكول. نقدم هنا إجراء مفصلا مصمما للقياس الكمي القوي إحصائيا للكلوروفيل في المراحل المبكرة من إزالة الأرابيدوبسيس .
Introduction
يمثل إزالة الاتباع المرحلة الأكثر دراماتيكية في دورة حياة النبات ، والتي تتميز بعدد من التغيرات المورفولوجية وإعادة الترتيب الكامل لعملية التمثيل الغذائي للنبات (من غير متجانس إلى استواء ذاتي)1. التخليق الحيوي للكلوروفيل هو السمة المميزة لإزالة التلوث الناجم عن الضوء في النباتات وعملية ديناميكية للغاية. يجب تنسيق تكوين الكلوروفيل من السلائف الأولية المنتجة بشكل داكن لتجنب الضرر الناجم عن المنتجات الثانوية التفاعلية2. يتم تحفيز اختزال البروتوكلوروفيليد إلى الكلوروفيليد بواسطة مؤكسدات البروتوكلوروفيليد المعتمدة على الضوء (PORs) ، وهي إنزيمات فريدة يتم تنشيطها مباشرة بواسطة الضوء. التفاعل سريع جدا ، يحدث بترتيب ms إلى s3 ، مما يؤدي إلى تراكم الكلوروفيل بشكل ملحوظ في غضون دقائق بعد تشعيع الشتلات4،5،6. مطلوب مزيد من الوقت (من ساعات إلى أيام) للتكوين الحيوي للبلاستيدات الخضراء لإنشاء جهاز التمثيل الضوئي يعمل بكامل طاقته3.
توجد طرق مختلفة لتحليل محتوى الكلوروفيل ، بما في ذلك الكروماتوغرافيا السائلة عالية الأداء (HPLC) أو القياس الطيفي. عادة ، تتطلب هذه التقنيات تدمير الأنسجة النباتية4،5،6 ، مما يقيد تحديد التغيرات في مستويات الكلوروفيل بمرور الوقت. قد تفتح الطرق التي تسمح بإنشاء حركية الكلوروفيل غير الغازية منظورا جديدا تماما لدراسة النباتات في جوانب متنوعة تتراوح من أسئلة البحث الأساسية ، مثل تحليل عملية تخليق الكلوروفيل في الزمان والمكان ، إلى تطبيقات أكثر عملية ، مثل تقييم تحمل الإجهاد أو تأثير المنشطات الحيوية على حركية الكلوروفيل. بالنظر إلى ذلك ، قدمنا نظاما لمراقبة تكوين الكلوروفيل ، iReenCAM7. وهو يشتمل على كاميرا CCD ، ومرشحات الانبعاثات ، ومصادر الضوء ، وخط أنابيب لتحليل التألق الآلي (الشكل 1). الميزة الرئيسية للجهاز المطور هي الدقة المكانية والزمانية العالية ، والتفوق في المعلمات المستخدمة في الأساليب الحالية ، والحساسية والنوعية الكافية عند مقارنتها بالطرق التحليلية القياسية7.
يتطلب الإجراء غير الجراحي الموصوف هنا الحد الأدنى من الكواشف ويتضمن خطوات بسيطة ، مما يسمح بالحصول على ملف حركي الكلوروفيل في شتلات أرابيدوبسيس الحية خلال المراحل المبكرة جدا من إزالة الالتهاب. يمكن أن يكون البروتوكول مفيدا لدراسة العملية الديناميكية للغاية لتخليق الكلوروفيل المتأثرة بعدد من العوامل ، سواء الخارجية (الملح ، الجفاف ، المنشطات الحيوية ، المعادن الثقيلة ، إلخ) والداخلية (المرتبطة عادة بالتغيرات في نشاط الجينات) في الأصل دون الحاجة إلى فصل أي نسيج نباتي ، وبالتالي تجنب الإجهاد الإضافي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. إعداد المتوسطة
- تحضير وسط الزراعة عن طريق خلط 0.75 جم من عامل التبلور مع 50 مل من الماء منزوع الأيونات المعقم في زجاجة زجاجية لتحقيق تركيز 1.5٪ (وزن / حجم) للوحة بتري واحدة (120 × 120 × 17 مم). هز الخليط برفق ثم سخنه في الميكروويف حتى الغليان لإذابة عامل التبلور (يصبح المحلول واضحا).
- اترك الوسط يبرد إلى 58-60 درجة مئوية قبل المتابعة إلى الخطوات التالية. يجب تنفيذ جميع الخطوات اللاحقة في ظل ظروف معقمة داخل غطاء التدفق الصفحي لمنع التلوث.
- استخدم ألواح بتري ذات الحواف الضيقة للضوء لتجنب انعكاس الضوء الأكتيني المفرط والتألق الذاتي العالي للخلفية أثناء القياسات. لهذا ، ضع شريطا لاصقا أسود (أو أي وسيلة أخرى متاحة) لتغطية جميع جوانب لوحة بتري الفارغة (الشكل 2).
- قم بإجراء تعقيم اللوحة (اللوحات) بعد تطبيق الشريط عن طريق التشعيع باستخدام مصباح الأشعة فوق البنفسجية المبيد للجراثيم لمدة 20-30 دقيقة.
