Summary
ここでは、 シロイヌナズ ナの苗木の脱etiolationの初期段階におけるクロロフィル生合成モニタリング用に設計された高度なツールについて説明します。この新しい方法論は、高い空間分解能と時間分解能で非侵襲的なリアルタイムクロロフィル蛍光イメージングを提供します。
Abstract
クロロフィルの生合成は、植物のライフサイクルの中で最も劇的な段階の1つである脱エチオール化の特徴です。クロロフィル生合成の厳密に制御された非常にダイナミックなプロセスは、顕花植物の暗闇から光への移行中に引き起こされます。エチオレートされた苗木が日光の最初の痕跡にさらされた瞬間に、プロトクロロフィリドからクロロフィリドへの急速な(秒順の)変換は、ユニークな光受容タンパク質複合体によって媒介され、その後の代謝ステップを介して完全に機能するクロロフィルの生産につながります。クロロフィル含有量分析の標準的な手法には、剥離した植物組織からの色素抽出が含まれますが、このような高速プロセスの研究には適用されません。光誘起脱エチオレーション後の最初の数時間で、 生体内の クロロフィル動態を高精度かつ時空間分解能で調査するために、装置とプロトコルが開発されました。ここでは、 シロイヌナズ ナの脱エチオレーションの初期段階におけるクロロフィルの統計的に頑健な定量のために設計された詳細な手順を紹介します。
Introduction
脱エチオレーションは、植物のライフサイクルの中で最も劇的な段階であり、多くの形態学的変化と植物代謝の完全な再編成(ヘテロから自己熱帯へ)を特徴としています1。クロロフィルの生合成は、植物における光による脱エチオール化の特徴であり、非常にダイナミックなプロセスです。暗色で産生された前駆体プロトクロロフィリドからのクロロフィルの形成は、反応性副生成物による損傷を避けるために緊密に調整する必要があります2。プロトクロロフィリドのクロロフィリドへの還元は、光によって直接活性化されるユニークな酵素である光依存性プロトクロロフィリド酸化還元酵素(POR)によって触媒されます。反応は非常に速く、msからs 3のオーダーで起こり、苗の照射後数分以内に認識可能なクロロフィルの蓄積をもたらす4,5,6。葉緑体生合成が完全に機能する光合成装置を確立するには、より多くの時間(数時間から数日)が必要である3。
クロロフィル含有量の分析には、高速液体クロマトグラフィー(HPLC)や分光光度法など、さまざまな方法があります。通常、これらの技術は植物組織の破壊を要求し4,5,6、時間の経過に伴うクロロフィルレベルの変化の決定を制限します。非侵襲的なクロロフィル動態の確立を可能にする方法は、時間と空間におけるクロロフィル合成プロセスの解析などの基礎的な研究課題から、ストレス耐性の評価やクロロフィル動態に対するバイオスティミュラントの効果などのより実用的な応用に至るまで、さまざまな側面で植物を研究するためのまったく新しい視点を開く可能性があります。そこで、クロロフィル形成をモニタリングするシステム「iReenCAM7」を導入しました。CCDカメラ、発光フィルター、光源、自動蛍光分析用パイプラインを内蔵しています(図1)。開発した装置の主な特徴は、空間分解能と時間分解能が高く、現在のアプローチで使用されているパラメータを上回り、標準的な分析方法と比較して十分な感度と特異性を備えていることです7。
ここで説明する非侵襲的手順は、最小限の試薬を必要とし、簡単な手順で構成されているため、脱エチオレーションの非常に初期の段階で生きている シロイヌナズナ の苗木のクロロフィル動態プロファイルを得ることができます。従ってプロトコルは要因の数によって、外因性(塩、干ばつ、biostimulants、重金属、等)および内生(普通遺伝子の活動の変更と関連付けられる)によって影響されるクロロフィル統合の非常にダイナミックなプロセスの調査のために有用である場合もある従って付加的な圧力を避ける植物ティッシュを取り外しないで起源で。
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Protocol
1. 培地の調製
- ガラス瓶にゲル化剤0.75gと滅菌脱イオン水50mLを混合し、ペトリプレート1枚(120×120×17mm)に対して1.5%(w/v)の濃度となるように培養培地を調製する。混合物を静かに振ってから、沸騰するまで電子レンジで加熱してゲル化剤を溶かします(溶液が透明になります)。
- 次のステップに進む前に、培地を58〜60°Cまで冷ましてください。その後のすべてのステップは、汚染を防ぐために、層流フード内の無菌条件下で実行する必要があります。
- 測定中の過度の活性光反射や高いバックグラウンド自家蛍光を避けるために、遮光性エッジを備えたペトリプレートを使用してください。このためには、黒い粘着テープ(または利用可能な他の手段)を貼り付けて、空のペトリプレートのすべての側面を覆います(図2)。
