Summary
Hier beschrijven we een geavanceerd hulpmiddel dat is ontworpen voor het monitoren van de biosynthese van chlorofyl tijdens de vroege stadia van de de-etiolatie van Arabidopsis-zaailingen . De nieuwe methodologie biedt niet-invasieve real-time chlorofylfluorescentiebeeldvorming met een hoge ruimtelijke en temporele resolutie.
Abstract
Biosynthese van chlorofyl is een kenmerk van de-etiolatie, een van de meest dramatische stadia in de levenscyclus van planten. Het strak gecontroleerde en zeer dynamische proces van chlorofylbiosynthese wordt geactiveerd tijdens de verschuiving van donker naar licht in bloeiende planten. Op het moment dat geëtioleerde zaailingen worden blootgesteld aan de eerste sporen van zonlicht, wordt een snelle (in volgorde van seconden) omzetting van protochlorophyllide in chlorofyllide gemedieerd door unieke lichtaccepterende eiwitcomplexen, wat via daaropvolgende metabole stappen leidt tot de productie van volledig functioneel chlorofyl. Standaardtechnieken voor de analyse van het chlorofylgehalte omvatten pigmentextractie uit losgemaakte plantenweefsels, wat niet van toepassing is op het bestuderen van dergelijke snelle processen. Om chlorofylkinetiek in vivo te onderzoeken met hoge nauwkeurigheid en spatiotemporele resolutie in de eerste uren na door licht geïnduceerde de-etiolatie, werden een instrument en protocol ontwikkeld. Hier presenteren we een gedetailleerde procedure die is ontworpen voor statistisch robuuste kwantificering van chlorofyl in de vroege stadia van Arabidopsis-de-etiolatie .
Introduction
De-etiolatie vertegenwoordigt de meest dramatische fase in de levenscyclus van planten, gekenmerkt door een aantal morfologische veranderingen en een volledige herschikking van het plantenmetabolisme (van hetero- naar autotropisch)1. Biosynthese van chlorofyl is een kenmerk van door licht geïnduceerde de-etiolatie in planten en een zeer dynamisch proces. De vorming van chlorofyl uit in het donker geproduceerde precursor protochlorophyllide moet nauw worden gecoördineerd om schade door reactieve bijproducten te voorkomen. De protochlorofyllidreductie tot chlorofyllide wordt gekatalyseerd door lichtafhankelijke protochlorofyllidoxidoreductasen (POR's), unieke enzymen die direct door licht worden geactiveerd. De reactie is zeer snel en vindt plaats in de orde van ms tot s3, wat leidt tot herkenbare chlorofylaccumulatie binnen enkele minuten na doorstraling van geëtioleerde zaailingen 4,5,6. Er is meer tijd (van uren tot dagen) nodig voor de biogenese van chloroplasten om een volledig functioneel fotosynthetisch apparaat tot stand te brengen3.
Er bestaan verschillende methoden om het chlorofylgehalte te analyseren, waaronder high-performance vloeistofchromatografie (HPLC) of spectrofotometrie. Gewoonlijk vereisen deze technieken de vernietiging van plantenweefsel 4,5,6, waardoor de bepaling van veranderingen in chlorofylniveaus in de loop van de tijd wordt beperkt. Methoden die niet-invasieve chlorofylkinetiek mogelijk maken, kunnen een geheel nieuw perspectief openen om planten te bestuderen in diverse aspecten, variërend van fundamentele onderzoeksvragen, zoals het analyseren van het proces van chlorofylsynthese in tijd en ruimte, tot meer praktische toepassingen, zoals beoordeling van stresstolerantie of effect van biostimulanten op de chlorofylkinetiek. Daarom hebben we een systeem geïntroduceerd voor het monitoren van chlorofylvorming, iReenCAM7. Het bevat een CCD-camera, emissiefilters, lichtbronnen en een pijplijn voor geautomatiseerde fluorescentieanalyse (Figuur 1). Het belangrijkste kenmerk van het ontwikkelde apparaat is een hoge ruimtelijke en temporele resolutie, die beter presteert dan de parameters die in de huidige benaderingen worden gebruikt, en voldoende gevoeligheid en specificiteit in vergelijking met standaard analytische methoden7.
De niet-invasieve procedure die hier wordt beschreven, vereist een minimum aan reagentia en bestaat uit eenvoudige stappen, waardoor een chlorofylkinetisch profiel kan worden verkregen in levende Arabidopsis-zaailingen tijdens zeer vroege stadia van de-etiolatie. Het protocol kan nuttig zijn voor de studie van een zeer dynamisch proces van chlorofylsynthese dat wordt beïnvloed door een aantal factoren, zowel exogeen (zout, droogte, biostimulanten, zware metalen, enz.) als endogeen (meestal geassocieerd met veranderingen in de genactiviteit) van oorsprong zonder dat plantenweefsel hoeft te worden losgemaakt, waardoor extra stress wordt vermeden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Medium voorbereiding
- Bereid het kweekmedium voor door 0,75 g geleermiddel te mengen met 50 ml steriel gedeïoniseerd water in een glazen fles om een concentratie van 1,5% (m/v) te bereiken voor één petriplaat (120 x 120 x 17 mm). Schud het mengsel voorzichtig en verwarm het vervolgens in een magnetron tot het kookt om het geleermiddel op te lossen (de oplossing wordt helder).