- إذا كانت التجربة تتضمن معالجة كيميائية (أي الضغوطات اللاأحيائية / الحيوية ، والهرمونات النباتية و / أو منظمات النمو ، وما إلى ذلك) ، أضف الكمية المناسبة من المادة الكيميائية المقابلة مباشرة إلى الوسط. كن على دراية بالاستقرار الكيميائي المختار الذي يتم إضافته إلى الوسائط (على سبيل المثال ، إذا كانت المادة الكيميائية غير قابلة للحرارة ، فقم بإضافتها إلى الوسط عندما يتم تبريدها مباشرة قبل صبها في اللوحة). امزج الوسط جيدا عن طريق الهز لضمان التوزيع المتساوي للمادة الكيميائية.
- تجنب إضاءة الألواح للأشعة فوق البنفسجية بعد سكب الوسائط (قد يؤدي إلى إنتاج الأكسجين الجذري الذي قد يتداخل مع التجربة).
- صب الوسط المحضر في لوحة (لوحات) بتري المربعة واترك الوسط يتجمد في درجة حرارة الغرفة.
2. تعقيم سطح البذور وظروف نمو النبات
- احصل على الكمية المطلوبة من بذور Arabidopsis thaliana Col-0 من مخزون الساق (10-20 مجم) وأضفه إلى أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 2 مل.
ملاحظة: لا توجد تعديلات محددة ضرورية أثناء العمل مع خطوط أرابيدوبسيس المختلفة (النمط البيئي / خطوط الطافرة). يجب إجراء مراجعة لشبكة النشر وخطوات القياس للأنواع النباتية الأخرى مع مراعاة الاختلاف في حجم البذور ومعدل الإنبات وحجم الشتلات. - تعقيم بذور أرابيدوبسيس السطحية بإضافة 70٪ إيثانول إلى الأنبوب لمدة 2 دقيقة. هز الأنابيب برفق أثناء التعقيم.
- قم بإزالة الإيثانول عن طريق السحب بعناية ، مع الحرص على عدم فقد أي بذور. اغسل البذور بإضافة الماء المعقم إلى الأنبوب لمدة 5 دقائق لإزالة أي إيثانول متبقي (هز الأنابيب برفق أثناء فترة الغسيل).
- دع البذور تتسرب إلى قاع الأنبوب عن طريق الجاذبية ، وقم بإزالة الماء المتبقي.
- اشطف البذور مرة أخرى 2x بالماء المعقم كما هو موضح في الخطوة 2.3 للتأكد من خلوها من أي سمات الإيثانول. دع البذور تتسرب إلى قاع الأنبوب عن طريق الجاذبية ، وقم بإزالة الماء المتبقي.
- أضف كمية متساوية من الماء المعقم إلى الأنبوب الذي يحتوي على البذور لإنشاء تعليق ماء البذور.
- استخدم شبكة بذر لتوزيع معلق ماء البذور بالتساوي للنمط الوراثي المعطى على المناطق المختارة من الصفيحة المتوسطة (الشكل 2 والشكل التكميلي 1). توزيع البذور (حوالي 30-40) على التوالي في كل منطقة باستخدام طرف ماصة واسعة.
- اترك الماء يجف في مناطق البذور لمدة 30 دقيقة تقريبا ، مع إبقاء اللوحة (الأطباق) مفتوحة في غطاء تدفق رقائقي لمنع التلوث. أغلق اللوحة بشريط micropore ولفها بورق الألمنيوم.
- قم بتقسيم البذور إلى طبقات لمدة 3 أيام عند 4 درجات مئوية في الظلام (اعتمادا على النمط البيئي المستخدم) للتغلب على سكون البذور و / أو لتعزيز الإنبات المنتظم.
- انقل اللوحة ذات البذور الطبقية إلى الضوء الأبيض (150 ميكرومول / م2 / ثانية) لمدة 1 ساعة للحث على الإنبات (قم بفك ورق القصدير فقط للمعالجة بالضوء).
- بعد المعالجة بالضوء ، لف الطبق بورق الألمنيوم لحماية البذور من الضوء ووضعها في وضع عمودي في غرفة النمو وزرعها لمدة 4 أيام في الظلام عند 21 درجة مئوية.
3. قياس وتحليل مضان الكلوروفيل
- قم بتشغيل نظام iReenCAM وتأكد من أن النظام جاهز ومهيأ بشكل صحيح في برنامج خادم PS الذي يتم تشغيله تلقائيا (على سبيل المثال ، إذا كانت هناك مساحة تخزين كافية لبيانات التجربة ، إذا كانت الكاميرا الفلورية متصلة بجهاز الكمبيوتر ، وما إلى ذلك).
- قم بتنشيط برنامج المجدول لإنشاء الخطة التجريبية للقياس بالنقر فوق التجارب > تجربة جديدة. أدخل اسما وصفيا للتجربة واملأ التفاصيل (الوصف).
- اضبط الإجراءات المطلوبة للتجربة بالنقر فوق إضافة إجراء سيؤدي إلى جدول الإجراءات التجريبية.
ملاحظة: تعني كلمة إجراء هنا إجراء تجربة كاملة (أي بما في ذلك جميع الخطوات اللازمة لإجراء قياس لوحة واحدة). - حدد شروط قياس جولة واحدة (أي طول فترة الضوء / الظلام).
- بالنقر فوق إنشاء قائمة ، حدد الفترات الزمنية بين جولات القياس. اختر الوقت الذي ستبدأ فيه الجولة وتنتهي (4 ساعات في المجموع) والفترات الفاصلة بين الجولات (في الإعداد الحالي جولة واحدة كل 2 دقيقة).