- テープ貼付後、殺菌剤UVランプを20〜30分間照射してプレートの滅菌を行います。
- 実験に化学的処理(すなわち、非生物的/生物的ストレッサー、植物ホルモンおよび/または成長調節剤など)が含まれる場合は、対応する化学物質を適切な量で培地に直接添加します。選択した化学的安定性が培地に添加されることに注意してください(たとえば、化学物質が熱安定性でない場合は、プレートに注ぐ直前に培地が冷却されたときに培地に添加します)。薬品が均一に分布するように、振とうして培地を完全に混合します。
- 培地を注いだ後、プレートをUV光で照らすことは避けてください(実験に支障をきたす可能性のある酸素ラジカルの生成につながります)。
- 調製した培地を正方形のペトリプレートに注ぎ、培地を室温で固化させます。
2.種子表面の殺菌と植物の生育条件
- ストックバーク(10〜20 mg)からシ ロイヌナズナ Col-0種子を必要量取り、2 mLの微量遠心チューブに加えます。
注:異なる シロイヌナズ ナ系統(エコタイプ/変異系統)で作業する場合、特別な変更は必要ありません。鋸引きグリッドの改訂と測定手順は、種子サイズ、発芽率、および苗サイズの違いを考慮して、他の植物種に対して実行する必要があります。 - シロイヌナズナの種子をチューブに70%エタノールを2分間添加して表面殺菌します。滅菌中はチューブを静かに振ってください。
- 種子を失わないように注意しながら、ピペッティングでエタノールを除去します。チューブに滅菌水を5分間加えて種子を洗浄し、残留エタノールを取り除きます(洗浄期間中はチューブを静かに振ってください)。
- 種子を重力によってチューブの底に沈殿させ、残りの水を取り除きます。
- ステップ2.3の説明に従って、種子を滅菌水で2回再度すすぎ、エタノール特性がないことを確認します。種子を重力によってチューブの底に沈殿させ、残りの水を取り除きます。
- 種子の入ったチューブに等量の滅菌水を加えて、種子水懸濁液を作成します。
- 播種グリッドを使用して、培地プレートの選択された領域に特定の遺伝子型の種子水懸濁液を均等に分配します(図2 および 補足図1)。幅広のピペットチップを使用して、各領域に種子(約30〜40個)を一列に分配します。
- 種子エリアで水を約30分間乾燥させ、汚染を防ぐために層流フードでプレートを開いたままにします。プレートをマイクロポアテープで密封し、アルミホイルで包みます。
- 種子を暗闇で4°Cで3日間層別化し、(使用する生態型に応じて)種子の休眠を克服したり、均一な発芽を促進したりします。
- 成層種子の入ったプレートを白色光(150 μmol/m2/s)に1時間移し、発芽を誘導します(光処理の場合にのみホイルを開封します)。
- 光処理後、種子を光から保護するためにプレートをアルミホイルで包み、育成室に垂直に置き、21°Cの暗所で4日間栽培します。
3. クロロフィル蛍光測定・分析
- iReenCAMシステムの電源を入れ、自動的に起動するPSサーバーソフトウェアでシステムの準備が整っており、正しく設定されていることを確認します(例:実験データに十分なストレージスペースがあるかどうか、蛍光カメラがPCに接続されている場合など)。
- スケジューラーソフトウェアをアクティブにし、 実験>新しい実験をクリックして、測定の実験計画を作成します。実験のわかりやすい名前を入力し、詳細 (説明) を入力します。
- [ アクションの追加 ] をクリックして、実験に必要なアクションを設定し、実験アクションのスケジュールを表示します。
注:ここでのアクションという言葉は、完全な実験(つまり、1つのプレート測定を実行するために必要なすべてのステップを含む)を実行することを意味します。 - 1回のラウンド測定の条件(明暗期間の長さ)を指定します。
- 「リストを生成」(Generate List) をクリックして、測定ラウンドの間隔を定義します。ラウンドの開始時刻と終了時刻(合計4時間)とラウンド間の間隔(現在の設定では2分に1ラウンド)を選択します。
- [ 生成 ]をクリックし、画面の左側に生成されたリストをチェックして、時間枠と光インパルスの間隔が正しいことを確認します。
- 測定プロトコルを選択します(補足図2)。後で参照できるように、すべての変更をデータベースに保存します。
- 測定開始直前に、暗室内で低強度の緑色の光( 材料表を参照)を使用し、測定チャンバー内の棚のレベルを調整するか、その他の準備手順を実行してから、ペトリプレートからホイルを取り外します。次に、ライトをオフにし、完全な暗闇の中でプレートを測定チャンバーに移します。