- Laat het medium afkoelen tot 58-60 °C voordat u doorgaat met de volgende stappen. Alle volgende stappen moeten worden uitgevoerd onder steriele omstandigheden binnen een laminaire stroomkap om besmetting te voorkomen.
- Gebruik petriplaten met lichtdichte randen om overmatige actinische lichtreflectie en hoge autofluorescentie op de achtergrond tijdens de metingen te voorkomen. Breng hiervoor zwart plakband (of andere beschikbare middelen) aan om alle zijden van de lege petriplaat te bedekken (Figuur 2).
- Voer sterilisatie van de plaat(en) uit na het aanbrengen van tape door bestraling met kiemdodende UV-lamp gedurende 20-30 minuten.
- Als het experiment een chemische behandeling omvat (d.w.z. abiotische/biotische stressoren, plantenhormonen en/of groeiregulatoren, enz.), voeg dan de juiste hoeveelheid overeenkomstige chemische stof rechtstreeks aan het medium toe. Houd er rekening mee dat er een gekozen chemische stabiliteit aan het medium wordt toegevoegd (als de chemische stof bijvoorbeeld niet thermostabiel is, voeg dan toe aan het medium wanneer het is afgekoeld vlak voordat u het in de plaat giet). Meng het medium grondig door te schudden om een gelijkmatige verdeling van de chemische stof te garanderen.
- Vermijd het verlichten van platen met UV-licht nadat het medium is gegoten (dit zou leiden tot de productie van zuurstofradicalen die het experiment zouden kunnen verstoren).
- Giet het voorbereide medium in de vierkante petrischaal(en) en laat het medium op kamertemperatuur stollen.
2. Sterilisatie van het zaadoppervlak en groeiomstandigheden van planten
- Haal de benodigde hoeveelheid Arabidopsis thaliana Col-0 zaden uit de stam (10-20 mg) en voeg deze toe aan een microcentrifugebuisje van 2 ml.
OPMERKING: Er zijn geen specifieke aanpassingen nodig bij het werken met verschillende Arabidopsis-lijnen (ecotype/mutantlijnen). Voor andere plantensoorten moeten het zaagrooster en de meetstappen worden herzien, rekening houdend met het verschil in zaadgrootte, kiemkracht en zaailinggrootte. - Steriliseer Arabidopsis-zaden aan de oppervlakte door 70% ethanol gedurende 2 minuten aan de buis toe te voegen. Schud de buisjes voorzichtig tijdens de sterilisatie.
- Verwijder ethanol door voorzichtig te pipetteren en zorg ervoor dat er geen zaden verloren gaan. Was de zaden door gedurende 5 minuten steriel water aan de buis toe te voegen om eventuele resterende ethanol te verwijderen (schud de buizen voorzichtig tijdens de wasperiode).
- Laat de zaden door de zwaartekracht naar de bodem van de buis bezinken, verwijder het resterende water.
- Spoel de zaden nogmaals 2x af met steriel water zoals beschreven in stap 2.3 om er zeker van te zijn dat ze vrij zijn van ethanoleigenschappen. Laat de zaden door de zwaartekracht naar de bodem van de buis bezinken, verwijder het resterende water.
- Voeg een gelijke hoeveelheid steriel water toe aan de buis met de zaden om een zaadwatersuspensie te creëren.
- Gebruik een zaairooster om de zaadwatersuspensie van het gegeven genotype gelijkmatig te verdelen over de geselecteerde delen van de middelgrote plaat (Figuur 2 en Aanvullende Figuur 1). Verdeel de zaden (ongeveer 30-40) op een rij in elk gebied met behulp van een brede pipetpunt.
- Laat het water ongeveer 30 minuten drogen in de zaadgebieden, waarbij u de plaat(en) open houdt in een laminaire doorstroomkap om besmetting te voorkomen. Sluit de plaat af met microporiëntape en wikkel deze in aluminiumfolie.
- Stratificeer de zaden gedurende 3 dagen bij 4 °C in het donker om (afhankelijk van het gebruikte ecotype) de kiemrust van het zaad te overwinnen en/of een uniforme kieming te bevorderen.
- Breng de plaat met gestratificeerde zaden gedurende 1 uur over in wit licht (150 μmol/m2/s) om ontkieming op te wekken (wikkel de folie alleen uit voor de lichtbehandeling).
- Wikkel de plaat na de lichtbehandeling in aluminiumfolie om de zaden tegen licht te beschermen en plaats deze in verticale positie in een groeikamer en kweek gedurende 4 dagen in het donker bij 21 °C.
3. Meting en analyse van chlorofylfluorescentie
- Schakel het iReenCAM-systeem in en zorg ervoor dat het systeem gereed is en correct is geconfigureerd in de automatisch gestarte PS-serversoftware (bijv. als er voldoende opslagruimte is voor de experimentgegevens, als de fluorescentiecamera is aangesloten op de pc, enz.).