- انقر فوق إنشاء وتأكد من صحة الإطار الزمني والفترات الزمنية بين نبضات الضوء عن طريق التحقق من القائمة التي تم إنشاؤها على الجانب الأيسر من الشاشة.
- اختر بروتوكول القياس (الشكل التكميلي 2). احفظ جميع التعديلات على قاعدة البيانات للرجوع إليها في المستقبل.
- قبل بدء القياس مباشرة ، استخدم ضوءا أخضر منخفض الكثافة (انظر جدول المواد) داخل الغرفة المظلمة واضبط مستوى الرف داخل غرفة القياس أو قم بإجراء خطوات تحضيرية أخرى قبل إزالة الرقاقة من لوحة بتري. ثم أطفئ الضوء وانقل الألواح إلى غرفة القياس في الظلام الدامس.
- قم بإزالة ورق الألمنيوم الذي يغطي صفيحة بتري التي تحتوي على الشتلات البالغة من العمر 4 أيام بعناية. ضع لوحة بتري أفقيا داخل غرفة قياس الجهاز. داخل الغرفة ، قم بتحفيز نبضات الضوء الأكتيني ، وقم بإجراء التصوير وفقا لخطة التجربة (الإجراءات) المحددة في الخطوات 3.1-3.7.
ملاحظة: من الأهمية بمكان تجنب أي إضاءة للألواح بالشتلات المعزولة قبل وضعها في غرفة القياس. يجب إجراء التلاعب باللوحة مع الشتلات etiolated في الغرفة / الغرفة المظلمة (لإعداد تجريبي محتمل ، انظر الشكل التكميلي 3).
4. استخراج البيانات وتحليلها
- بعد الانتهاء من القياس ، افتح التجربة المقابلة في برنامج المحلل.
- لتحليل مضان الشتلات ، قم بإنشاء نوعين من الأقنعة - قناع خشن (صينية) يغطي المنطقة التي توجد بها الشتلات ، وقناع (نبات) دقيق يغطي فقط الأنسجة ذات الأهمية (عادة النبتات).
- قم بإنشاء قناع صينية بالنقر فوق خيار إنشاء نوع درج جديد . قم بتعيين أسماء النمط الجيني المناسبة للمناطق المعنية على صورة اللوحة.
- لتعيين النمط الجيني ، اختر رقم صورة في Round ثم انقر فوق تحميل الصورة في الجزء العلوي من الشاشة. سيتم عرض صورة اللوحة على الشاشة. بالنقر فوق أي من مجموعة الأزرار التي تمثل أدوات رسم أشكال مختلفة (الشكل التكميلي 4) ، أدخل وضع الشكل الجديد الذي يسمح برسم منطقة الاهتمام على صورة اللوحة. اختر المناطق الضرورية (على سبيل المثال ، الأنماط الجينية المختلفة على اللوحة) وقدم تسميتها المناسبة.
- انقر فوق Esc للخروج من وضع الشكل. احفظ قناع الدرج الذي تم إنشاؤه (بعد توفير اسم له) بالنقر فوق تخزين نوع الدرج.
- ارجع خطوة إلى الوراء وقم بتطبيق القناع الذي تم إنشاؤه في الخطوات السابقة عن طريق تحديد اسمه من خيار التغيير حسب نوع الدرج .
- لإنشاء قناع نباتي بدقة عالية ، استخدم الصورة التي تم الحصول عليها بعد 180 دقيقة من القياس (الجولة 91) لتعيين الحد الأدنى لقيمة العتبة لشدة إشارة التألق ، مما يتيح طرح ضوضاء الخلفية. لهذا ، قم بإزالة العلامة من العتبة التلقائية وقم بتعيين عتبة يدوية عند 0 (الشكل التكميلي 4).
- انقر معاينة للتأكد من أن قناع الدرج يغطي كل المساحات الضرورية (الأنماط الجينية) على صورة اللوحة. لهذا اختر الجولة 91 وانقر فوق تحديث المعاينة.
- أدخل قائمة التشغيل بالنقر فوق تشغيل. قم بتشغيل التحليل حصريا للجولة 91 عن طريق وضع علامة فقط على الجولة 91. ثم اختر مسار الإخراج وانقر فوق بدء التحليل.
- بعد الانتهاء من التحليل ، سيتم فتح قائمة "إنهاء" تلقائيا. اختر الجولة المنفذة (ستكون الوحيدة) من التجارب وانقر فوق تبديل المحلل إلى البيانات المحللة لتصدير البيانات لهذه النقطة الزمنية المحددة (الجولة 91).
- قم باستخراج ملف .xsel من الأرشيف المصدر ، حيث يحتوي هذا الملف على معلومات قناع النبات الأساسية بالنقر فوق رمز فتح جزء التصدير .
- أعد فتح التجربة بالنقر فوق رمز فتح جزء التحليل المحلي . أدخل قائمة Mask Builder مرة أخرى ، وانقر فوق تحميل الصورة ، واختر الجولة 1 ثم تحميل من ملف في الزاوية اليمنى العليا من الشاشة وقم بتحميل ملف .xsel المستخرج مسبقا. سيتم عرض صورة اللوحة مع تطبيق قناع الدرج.