- 生後4日の苗が入ったペトリプレートを覆っているアルミホイルを慎重に取り除きます。ペトリプレートをデバイス測定チャンバー内に水平に置きます。チャンバー内では、活性光パルスを誘導し、ステップ3.1〜3.7で設定した実験計画(アクション)に従ってイメージングを行います。
注:プレートを測定チャンバーに入れる前に、エチオレートされた苗木でプレートを照らさないようにすることが重要です。エチオレートされた苗木を含むプレートによる操作は、暗室/チャンバーで実行する必要があります(可能な実験セットアップについては、 補足図3を参照してください)。
4. データの抽出と分析
- 測定が完了したら、分析ソフトウェアで対応する実験を開きます。
- 苗木の蛍光を分析するには、苗木が配置されている領域を覆う粗い(トレイ)マスクと、目的の組織(通常は子葉)のみを覆う精密な(植物)マスクの2種類のマスクを生成します。
- トレイマスクを生成するには、[ Create New Tray Type ]オプションをクリックします。プレート画像上のそれぞれの領域に適切な遺伝子型名を割り当てます。
- 遺伝子型を割り当てるには、[ ラウンド ]で画像番号を選択し、画面上部の[ 画像の読み込み ]をクリックします。プレートの画像が画面に表示されます。さまざまな形状描画ツールを表す一連のボタンのいずれかをクリックして(補足図4)、プレート画像に関心のある領域を描画できる 新しい形状モード に入ります。必要な領域(プレート上の異なる遺伝子型など)を選択し、適切な名前を付けます。
- [ Esc ]をクリックして、形状モードを終了します。生成されたトレイマスクを(名前を付けた後で)保存するには、[ トレイタイプの保存]をクリックします。
- ステップに戻り、前のステップで生成したマスクを「 トレイタイプで変更 」オプションから名前を選択して適用します。
- プラントマスクを高精度に生成するには、180分の測定後に取得した画像(ラウンド91)を使用して、蛍光シグナル強度の最小閾値を設定し、バックグラウンドノイズを減算できるようにします。このためには、 Auto Threshold からチェックマークを外し、 Manual Threshold を0に設定します(補足図4)。
- [プレビュー]をクリックして、トレイマスクがプレート画像上の必要なすべての領域(遺伝子型)をカバーしていることを確認します。このためには、ラウンド 91 を選択し、[プレビューの更新]をクリックします。
- [ 実行] をクリックして [実行] メニューに入ります。ラウンド91のみにティックを配置して、ラウンド91のみの分析を実行します。次に、出力パスを選択し、[ 分析の開始] をクリックします。
- 分析が終了すると、[完了]メニューが自動的に開きます。実行されたラウンドを実験から選択し(唯一のラウンドになります)、アナ ライザーを分析データに切り替え て、この特定の時点(ラウンド91)のデータをエクスポートします。
- エクスポートされたアーカイブから .xsel ファイルを抽出します。このファイルには重要なプラントマスク情報が含まれているため、「 エクスポート部品を開く」(Open Export Part ) アイコンをクリックします。
- [ ローカル解析パーツを開く ]アイコンをクリックして、実験を再度開きます。 [Mask Builder ] メニューを再度開き、[ Load Image] をクリックして [round 1] を選択し、画面の右上隅にある [ Load from File ] を選択して、以前に抽出した .xsel ファイルを読み込みます。トレイマスクが適用されたプレートの画像が表示されます。
- 「 トレイタイプを保存 」をクリックしてマスクを保存し、「 トレイタイプで変更 」オプションでマスクの名前を選択して適用します。
- 蛍光シグナル強度の閾値を調整して植物マスクを生成します。[Preview]メニューで生成されたマスクが各遺伝子型のROI(子葉など)に完全に適合するまで、[Manual Threshold]の値を増やします(補足図4)。プレビューメニューでラウンド全体をスクロールして、マスクが測定のすべてのラウンドに適合するかどうかを確認します(ラウンド1、61、および121での適切なマスク位置を確認するだけで十分です)。
- すべての測定ラウンドに対して分析を実行し、データをエクスポートします。
注:出力ファイルには、各時点の特定の遺伝子型のクロロフィル蛍光値が含まれているため、選択したチャートを作成し、さらなる統計的評価を容易にします。
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Representative Results