- Activeer de Scheduler-software om het experimentele plan voor de meting te maken door op Experimenten > Nieuw experiment te klikken. Geef een beschrijvende naam op voor het experiment en vul de details in (beschrijving).
- Stel de vereiste acties voor het experiment in door op Actie toevoegen te klikken, wat leidt tot het schema met experimentele acties.
OPMERKING: Het woord actie betekent hier het uitvoeren van een volledig experiment (d.w.z. inclusief alle stappen die nodig zijn om één plaatmeting uit te voeren). - Specificeer de voorwaarden voor een enkele ronde meting (d.w.z. de lengte van de licht-/donkerperiode).
- Door op Lijst genereren te klikken, definieert u de tijdsintervallen tussen de meetrondes. Kies het tijdstip waarop de ronde begint en eindigt (4 uur in totaal) en de intervallen tussen de rondes (in de huidige opstelling één ronde om de 2 minuten).
- Klik op Genereren en zorg ervoor dat het tijdsbestek en de intervallen tussen lichtimpulsen correct zijn door de gegenereerde lijst aan de linkerkant van het scherm te controleren.
- Kies het meetprotocol (aanvullende afbeelding 2). Sla alle wijzigingen in de database op voor toekomstig gebruik.
- Gebruik vlak voor het begin van de meting groen licht van lage intensiteit (zie Materiaaltabel) in de donkere kamer en pas het niveau van de plank in de meetkamer aan of voer andere voorbereidende stappen uit voordat u de folie van de petriplaat verwijdert. Schakel vervolgens het licht uit en breng de platen in de volledige duisternis over naar de meetkamer.
- Verwijder voorzichtig de aluminiumfolie die de petriplaat met de 4 dagen oude zaailingen bedekt. Plaats de petriplaat horizontaal in de meetkamer van het apparaat. Induceer actinische lichtpulsen in de kamer en voer beeldvorming uit volgens het experimentplan (acties) dat is ingesteld in de stappen 3.1-3.7.
NOTITIE: Het is van cruciaal belang om te voorkomen dat de platen met geëtioleerde zaailingen worden verlicht voordat u ze in de meetkamer plaatst. De manipulatie met de plaat met geëtioleerde zaailingen moet worden uitgevoerd in de donkere kamer/kamer (voor een mogelijke experimentele opstelling zie aanvullende figuur 3).
4. Data-extractie en -analyse
- Open na het voltooien van de meting het bijbehorende experiment in de analysesoftware.
- Om de fluorescentie van de zaailingen te analyseren, genereert u twee soorten maskers: een ruw (tray) masker dat het gebied bedekt waar de zaailingen zich bevinden, en een nauwkeurig (plant)masker dat alleen het weefsel van belang bedekt (meestal zaadlobben).
- Genereer een lademasker door op de optie Nieuw ladetype maken te klikken. Wijs de juiste genotypenamen toe aan de respectievelijke gebieden op het plaatbeeld.
- Voor het toewijzen van genotype kiest u een afbeeldingsnummer bij Rond en klikt u vervolgens op Afbeelding laden in het bovenste deel van het scherm. De afbeelding van de plaat wordt op het scherm weergegeven. Door te klikken op een van de knoppen die verschillende tekengereedschappen voor vormen vertegenwoordigen (aanvullende afbeelding 4), gaat u naar de nieuwe vormmodus waarmee u het interessegebied op de plaatafbeelding kunt tekenen. Kies de benodigde gebieden (bijv. verschillende genotypen op de plaat) en geef de juiste naamgeving.
- Klik op Esc om de vormmodus te verlaten. Sla het gegenereerde lademasker op (nadat u er een naam voor hebt opgegeven) door op Type winkelvak te klikken.
- Ga een stap terug en pas het masker toe dat in de vorige stappen is gegenereerd door de naam ervan te selecteren in de optie Wijzigen per ladetype .
- Om een plantenmasker met hoge nauwkeurigheid te genereren, gebruikt u het beeld dat is verkregen na 180 minuten meting (ronde 91) om de minimale drempelwaarde voor de intensiteit van het fluorescentiesignaal in te stellen, waardoor achtergrondruis kan worden afgetrokken. Verwijder hiervoor het vinkje van Automatische drempel en stel een handmatige drempel in op 0 (aanvullende afbeelding 4).
- Klik op Voorbeeld om ervoor te zorgen dat het lademasker alle noodzakelijke gebieden (genotypen) op de plaatafbeelding bedekt. Kies hiervoor ronde 91 en klik op Refresh Preview.
- Ga naar het menu Uitvoeren door op Uitvoeren te klikken. Voer de analyse exclusief uit voor ronde 91 door alleen een vinkje te zetten op ronde 91. Kies vervolgens het uitvoerpad en klik op Analyse starten.
- Nadat de analyse is voltooid, wordt het menu Voltooien automatisch geopend. Kies de uitgevoerde ronde (dit is de enige) uit experimenten en klik op Analyzer overschakelen naar geanalyseerde gegevens om de gegevens voor dit specifieke tijdstip (ronde 91) te exporteren.