- احفظ القناع بالنقر فوق تخزين نوع الدرج وقم بتطبيقه عن طريق تحديد اسمه في خيار التغيير حسب نوع الدرج .
- قم بإنشاء قناع النبات عن طريق ضبط عتبة شدة الإشارة الفلورية. قم بزيادة قيمة العتبة اليدوية حتى يتناسب القناع الذي تم إنشاؤه في قائمة المعاينة تماما مع عائد الاستثمار (على سبيل المثال ، الفلقة) في كل من الأنماط الجينية (الشكل التكميلي 4). تحقق مما إذا كان القناع مناسبا لجميع جولات القياسات عن طريق التمرير خلال الجولات (يجب أن يكون التحقق من موضع القناع المناسب في الجولة 1 و 61 و 121 كافيا) في قائمة المعاينة .
- إجراء التحليل لجميع جولات القياس وتصدير البيانات.
ملاحظة: يتضمن ملف المخرجات قيم مضان الكلوروفيل لنمط وراثي معين لكل نقطة زمنية، مما يمكن من بناء مخططات الاختيار وتسهيل إجراء مزيد من التقييم الإحصائي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
يظهر في الشكل 3 الناتج النموذجي الذي تم الحصول عليه باستخدام الإجراء المطور حديثا في شتلات أرابيدوبسيس منزوعة الرتبة من النوع البري (WT) عمرها 4 أيام ، النمط البيئي Columbia-0 (Col-0). في ظل ظروف التحكم (وسائط MS المكملة ب DMSO) ، يبدأ منحنى التخليق الحيوي للكلوروفيل بانفجار أولي لتخليق الكلوروفيل ، حيث يتم تحويل تجمع البروتوكلورفيليد الذي تم تصنيعه خلال المرحلة scotomorphogenic من النمو ، بسرعة إلى الكلوروفيل بسبب PORs المستحثة بالضوء7،8،9. تستغرق المرحلة الأولية من تراكم الكلوروفيل السريع حوالي 10 دقائق وتليها مرحلة تأخر ، يتم خلالها الوصول إلى الحد الأدنى من البروتوكلوروفيليد الداكن المركب (حوالي 30 دقيقة بعد التشعيع ؛ لمنحنى البروتوكلوروفيليد المقاس HPLC ، انظر7). خلال مرحلة التأخر ، يتم تنظيم جينات التخليق الحيوي للكلوروفيل10 ، مما يؤدي إلى إنتاج بروتوكلوروفيليد مستحث بالضوء. يتم تحويل البروتوكلوروفيليد المركب حديثا على الفور إلى الكلوروفيل ، ويمكن اكتشافه كطور أسي (في حالة WT Col-0 بدءا من حوالي 120 دقيقة بعد التشعيع) ، وينتهي بمرحلة تأخر أخرى عند حوالي 4 ساعات بعد تشعيع الشتلات غير المفصول (الشكل 3). في وجود 6-benzylaminopurine (BAP) ، يمكن اكتشاف الاختلافات الهامة الأولى خلال المرحلة الأسية7 ، مما يشير إلى التأثير السلبي ل BAP على حركية الكلوروفيل في المراحل اللاحقة من التخليق الحيوي للكلوروفيل (في حوالي 2 ساعة بعد بدء الإضاءة بالضوء الأكتيني. الشكل 3).
لمقارنة الظروف و / أو الأنماط الجينية المختلفة ، من الضروري تطبيع البيانات الأولية. نظرا لعدم إمكانية اكتشاف أي كلوروفيل باستخدام HPLC في ظل ظروف مختلفة و / أو أنماط وراثية مختلفة في الشتلات ذات الصلة ، فقد أجرينا التطبيع (F / F0) إلى مستويات مضان T0 (F0) المقاسة للعلاج المقابل و / أو النمط الجيني7. لإثبات أهمية التطبيع ، نقدم كلا من البيانات الخام والبيانات التي تم تسويتها إلى متوسط قيمة مضان الكلوروفيل للتحكم المقاسة عند T0 (F0; الشكل 3 أ والشكل 3 ب ، على التوالي).