野生型(WT)の生態型Columbia-0(Col-0)の4日齢の脱エチオレーションシロイヌナズナの苗木において、新たに開発された手順を用いて得られた典型的な出力を図3に示します。対照条件(DMSO添加MS培地)下では、クロロフィル生合成曲線はクロロフィル合成の最初のバーストから始まり、成長のスコトモルフォ形成段階で合成されたプロトクロルフィリドプールは、光によって誘起されたPOR7,8,9により迅速にクロロフィルに変換されます.高速クロロフィル蓄積の初期段階には約10分かかり、その後にラグ期が続き、その間に暗合成されたプロトクロロフィリドの最小値に達します(照射後約30分;HPLCで測定されたプロトクロロフィリド曲線については、7を参照のこと)。ラグ期には、クロロフィル生合成遺伝子がアップレギュレーションされ10、光によってプロトクロロフィリドが産生される。新たに合成されたプロトクロロフィリドは、速やかにクロロフィルに変換され、指数関数的な相として検出され(WT Col-0の場合、照射後約120分で開始)、脱エチオレーションされた苗の照射後約4時間で別の遅延相で終了します(図3)。6-ベンジルアミノプリン(BAP)の存在下では、指数関数的なフェーズ7で最初の有意差が検出され、クロロフィル生合成の後期段階(活性光による照明開始から約2時間後;図3)。
異なる条件や遺伝子型を比較するには、生データの正規化が必要です。HPLCでは、さまざまな条件下および/または異なる遺伝子型でクロロフィルが検出されなかったため、対応する処理および/または遺伝子型7について測定したT0蛍光レベル(F0)への正規化(F/F0)を行いました。正規化の重要性を実証するために、生データと、T0(F0; それぞれ図3A および 図3B)。
図1:測定装置のプロトコルの概要。 iReenCAM測定および分析パイプラインのスキーム。 (A) 暗所でのグリッド定義種子播種、成層、発芽の光誘導、垂直配向ペトリプレート培養によるサンプル調製。 (B) PlantScreen表現型SWツールボックスに基づく自動およびプログラム可能な画像取得およびデータ管理用の制御モジュールは、HW動作をユーザー定義の測定および分析プロトコルと制御および同期することにより、システム全体の動作を整理します。 (C) 測定プロトコルは、蛍光サンプル画像を2分間隔で合計4時間、つまり120回の測定ラウンドで動的に測定するように設計されています。時間180分に取得した4日齢のシロイヌナズナの苗木の鉛直配向偽色画像の時間視覚的画像は、ROIマスク生成に使用されます。 (d) 関心のある組織(例えば、子葉、胚軸、または根帯)のROIを定義するマスクを時間視覚フレームに適用し、背景減算を実行し、すべての測定ラウンドから各ROI(植物マスクによって定義される)のピクセルごとの蛍光値を抽出する。最後に、生データ(蛍光F)をT0(F0)における平均蛍光値に正規化する。スケールバー = 1 cm (A) および 0.25 cm (C)。図は7から修正されました。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図2:シードの配置。 この図は、シ ロイヌナズ ナの種子をペトリプレートに、ソーインググリッドを使用して遮光エッジで配置した状態を示しています。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図3: シロイヌナズ ナの脱エチオール化の初期段階におけるクロロフィル蓄積速度。 エチオレートWT Col-0苗木は、BAPまたはDMSO(モック)を添加した培地で栽培しました。 (A) SD(陰影領域)±平均値、生データのn=9、 (B) T0(F0)における平均蛍光値に正規化したデータ。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
補足図1:播種グリッド。 左:各遺伝子型の種子を、活性光の均一性(光強度≥最大光強度の0.7)の領域にある測定スポットに配置するための、輪郭が描かれた長方形のボックスを備えた播種グリッド。右:分析のために栽培した生後4日の シロイヌナズナ の苗木の模式図。播種グリッドは、光の均質性と適切な種子密度を確保するシ ロイヌナズナ の種子の位置決めのための可能なスキームを提供します(スロットのサイズ、スロット間の距離、およびグリッドの領域内の光の均質性が統一されているため、各スロットは種子の配置に使用できます)。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足図2:蛍光測定プロトコル。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足図3:不要な光への曝露を避けるための実験構成。(A) 測定装置はウォークインフィトトロンに、 (B) は遮光ドアで仕切られたチャンバーに置かれます。 (C) 所定の条件(温度・相対湿度)で育育つための体 外 栽培ボックス(赤矢印)を装置直下(黄色矢印)に設置し、光曝露のリスクを最小限にとどめます。