- Pak het .xsel-bestand uit het geëxporteerde archief uit, aangezien dit bestand de essentiële informatie over het plantenmasker bevat door op het pictogram Exportonderdeel openen te klikken.
- Open het experiment opnieuw door te klikken op het pictogram Lokaal analyseonderdeel openen . Ga opnieuw naar het menu Mask Builder , klik op Afbeelding laden, kies ronde 1 en vervolgens Laden uit bestand in de rechterbovenhoek van het scherm en laad het eerder uitgepakte .xsel-bestand. De afbeelding van de plaat wordt weergegeven met het dienbladmasker toegepast.
- Sla het masker op door te klikken op Type lade opslaan en pas het toe door de naam te selecteren in de optie Wijzigen door ladetype .
- Genereer het plantenmasker door de intensiteitsdrempel voor het fluorescentiesignaal aan te passen. Verhoog de waarde van Handmatige drempel totdat het masker dat wordt gegenereerd in het voorbeeldmenu perfect past bij de ROI (bijv. zaadlobben) in elk van de genotypen (aanvullende afbeelding 4). Controleer of het masker past bij alle rondes van de metingen door door de rondes te scrollen (het controleren van de juiste positionering van het masker in ronde 1, 61 en 121 zou voldoende moeten zijn) in het menu Voorbeeld .
- Voer de analyse uit voor alle meetrondes en exporteer gegevens.
OPMERKING: Het uitvoerbestand bevat chlorofylfluorescentiewaarden van een bepaald genotype voor elk tijdstip, waardoor de constructie van grafieken naar keuze mogelijk is en verdere statistische evaluatie wordt vergemakkelijkt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De typische output die wordt verkregen met behulp van de nieuw ontwikkelde procedure in de 4 dagen oude gedeëtioleerde Arabidopsis-zaailingen van wildtype (WT), ecotype Columbia-0 (Col-0) wordt weergegeven in figuur 3. Onder controleomstandigheden (DMSO-gesupplementeerde MS-media) begint de chlorofylbiosynthetische curve met een eerste uitbarsting van de chlorofylsynthese, waarbij de protochloorfyllidpool, gesynthetiseerd tijdens de scotomorfogene fase van de groei, snel wordt omgezet in chlorofyl als gevolg van de door licht geïnduceerde POR's 7,8,9. De beginfase van snelle chlorofylaccumulatie duurt ongeveer 10 minuten en wordt gevolgd door een vertragingsfase, waarin de minima van het donker gesynthetiseerde protochlorofyllide worden bereikt (ongeveer 30 minuten na bestraling; voor de HPLC-gemeten protochlorofyllidcurve, zie7). Tijdens de vertragingsfase worden de biosynthetische genen van chlorofyl opgereguleerd10, wat leidt tot door licht geïnduceerde productie van protochlorofyllide. Het nieuw gesynthetiseerde protochlorofyllide wordt onmiddellijk omgezet in chlorofyl, detecteerbaar als exponentiële fase (in het geval van WT Col-0 vanaf ongeveer 120 minuten na doorstraling), eindigend met een nieuwe vertragingsfase ongeveer 4 uur na de gedeëtioleerde doorstraling van zaailingen (Figuur 3). In aanwezigheid van 6-benzylaminopurine (BAP) zijn de eerste significante verschillen waarneembaar tijdens de exponentiële fase7, wat wijst op een negatief effect van BAP op de chlorofylkinetiek in latere stadia van chlorofylbiosynthese (ongeveer 2 uur na het begin van de verlichting met actinisch licht; Figuur 3).
Voor vergelijking van verschillende aandoeningen en/of genotypen is normalisatie van de ruwe gegevens noodzakelijk. Aangezien er geen chlorofyl detecteerbaar was met HPLC onder verschillende omstandigheden en/of verschillende genotypen in geëtioleerde zaailingen, voerden we de normalisatie (F/F0) uit naar de T0-fluorescentieniveaus (F0) gemeten voor de overeenkomstige behandeling en/of genotype7. Om het belang van normalisatie aan te tonen, presenteren we zowel ruwe gegevens als de gegevens die zijn genormaliseerd naar de gemiddelde chlorofylfluorescentiewaarde van de controle, gemeten op T0 (F0; Figuur 3A en Figuur 3B).