الشكل 1: نظرة عامة على قياس بروتوكول الجهاز. مخطط خط أنابيب القياس والتحليل iReenCAM. (أ) تحضير العينة عن طريق بذر البذور المحدد بالشبكة ، والتقسيم الطبقي ، والحث الضوئي للإنبات ، وزراعة صفيحة بتري الموجهة رأسيا في الظلام. (ب) وحدة التحكم للحصول على الصور تلقائيا والقابلة للبرمجة وإدارة البيانات على أساس التنميط الظاهري PlantScreen ينظم صندوق أدوات SW تشغيل النظام بأكمله من خلال التحكم في عملية HW ومزامنتها مع بروتوكول القياس والتحليل المحدد من قبل المستخدم. (ج) تم تصميم بروتوكول القياس للقياسات الديناميكية لصور عينة الفلورسنت في فترات 2 دقيقة لمدة 4 ساعات في المجموع ، أي 120 جولة قياس. الإطار المرئي الزمني للصورة التمثيلية ذات الألوان الزائفة لشتلات Arabidopsis ذات التوجه الرأسي البالغة من العمر 4 أيام والتي تم الحصول عليها في وقت 180 دقيقة تستخدم لتوليد قناع عائد الاستثمار. (د) يتم تطبيق قناع تعريف عائد الاستثمار لنسيج مهم (على سبيل المثال ، النبتة أو hypocotyl أو منطقة الجذر) على الإطار المرئي الزمني ، ويتم إجراء طرح الخلفية ويتم استخراج قيم مضان البكسل بالبكسل لكل عائد استثمار (يحدده قناع النبات) من جميع جولات القياس. أخيرا ، يتم تسوية البيانات الأولية (مضان F) إلى متوسط قيمة مضان عند T0 (F0). قضبان المقياس = 1 سم (أ) و 0.25 سم (ج). تم تعديل الرقم من7. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: وضع البذور. يوضح الشكل وضع بذور أرابيدوبسيس على صفيحة بتري ذات حواف محكمة الإغلاق باستخدام شبكة النشر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: حركية تراكم الكلوروفيل في المراحل المبكرة من إزالة الأرابيدوبسيس . نمت شتلات Etiolated WT Col-0 على وسائط مكملة ب BAP أو DMSO (وهمية). (أ) القيمة المتوسطة ± SD (المنطقة المظللة) ، n = 9 للبيانات الأولية و (B) البيانات الطبيعية إلى متوسط قيمة التألق عند T0 (F0). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل التكميلي 1: شبكة البذر. اليسار: شبكة بذر مع صناديق مستطيلة محددة لوضع بذور كل نمط وراثي في بقعة قياس تقع في منطقة تجانس الضوء الأكتيني (شدة الضوء ≥ 0.7 من شدة الضوء القصوى). على اليمين: تمثيل تخطيطي لشتلات أرابيدوبسيس عمرها 4 أيام نمت للتحليل. توفر شبكة البذر مخططا ممكنا لوضع بذور Arabidopsis لضمان تجانس الضوء وكثافة البذور المناسبة (يمكن استخدام كل فتحة لوضع البذور حيث يتم توحيد حجم الفتحة والمسافة بين الفتحات وتجانس الضوء في منطقة الشبكة). الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.
الشكل التكميلي 2: بروتوكول قياس التألق. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.
الشكل التكميلي 3: التكوين التجريبي الذي يسمح بتجنب التعرض للضوء غير المرغوب فيه. (أ) يتم وضع جهاز القياس في الفيتوترون ، (ب) إلى الحجرة مفصولة بباب محكم الغلق. (ج) يتم وضع صناديق الزراعة في المختبر (رأس السهم الأحمر) المخصصة لنمو الشتلات في ظل ظروف محددة (درجة الحرارة والرطوبة النسبية) أسفل الجهاز مباشرة (رأس السهم الأصفر) ، مما يضمن الحد الأدنى من مخاطر التعرض للضوء. يتم تثبيت مصدر الضوء الخافت الأخضر (رأس السهم الأزرق) على الحائط بجوار كمبيوتر التحكم (رأس السهم البرتقالي). الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.
الشكل التكميلي 4: إجراء إنشاء القناع في سير العمل باستخدام برنامج محلل بيانات PS. اطبع لقطات شاشة للخطوات الفردية التي يتعين تنفيذها لقناع الدرج (الخطوات 4.3-4.6) وإنشاء قناع النبات (الخطوة 4.12) وتحليل البيانات (الخطوتان 4.7 و4.13). الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.
الشكل التكميلي 5: كثافة البذر التي تؤثر على تباين القياس. حركية تراكم الكلوروفيل في شتلات Arabidopsis WT Col-0 البالغة من العمر 4 أيام والتي تزرع (A) بشكل منفصل (كشتلات فردية ، هنا n = 5) أو في مجموعة من (B) عالية (HD ، n = 30-40) أو (C) منخفضة الكثافة (LD ، n = 10-15). يتوافق n مع عدد الشتلات لكل فتحة من شبكة البذر ، وتمثل البيانات القيم المتوسطة ± SD (المنطقة المظللة). تتوافق الكثافة العالية أو المنخفضة مع عدد الشتلات لكل فتحة من شبكة البذر كما هو مذكور. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.
الشكل التكميلي 6: يتطلب الفاصل الزمني للزراعة والمساحة تحسينا خاصا بالأنواع. نمو الأنواع النباتية المختلفة باستخدام بروتوكول أرابيدوبسيس الأمثل. أ: وضع البذور على شبكة البذر. (ب) شتلات عمرها 4 أيام من (من اليسار إلى اليمين) من أرابيدوبسيس ثاليانا وبراسيكا نابوس وكرامبي أبيسينيكا. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
الخطوات الحاسمة للبروتوكول واستكشاف الأخطاء وإصلاحها - لا يوجد ضوء والعناية بالقناع
كما هو موضح مباشرة في وصف البروتوكول أعلاه ، فإن تجنب حتى الكميات الضئيلة من الضوء سواء أثناء زراعة شتلات النباتات etiolated أو قبل بدء البروتوكول مباشرة له أهميةحاسمة 11. في إعدادنا ، نستخدم غرفة مظلمة مخصصة تقع في الفيتوترون ومنفصلة عن بقية phytotron بباب دوار محكم الإغلاق (الشكل التكميلي 3). تم تجهيز الغرفة بمساحة لزراعة النباتات ومنضدة عمل تسمح باستيعاب الجهاز مع جهاز كمبيوتر للتحكم وغطاء الدخان. هذا يسمح لنا بزراعة النباتات في الظلام وبدء القياس دون الحاجة إلى نقل الألواح.