Figuur 1: Overzicht van het meetapparaatprotocol. Het schema van de iReenCAM-meet- en analysepijplijn. (A) Monstervoorbereiding door het zaaien van zaad in een raster, stratificatie, lichte inductie van kieming en verticaal georiënteerde petriplaatteelt in het donker. (B) Besturingsmodule voor automatische en programmeerbare beeldacquisitie en gegevensbeheer op basis van PlantScreen-fenotypering SW-toolbox organiseert de werking van het hele systeem door de HW-werking te controleren en te synchroniseren met het door de gebruiker gedefinieerde meet- en analyseprotocol. (C) Het meetprotocol is ontworpen voor dynamische metingen van de fluorescerende monsterbeelden met tussenpozen van 2 minuten gedurende in totaal 4 uur, d.w.z. 120 meetrondes. Tijd visueel frame van representatief beeld in valse kleuren van verticaal georiënteerde 4 dagen oude Arabidopsis-zaailingen die zijn verkregen op tijdstip 180 min wordt gebruikt voor het genereren van ROI-maskers. (D) Masker dat de ROI definieert voor een weefsel van belang (bijv. zaadlob, hypocotyl of wortelzone) wordt toegepast op het visuele tijdskader, achtergrondaftrekking wordt uitgevoerd en pixel voor pixel fluorescentiewaarden voor elke ROI (gedefinieerd door het plantenmasker) uit alle meetrondes worden geëxtraheerd. Ten slotte worden de ruwe gegevens (fluorescentie F) genormaliseerd naar de gemiddelde fluorescentiewaarde bij T0 (F0). Schaalbalken = 1 cm (A) en 0,25 cm (C). Het cijfer is gewijzigd van7. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Plaatsing van het zaad. De afbeelding toont het plaatsen van Arabidopsis-zaden op de petriplaat met lichtdichte randen met behulp van het zaagrooster. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Kinetiek van chlorofylaccumulatie in de vroege stadia van Arabidopsis-de-etiolatie . Geëtioleerde WT Col-0 zaailingen werden gekweekt op media aangevuld met BAP of DMSO (mock). (A) De gemiddelde waarde ± SD (gearceerd gebied), n=9 van de ruwe gegevens en (B) gegevens genormaliseerd naar de gemiddelde fluorescentiewaarde bij T0 (F0). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Aanvullende figuur 1: Zaairooster. Links: Zaairooster met omlijnde rechthoekige vakjes voor het plaatsen van de zaden van elk genotype op een meetplek in het gebied van actinische lichthomogeniteit (lichtintensiteit ≥ 0,7 van de maximale lichtintensiteit). Rechts: Schematische weergave van 4 dagen oude, geëtioleerde Arabidopsis-zaailingen die voor de analyse zijn gekweekt. Het zaairooster biedt een mogelijk schema voor de positionering van Arabidopsis-zaden en zorgt voor lichte homogeniteit en de juiste zaaddichtheid (elke sleuf kan worden gebruikt voor het plaatsen van zaden, aangezien de grootte van een sleuf, de afstand tussen de sleuven en de lichte homogeniteit in het gebied van het rooster worden verenigd). Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullende figuur 2: Fluorescentiemeetprotocol. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullende figuur 3: Experimentele configuratie die het mogelijk maakt om ongewenste blootstelling aan licht te voorkomen. (A) Het meetapparaat wordt in de inloopfytotron geplaatst, (B) naar de kamer gescheiden door een lichtdichte deur. (C) De in-vitrokweekdozen (rode pijlpunt) die bestemd zijn voor de groei van geëtioleerde zaailingen onder bepaalde omstandigheden (temperatuur en relatieve vochtigheid) worden net onder het apparaat geplaatst (gele pijlpunt), waardoor het risico op blootstelling aan licht minimaal is. De bron van groen gedimd licht (blauwe pijlpunt) wordt aan de muur naast de besturings-pc gemonteerd (oranje pijlpunt). Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullende afbeelding 4: Procedure voor het genereren van maskers in de workflow met behulp van PS-dataanalysesoftware. Print screenshots van de afzonderlijke stappen die moeten worden uitgevoerd voor het genereren van het traymasker (stappen 4.3-4.6) en het plantenmasker (stap 4.12) en de gegevensanalyse (stappen 4.7 en 4.13). Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullende figuur 5: Zaaidichtheid die van invloed is op de meetvariabiliteit. Chlorofylaccumulatiekinetiek in 4 dagen oude, geëtioleerde Arabidopsis WT Col-0 zaailingen gekweekt (A) afzonderlijk (als individuele zaailingen, hier n=5) of in een groep van (B) hoge (HD, n=30-40) of (C) lage dichtheid (LD, n=10-15). De n komt overeen met het aantal zaailingen per sleuf van het zaairooster, de gegevens vertegenwoordigen de gemiddelde waarden ± SD (gearceerd gebied). De hoge of lage dichtheid komt overeen met het aantal zaailingen per sleuf van het zaairooster zoals vermeld. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullende figuur 6: Teeltinterval en -ruimte vereisen soortspecifieke optimalisatie. Groei van verschillende plantensoorten met behulp van het Arabidopsis-geoptimaliseerde protocol. (A) Plaatsing van zaden op het zaairooster. (B) 4 dagen oude, geëtioleerde zaailingen van (van links naar rechts) Arabidopsis thaliana, Brassica napus en Crambe abyssinica. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kritieke stappen van het protocol en probleemoplossing - geen licht en zorg voor het masker
Zoals direct wordt benadrukt in de bovenstaande protocolbeschrijving, is het van cruciaal belang om zelfs de sporen van licht te vermijden, zowel tijdens de teelt van geëtioleerde plantenzaailingen als vlak voor het starten van hetprotocol11. In onze opstelling gebruiken we een speciale donkere kamer die zich in de inloopfytotron bevindt en gescheiden is van de rest van de fytotron met een lichtdichte draaideur (aanvullende afbeelding 3). De kamer is uitgerust met een kweekruimte voor planten en een werkbank die het mogelijk maakt om het apparaat samen met de besturings-pc en zuurkast te huisvesten. Dit stelt ons in staat om zowel de planten in het donker te laten groeien als de meting te starten zonder dat er plaattransport nodig is.
De manier waarop planten worden gekweekt en maskers worden gegenereerd, is van cruciaal belang voor de latere kwantificering van het chlorofylfluorescentiesignaal via de voorgestelde test. Men moet voorkomen dat er klonten geleermiddel of klein visueel afval/stof in de media komen, omdat dit lichtreflectie kan veroorzaken. Aangezien de herkenning van chlorofylfluorescentie door de software wordt beperkt door het masker, zal een plantgebied dat niet door het masker wordt bedekt, eenvoudigweg niet door de software worden geanalyseerd. Tijdens de meting van 4 uur groeien/bewegen zaailingen een beetje, daarom kan het aangewezen masker aanpassingen vereisen, omdat het mogelijk niet door alle meetrondes past voor de nauwkeurige kwantificering van de signaalintensiteit. Volgens onze ervaring lijkt de onvolmaakte maskerdefinitie de belangrijkste bron van variabiliteit te zijn. Tijdens de optimalisatie-experimenten hebben we de veranderingen in de variabiliteit van chlorofylfluorescentiewaarden gevolgd die voor analyse zijn genomen in i) individuele zaailingen en een groep zaailingen met ii) een hogere (30-40 zaden) en iii) lagere (10-15 zaden) zaaidichtheid (aanvullende figuur 5). We gebruikten een hogere dichtheid van het zaaien van zaad omdat dit de laagste variabiliteit vertoonde. De grotere variabiliteit die wordt waargenomen in het geval van individuele zaailingen/zaaien met een lagere dichtheid is voornamelijk het gevolg van het hogere aandeel pixels aan de rand tussen het signaal en de achtergrond en de lichte beweging van de zaailingen tijdens het meetinterval van 4 uur.
Om er zeker van te zijn dat alle metingen nauwkeurig zijn, controleert u of het plantenmasker past bij de eerste ronde, vervolgens op de15e, 30e, 45e, 60e, 75e enzovoort tot de laatste (door het nummer van de ronde te kiezen en op Voorbeeld vernieuwen te klikken). Dit duurt slechts een paar minuten, maar zorgt ervoor dat het hele zaadlobbengebied wordt bedekt en geëvalueerd. Als het plantenmasker bij een ronde niet past (het vereiste gebied is niet volledig bedekt), verdeel het experiment dan in verschillende delen. Voer vervolgens het protocol uit vanaf stap 4 (4.1-4.13) om voor elk onderdeel van het experiment afzonderlijk een specifiek masker te maken. Als je bijvoorbeeld de verplaatsing van het plantenmasker opmerkt bij de ronde 60-61 (of iets eerder), verdeel het experiment dan in twee delen - 1e deel (1-60 rondes) en2e deel (61-121 rondes). Voor het 1edeel gebruik je de afbeelding van toer 41 om een plantenmasker te maken en voor het 2edeel gebruik je toer 91. Zorg er bij stap 4.13 bij het analyseren van de gegevens voor dat u de rondes kiest op basis van het overeenkomstige deel van het experiment (bijv. rondes 1-60 voor het eerste deel en 61-121 voor het tweede, zoals in het bovengenoemde voorbeeld) voordat u op Analyseren klikt. Bij het werken met Arabidopsis is de beweging van planten te verwaarlozen omdat ze vrij langzaam groeien, maar als het protocol voor verschillende soorten wordt toegepast (zie hieronder), moet rekening worden gehouden met het groeitempo.
Wijzigingen en beperkingen
Het aantal parameters kan worden gewijzigd, met inbegrip van de intensiteit en golflengte van het actinische licht en/of het licht dat wordt toegepast tussen de intervallen van actinisch licht. Het meetapparaat omvat het geïntegreerde, volledig gemotoriseerde en softwaregestuurde filterwiel. Het meetalgoritme dat geschikt is voor de kwantificering van andere pigmenten, doorgaans ook producten van de tetrapyrolle biosynthetische route10,12, kan dus in het protocol worden opgenomen in het geval van het toevoegen van de juiste filters.
Zoals eerder vermeld, kan het protocol ook niet alleen worden gebruikt voor Arabidopsis-planten . Bij het werken met andere plantensoorten moet echter elke stap van het protocol dienovereenkomstig worden herzien, rekening houdend met de soortspecifieke kenmerken, waaronder de kiem- en groeisnelheid en/of de grootte (aanvullende figuur 6).
Een van de belangrijke beperkingen van het protocol is de tijdspanne waarin de chlorofyl-kwantificeringsanalyse kan worden uitgevoerd. Nadat chlorofyl is geïntegreerd in de fotosysteemcomplexen, wordt het fluorescentiesignaal vertekend door het energieverbruik van de fotosynthese (wat de variabele chlorofylbloeiwijze wordt genoemd) zoals is waargenomen tijdens latere stadia van de-etiolatie13. Zoals getest met behulp van OJIP transiënten assay14,15, waren er geen tekenen van fotosynthetische activiteit waarneembaar met behulp van deze experimentele opstelling gedurende de eerste 4 uur van de-etiolatie7. Als echter wordt verondersteld/noodzakelijk is dat de langere periode van fotomorfogenese wordt onderzocht, moeten het niveau van de assemblage van fotosystemen en het mogelijke effect van fotosynthese op de totale fluorescentieniveaus worden getest.