تعد طريقة زراعة النباتات وتوليد القناع أمرا بالغ الأهمية للقياس الكمي اللاحق لإشارة مضان الكلوروفيل عبر الفحص المقترح. يجب على المرء تجنب الحصول على كتل من عامل التبلور أو القمامة / الغبار البصري الصغير في الوسائط لأنه قد يسبب انعكاس الضوء. نظرا لأن التعرف على مضان الكلوروفيل بواسطة البرنامج محدود بالقناع ، فلن يتم تحليل منطقة النبات التي لن يغطيها القناع بواسطة البرنامج. أثناء قياس 4 ساعات ، تنمو الشتلات / تتحرك قليلا ، لذلك قد يتطلب القناع المعين تعديلات لأنه قد لا يتناسب مع جميع جولات القياس من أجل القياس الكمي الدقيق لشدة الإشارة. وفقا لتجربتنا ، يبدو أن تعريف القناع غير الكامل هو المصدر الرئيسي للتباين. خلال تجارب التحسين ، راقبنا التغيرات في تباين قيم مضان الكلوروفيل المأخوذة للتحليل في i) الشتلات الفردية ومجموعة من الشتلات مع ii) أعلى (30-40 بذرة) و iii) بذر كثافة أقل (10-15 بذرة) (الشكل التكميلي 5). استخدمنا كثافة أعلى من بذر البذور لأنها أظهرت أقل تباين. ينشأ التباين الأعلى الذي يظهر في حالة الشتلات الفردية / البذر منخفض الكثافة في الغالب من النسبة الأعلى من وحدات البكسل الموجودة على الحافة بين الإشارة والخلفية والحركة الطفيفة للشتلات خلال فترة القياس 4 ساعات.
للتأكد من دقة جميع القياسات ، تحقق مما إذا كان قناع النبات يناسب الجولة الأولى ، ثم إلى 15و 30و 45و 60و 75وهكذا حتى الجولة الأخيرة (عن طريق اختيار رقم الجولة والنقر فوق تحديث المعاينة). سيستغرق هذا دقيقتين فقط ولكنه سيضمن تغطية منطقة النبتة بأكملها وتقييمها. إذا لم يكن قناع النبات مناسبا في أي جولة (المنطقة المطلوبة غير مغطاة بالكامل) ، قسم التجربة إلى عدة أجزاء. ثم قم بتنفيذ البروتوكول بدءا من الخطوة 4 (4.1-4.13) لإنشاء قناع محدد بشكل منفصل لكل جزء من التجربة. على سبيل المثال ، إذا لاحظت إزاحة قناع النبات في الجولة 60-61 (أو قبل ذلك بقليل) ، قسم التجربة إلى قسمين- الجزء الأول (1-60 جولة)والجزء الثاني (61-121 جولة). بالنسبةللجزء الأول ، استخدم صورة الجولة 41 لإنشاء قناع نباتي وللجزء2 ، استخدم الجولة 91. في الخطوة 4.13 ، عند تحليل البيانات ، احرص على اختيار الجولات وفقا للجزء المقابل من التجربة (على سبيل المثال ، التقريب من 1 إلى 60 للجزء الأول و 61-121 للجزء الثاني ، كما في المثال المذكور أعلاه) قبل النقر فوق تحليل. عند العمل مع أرابيدوبسيس ، تكون حركة النباتات ضئيلة لأنها تنمو ببطء إلى حد ما ولكن في حالة تطبيق البروتوكول على أنواع مختلفة (انظر أدناه) ، يجب أن تؤخذ وتيرة النمو في الاعتبار.
التعديلات والقيود
يمكن تعديل عدد المعلمات ، بما في ذلك شدة وطول موجة الضوء الأكتيني و / أو الضوء الذي يتم تطبيقه بين فترات تطبيق الضوء الأكتيني. يشتمل جهاز القياس على عجلة مرشح مدمجة وآلية بالكامل ويتم التحكم فيها بواسطة البرامج. وبالتالي ، يمكن تضمين خوارزمية القياس المناسبة للقياس الكمي للأصباغ الأخرى ، وعادة ما تكون أيضا منتجات مسار التخليق الحيوي tetrapyrolle 10,12 ، في البروتوكول في حالة إضافة المرشحات المناسبة.
أيضا ، كما ذكرنا سابقا ، يمكن استخدام البروتوكول ليس فقط لنباتات Arabidopsis . ومع ذلك، عند العمل مع الأنواع النباتية الأخرى، ينبغي مراجعة كل خطوة من خطوات البروتوكول وفقا لذلك مع مراعاة السمات الخاصة بالأنواع بما في ذلك معدل الإنبات والنمو و/أو الحجم (الشكل التكميلي 6).
أحد القيود المهمة للبروتوكول هو الفترة الزمنية ، والتي يمكن خلالها إجراء تحليل كمية الكلوروفيل. بعد دمج الكلوروفيل في معقدات النظام الضوئي ، تصبح إشارة التألق متحيزة من خلال استهلاك طاقة التمثيل الضوئي (ما يسمى بفلورة الكلوروفيل المتغيرة موجودة) كما لوحظ خلال المراحل اللاحقة من إزالة الاحتكاك13. كما تم فحصه باستخدام مقايسة OJIP العابرة14،15 ، لم يتم اكتشاف أي علامات على نشاط التمثيل الضوئي باستخدام هذا الإعداد التجريبي خلال أول 4 ساعات من إزالة العدوى7. ومع ذلك ، إذا كان من المفترض / من الضروري فحص الفترة الزمنية الممتدة للتكوين الضوئي ، فيجب اختبار مستوى تجميع الأنظمة الضوئية والتأثير المحتمل لعملية التمثيل الضوئي على مستويات التألق الكلية.