Ten slotte moet worden vermeld dat ons protocol, gebaseerd op de fluorescentiemetingen, een relatieve, niet absolute chlorofylkwantificering mogelijk maakt. Als absolute kwantificering nodig is, moet de overeenkomstige kalibratie worden uitgevoerd met behulp van een alternatief, bijvoorbeeld een HPLC-benadering.
Significantie ten opzichte van bestaande methoden - eenvoudige, snelle en statistisch robuuste chlorofylkwantificering met hoge tijd en ruimtelijke resolutie
De hier beschreven procedure maakt de real-time detectie en kwantificering van chlorofyl in levende Arabidopsis-zaailingen mogelijk tijdens vroege stadia van de-etiolatie. Vergeleken met andere benaderingen die meestal gebaseerd zijn op chlorofylextractie uit losstaand plantaardig materiaal16,17 of recent ontwikkelde optische methoden18,19, is deze benadering puur niet-invasief, waardoor chlorofylkwantificering mogelijk is door in vivo meting van de fluorescentie-intensiteit. Ook zijn er geen extra reagentia nodig die nodig zijn voor de monstervoorbereiding, zoals bij andere bestaande alternatieve methoden, waaronder de eerder genoemde op HPLC of spectrofotometrie gebaseerde benaderingen. Het nieuw geïntroduceerde protocol is eenvoudig, snel en nauwkeurig, zoals eerder geverifieerd met HPLC5. Met behulp van de standaardprotocolinstellingen wordt de uiteindelijke curve van een enkele biologische herhaling gemaakt van 120 meetpunten (fluorescentie-intensiteitsmiddelen) die gedurende 4 uur van de meting zijn genomen, elk bestaande uit maximaal 15 meetpunten. Meestal bevat de uiteindelijke curve de gegevens van drie biologische replica's (bijv. drie onafhankelijk geprepareerde platen) en drie meetpunten (drie technische replica's), elk bestaande uit 30-40 zaailingen. Er zijn dus ongeveer 300 zaailingen getest in elk tijdsinterval, wat een statistisch robuuste dataset oplevert, waardoor zelfs kleine verschillen betrouwbaar kunnen worden gedetecteerd, zoals aangetoond bij mutanten die zijn aangetast in verschillende stappen van chlorofylbiosynthese7. Hier moedigen we de gebruiker aan om de recent ontwikkelde statistische benadering op basis van gegeneraliseerde lineaire gemengde modellen in combinatie met klassieke tijdreeksmodellen te gebruiken als een geschikt hulpmiddel voor de analyse van chlorofylkinetische gegevens20.
Toekomstige toepassingen van de techniek - snel en goedkoop screenen
De bovengenoemde kenmerken maken deze aanpak tot een nuttig hulpmiddel dat geschikt is voor snelle en goedkope screening en zeer nauwkeurige kwantificering van eigenschappen die (direct of indirect) verband houden met chlorofylbiosynthese. Dit kunnen studies omvatten die gebruik maken van de voorwaartse genetische screening om de complexe en meerlagige regelgeving van chlorofylbiosynthese beter te karakteriseren 10,12,21. Gezien de mogelijkheid van verschillende behandelingen met verbindingen, is het protocol ook zeer waardevol om bijvoorbeeld het belang van lichtgemedieerde hormonale regulatie te bestuderen22,23 of screening op laagmoleculaire verbindingen met mogelijke impact op de kinetiek van chlorofylaccumulatie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Z.B. en K.P. zijn werknemers van de PSI en Martin Trtilek is CEO en eigenaar van het PSI-bedrijf dat de iReenCAM produceert. Al deze auteurs waren betrokken bij de ontwikkeling van het instrument zoals eerder beschreven7.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door het Europees Fonds voor Regionale Ontwikkeling - Project SINGING PLANT (nr. CZ.02.1.01/0.0/0.0/16_026/0008446). Dit project is gefinancierd via het MSCA4Ukraine-project (ID 1233580), dat wordt gefinancierd door de Europese Unie. We zijn Lenka Sochurkova dankbaar voor de grafische vormgeving van Figuur 1.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6-benzylaminopurine | Duchefa Biochemie | B0904.0001 | |
| Aluminum foil | Merck | Z691577 | |
| Arabidopsis thaliana Col-0 seeds | NASC collection | N1092 | |
| Cultivation chamber | PSI | custom made | |
| Dimethilsulfoxid | Thermo Fisher Scientific | 042780.AK | |
| Eppendorf single-channeled, variable (100-1000 μL) | Merck | EP3123000063 | |
| Gelrite | Duchefa Biochemie | G1101 | |
| iReenCAM device | PSI | custom made/prototype | |
| Laboratory bottles, with caps (Duran), 100mL | Merck | Z305170-10EA | |
| Laminar-flow box | UniGreenScheme | ITEM-31156 | |
| Linerless Rubber Splicing Tape, 19 mm width, black, Scotch | 3M Science. Applied to Life | 7000006085 | |
| Microcentrifuge tube, 2 mL with lid, PPT, BRAND | Merck | BR780546-500EA | |
| Micropore tape | 3M Science. Applied to Life | 7100225115 | |
| Osram lumilux green l18w/66 | Ovalamp | 200008833 | |
| Petri plates - Greiner dishes, square, 120 x 120 x17mm, vented | Merck | Z617679-240EA | |
| Pipet tips, 1000 μL, Axygen | Merck | AXYT1000B | |
| The Plant Screen Data Analyzer software | PSI | delivered as a part of the iReenCAM |
References
- Arsovski, A. A., Galstyan, A., Guseman, J. M., Nemhauser, J. L.
- Reinbothe, S., Reinbothe, C., Apel, K., Lebedev, N. Evolution of chlorophyll biosynthesis--the challenge to survive photooxidation. Cell. 86 (5), 703-705 (1996).
- Heyes, D. J., et al. Photocatalysis as the 'master switch' of photomorphogenesis in early plant development. Nat Plants. 7 (3), 268-276 (2021).
- Hu, X. Y., Tanaka, A., Tanaka, R. Simple extraction methods that prevent the artifactual conversion of chlorophyll to chlorophyllide during pigment isolation from leaf samples. Plant Methods. 9 (1), 19 (2013).
- Chazaux, M., Schiphorst, C., Lazzari, G., Caffarri, S. Precise estimation of chlorophyll a, b and carotenoid content by deconvolution of the absorption spectrum and new simultaneous equations for chl determination. Plant J. 109 (6), 1630-1648 (2022).
- Marr, I. L., Suryana, N., Lukulay, P., Marr, M. I. Determination of chlorophyll-a and chlorophyll-b by simultaneous multicomponent spectrophotometry. Fresenius J Anal Chem. 352 (5), 456-460 (1995).
- Balakhonova, V., et al. Ireencam: Automated imaging system for kinetic analysis of photosynthetic pigment biosynthesis at high spatiotemporal resolution during early deetiolation. Front Plant Sci. 14, 1093292 (2023).
- Virgin, H. I., Kahn, A., Vonwettstein, D. The physiology of chlorophyll formation in relation to structural changes in chloroplasts. Photochem Photobiol. 2 (2), 83-91 (1963).
- Reinbothe, C., et al. Chlorophyll biosynthesis: Spotlight on protochlorophyllide reduction. Trends Plant Sci. 15 (11), 614-624 (2010).
- Kobayashi, K., Masuda, T. Transcriptional regulation of tetrapyrrole biosynthesis in arabidopsis thaliana. Front Plant Sci. 7, 1811 (2016).
- Wang, Y., Folta, K. M. Contributions of green light to plant growth and development. Am J Bot. 100 (1), 70-78 (2013).
- Brzezowski, P., Richter, A. S., Grimm, B. Regulation and function of tetrapyrrole biosynthesis in plants and algae. Biochim Biophys Acta. 1847 (9), 968-985 (2015).
- Pipitone, R., et al. A multifaceted analysis reveals two distinct phases of chloroplast biogenesis during de-etiolation in arabidopsis. eLife. 10, e62709 (2021).
- Stirbet, A. G. On the relation between the kautsky effect (chlorophyll a fluorescence induction) and photosystem ii: Basics and applications of the ojip fluorescence transient. J Photochem Photobiol B-Biol. 104 (1-2), 236-257 (2011).
- Kupper, H., et al. Analysis of ojip chlorophyll fluorescence kinetics and q(a) reoxidation kinetics by direct fast imaging. Plant Physiol. 179 (2), 369-381 (2019).
- Avin-Wittenberg, T., et al. Global analysis of the role of autophagy in cellular metabolism and energy homeostasis in arabidopsis seedlings under carbon starvation. Plant Cell. 27 (2), 306-322 (2015).
- Kósa, A., Preininger, É, Böddi, B. Nitrogen deficiency hinders etioplast development in stems of dark-grown pea (pisum sativum) shoot cultures. Physiol Plant. 155 (3), 330-337 (2015).
- Liang, Y., et al. A nondestructive method to estimate the chlorophyll content of arabidopsis seedlings. Plant Met. 13 (1), 26 (2017).
- Pérez-Patricio, M., et al. Optical method for estimating the chlorophyll contents in plant leaves. Sensors. 18 (2), 650 (2018).
- Spyroglou, I., et al. Mixed models as a tool for comparing groups of time series in plant sciences. Plants (Basel). 10 (2), (2021).
- Tanaka, R., Kobayashi, K., Masuda, T.
- De Wit, M., Galvao, V. C., Fankhauser, C. Light-mediated hormonal regulation of plant growth and development. Annu Rev Plant Biol. 67, 513-537 (2016).
- Liu, X., Li, Y., Zhong, S. Interplay between light and plant hormones in the control of arabidopsis seedling chlorophyll biosynthesis. Front Plant Sci. 8, 1433 (2017).