أخيرا ، تجدر الإشارة إلى أن بروتوكولنا القائم على قياسات التألق ، يسمح بقياس كمية الكلوروفيل النسبية وليس المطلقة. إذا كانت هناك حاجة إلى القياس الكمي المطلق ، فيجب إجراء المعايرة المقابلة باستخدام بديل ، على سبيل المثال نهج HPLC.
الأهمية فيما يتعلق بالطرق الحالية - تقدير كمي بسيط وسريع وقوي إحصائيا للكلوروفيل مع وقت عال ودقة مكانية
يسمح الإجراء الموصوف هنا بالكشف في الوقت الفعلي عن الكلوروفيل وقياسه كميا في شتلات أرابيدوبسيس الحية خلال المراحل المبكرة من إزالة الالتهاب. بالمقارنة مع الأساليب الأخرى التي تعتمد في الغالب على استخراج الكلوروفيل من المواد النباتية المنفصلة16،17 أو الطرق البصرية المطورة حديثا18،19 ، فإن هذا النهج غير جراحي تماما ، مما يسمح بقياس كمية الكلوروفيل عن طريق القياس الحي لشدة التألق. أيضا ، ليست هناك حاجة إلى كواشف إضافية ضرورية لإعداد العينات كما هو الحال مع الطرق البديلة الأخرى الحالية بما في ذلك النهج القائمة على HPLC أو القياس الطيفي المذكورة أعلاه. البروتوكول الذي تم تقديمه حديثا بسيط وسريع ودقيق ، كما تم التحقق منه مسبقا باستخدام HPLC5. باستخدام إعدادات البروتوكول القياسية ، يتكون المنحنى النهائي لتكرار بيولوجي واحد من 120 نقطة قياس (تعني شدة التألق) مأخوذة خلال 4 ساعات من القياس ، تتكون كل منها من ما يصل إلى 15 نقطة قياس. عادة ، يتضمن المنحنى النهائي بيانات ثلاث نسخ بيولوجية متماثلة (على سبيل المثال ، ثلاث لوحات معدة بشكل مستقل) ، وثلاث نقاط قياس (ثلاث نسخ طبق الأصل تقنية) ، تتكون كل منها من 30-40 شتلة. وبالتالي ، هناك حوالي 300 شتلة تم فحصها في كل فترة زمنية ، مما يوفر مجموعة بيانات قوية إحصائيا ، مما يسمح بالكشف بشكل موثوق حتى عن الاختلافات الصغيرة كما هو موضح في الطفرات المتأثرة في خطوات مختلفة من التخليق الحيوي للكلوروفيل7. هنا نشجع المستخدم على استخدام النهج الإحصائي الذي تم تطويره مؤخرا بناء على نماذج مختلطة خطية معممة جنبا إلى جنب مع نماذج السلاسل الزمنية الكلاسيكية كأداة مناسبة لتحليل بيانات حركية الكلوروفيل20.
التطبيقات المستقبلية لهذه التقنية - فحص سريع ورخيص
تجعل الميزات المذكورة أعلاه هذا النهج أداة مفيدة مناسبة للفحص السريع والرخيص والتحديد الكمي الدقيق للغاية للسمات المرتبطة (بشكل مباشر أو غير مباشر) بالتخليق الحيوي للكلوروفيل. قد يشمل ذلك الدراسات التي تستخدم الفحص الجيني المتقدم لتوصيف اللوائح المعقدة والمتعددة المستويات للتخليق الحيوي للكلوروفيل10،12،21 بشكل أفضل. بالنظر إلى إمكانية المعالجة المركبة المختلفة ، فإن البروتوكول له أيضا قيمة عالية لدراسة ، على سبيل المثال ، أهمية اللوائح الهرمونية بوساطة الضوء22،23 أو فحص المركبات الجزيئية المنخفضة مع تأثير محتمل على حركية تراكم الكلوروفيل.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Z.B. و K.P. موظفان في PSI ومارتن ترتيليك هو الرئيس التنفيذي ومالك شركة PSI المنتجة ل iReenCAM. شارك جميع هؤلاء المؤلفين في تطوير الصك كما هو موضح سابقا7.
Acknowledgments
تم دعم هذا العمل من الصندوق الأوروبي للتنمية الإقليمية - مشروع SINGING PLANT (No. CZ.02.1.01/0.0/0.0/16_026/0008446). حصل هذا المشروع على تمويل من خلال مشروع MSCA4Ukraine (ID 1233580) ، الذي يموله الاتحاد الأوروبي. نحن ممتنون للينكا سوشوركوفا على التصميم الرسومي للشكل 1.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6-benzylaminopurine | Duchefa Biochemie | B0904.0001 | |
| Aluminum foil | Merck | Z691577 | |
| Arabidopsis thaliana Col-0 seeds | NASC collection | N1092 | |
| Cultivation chamber | PSI | custom made | |
| Dimethilsulfoxid | Thermo Fisher Scientific | 042780.AK | |
| Eppendorf single-channeled, variable (100-1000 μL) | Merck | EP3123000063 | |
| Gelrite | Duchefa Biochemie | G1101 | |
| iReenCAM device | PSI | custom made/prototype | |
| Laboratory bottles, with caps (Duran), 100mL | Merck | Z305170-10EA | |
| Laminar-flow box | UniGreenScheme | ITEM-31156 | |
| Linerless Rubber Splicing Tape, 19 mm width, black, Scotch | 3M Science. Applied to Life | 7000006085 | |
| Microcentrifuge tube, 2 mL with lid, PPT, BRAND | Merck | BR780546-500EA | |
| Micropore tape | 3M Science. Applied to Life | 7100225115 | |
| Osram lumilux green l18w/66 | Ovalamp | 200008833 | |
| Petri plates - Greiner dishes, square, 120 x 120 x17mm, vented | Merck | Z617679-240EA | |
| Pipet tips, 1000 μL, Axygen | Merck | AXYT1000B | |
| The Plant Screen Data Analyzer software | PSI | delivered as a part of the iReenCAM |
References
- Arsovski, A. A., Galstyan, A., Guseman, J. M., Nemhauser, J. L.
- Reinbothe, S., Reinbothe, C., Apel, K., Lebedev, N. Evolution of chlorophyll biosynthesis--the challenge to survive photooxidation. Cell. 86 (5), 703-705 (1996).
- Heyes, D. J., et al. Photocatalysis as the 'master switch' of photomorphogenesis in early plant development. Nat Plants. 7 (3), 268-276 (2021).
- Hu, X. Y., Tanaka, A., Tanaka, R. Simple extraction methods that prevent the artifactual conversion of chlorophyll to chlorophyllide during pigment isolation from leaf samples. Plant Methods. 9 (1), 19 (2013).
- Chazaux, M., Schiphorst, C., Lazzari, G., Caffarri, S. Precise estimation of chlorophyll a, b and carotenoid content by deconvolution of the absorption spectrum and new simultaneous equations for chl determination. Plant J. 109 (6), 1630-1648 (2022).
- Marr, I. L., Suryana, N., Lukulay, P., Marr, M. I. Determination of chlorophyll-a and chlorophyll-b by simultaneous multicomponent spectrophotometry. Fresenius J Anal Chem. 352 (5), 456-460 (1995).
- Balakhonova, V., et al. Ireencam: Automated imaging system for kinetic analysis of photosynthetic pigment biosynthesis at high spatiotemporal resolution during early deetiolation. Front Plant Sci. 14, 1093292 (2023).
- Virgin, H. I., Kahn, A., Vonwettstein, D. The physiology of chlorophyll formation in relation to structural changes in chloroplasts. Photochem Photobiol. 2 (2), 83-91 (1963).
- Reinbothe, C., et al. Chlorophyll biosynthesis: Spotlight on protochlorophyllide reduction. Trends Plant Sci. 15 (11), 614-624 (2010).
- Kobayashi, K., Masuda, T. Transcriptional regulation of tetrapyrrole biosynthesis in arabidopsis thaliana. Front Plant Sci. 7, 1811 (2016).
- Wang, Y., Folta, K. M. Contributions of green light to plant growth and development. Am J Bot. 100 (1), 70-78 (2013).
- Brzezowski, P., Richter, A. S., Grimm, B. Regulation and function of tetrapyrrole biosynthesis in plants and algae. Biochim Biophys Acta. 1847 (9), 968-985 (2015).
- Pipitone, R., et al. A multifaceted analysis reveals two distinct phases of chloroplast biogenesis during de-etiolation in arabidopsis. eLife. 10, e62709 (2021).
- Stirbet, A. G. On the relation between the kautsky effect (chlorophyll a fluorescence induction) and photosystem ii: Basics and applications of the ojip fluorescence transient. J Photochem Photobiol B-Biol. 104 (1-2), 236-257 (2011).
- Kupper, H., et al. Analysis of ojip chlorophyll fluorescence kinetics and q(a) reoxidation kinetics by direct fast imaging. Plant Physiol. 179 (2), 369-381 (2019).
- Avin-Wittenberg, T., et al. Global analysis of the role of autophagy in cellular metabolism and energy homeostasis in arabidopsis seedlings under carbon starvation. Plant Cell. 27 (2), 306-322 (2015).
- Kósa, A., Preininger, É, Böddi, B. Nitrogen deficiency hinders etioplast development in stems of dark-grown pea (pisum sativum) shoot cultures. Physiol Plant. 155 (3), 330-337 (2015).
- Liang, Y., et al. A nondestructive method to estimate the chlorophyll content of arabidopsis seedlings. Plant Met. 13 (1), 26 (2017).
- Pérez-Patricio, M., et al. Optical method for estimating the chlorophyll contents in plant leaves. Sensors. 18 (2), 650 (2018).
- Spyroglou, I., et al. Mixed models as a tool for comparing groups of time series in plant sciences. Plants (Basel). 10 (2), (2021).
- Tanaka, R., Kobayashi, K., Masuda, T.
- De Wit, M., Galvao, V. C., Fankhauser, C. Light-mediated hormonal regulation of plant growth and development. Annu Rev Plant Biol. 67, 513-537 (2016).
- Liu, X., Li, Y., Zhong, S. Interplay between light and plant hormones in the control of arabidopsis seedling chlorophyll biosynthesis. Front Plant Sci. 8, 1433 (2017).