緑色の薄暗い光源(青い矢印)は、制御PC(オレンジ色の矢印)の隣の壁に取り付けられています。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足図4:PSデータアナライザソフトウェアを使用したワークフローにおけるマスク生成手順。 トレイマスク(ステップ4.3-4.6)とプラントマスク(ステップ4.12)の生成とデータ分析(ステップ4.7および4.13)に対して実行する個々のステップのスクリーンショットを印刷します。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足図5:測定のばらつきに影響する播種密度。 (A)別々に(個々の苗木として、ここではn = 5)または(B)高密度(HD、n = 30-40)または(C)低密度(LD、n = 10-15)のグループで成長した、生後4日齢のシロイヌナズナWT Col-0苗木のクロロフィル蓄積速度。 nは播種グリッドのスロット当たりの苗数に相当し、データはSD(斜線領域)±平均値を表す。高密度または低密度は、前述のように、播種グリッドのスロットあたりの苗木の数に対応します。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足図6:培養間隔とスペースには、種ごとの最適化が必要です。 シロイヌナズナに最適化されたプロトコルを使用したさまざまな植物種の成長。(A)播種グリッドへの種子の配置。(B)シロイヌナズナ、アブラナ属、クランベ・アビシニカの生後4日齢のエチオレート苗。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
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Discussion
プロトコルとトラブルシューティングの重要なステップ-ライトなしとマスクの世話
上記のプロトコルの説明で直接強調されているように、エチオレートされた植物の苗の栽培中またはプロトコルを開始する直前の両方で、微量の光さえも避けることは非常に重要です11。私たちのセットアップでは、ウォークインフィトトロンに配置され、光密回転ドアでフィトトロンの残りの部分から分離された専用のダークチャンバーを使用します(補足図3)。チャンバーには植物栽培スペースと作業台が装備されており、制御PCとドラフトと一緒に装置を収容できます。これにより、暗闇の中で植物を育てることができ、プレートの輸送を必要とせずに測定を開始することができます。
植物の栽培とマスクの生成方法は、提案されたアッセイを介してクロロフィル蛍光シグナルを定量化するために重要です。ゲル化剤の塊や小さな視覚的なゴミ/ほこりがメディアに付着すると、光の反射が発生する可能性があるため、避けてください。ソフトウェアによるクロロフィル蛍光の認識はマスクによって制限されるため、マスクでカバーされない植物領域はソフトウェアで分析されません。4時間の測定中、苗木は少し成長/移動するため、正確な信号強度の定量化のためにすべての測定ラウンドに収まらない可能性があるため、指定されたマスクは調整が必要になる場合があります。私たちの経験によると、不完全なマスク定義がばらつきの主な原因であるように思われます。最適化実験では、(1)高密度(30-40種子)と低密度(10-15種子)の苗木群について、分析に用いたクロロフィル蛍光値のばらつきの変化をモニターしました(補足図5)。種まきの密度は変動が最も少ないため、より高密度で使用しました。個々の苗木/低密度の播種の場合に見られる大きな変動性は、主に信号と背景の間の端に位置するピクセルの割合が高いことと、4時間の測定間隔中の苗木のわずかな動きに起因します。
すべての測定値が正確であることを確認するには、植物マスクが最初のラウンドに適合するかどうかを確認し、次に15番目、30番目、45番目、60番目 、75番目 など、最後のラウンドまで(ラウンドの番号を選択して[ プレビューの更新]をクリックすることにより)を確認します。これには数分しかかかりませんが、子葉エリア全体がカバーされ、評価されていることが保証されます。どのラウンドでも植物マスクが合わない(必要な領域が完全にカバーされていない)場合は、実験をいくつかの部分に分けます。次に、ステップ4(4.1-4.13)からプロトコルを実行して、実験の各部分に個別のマスクを作成します。たとえば、ラウンド60-61(またはそれより少し前)で植物マスクの変位に気付いた場合は、実験を2つの部分に分けます-第1パート( 1-60ラウンド)と第2パート( 61-121ラウンド)。第1 部では ラウンド 41 の画像を使用して植物マスクを生成し、第2 部では ラウンド 91 を使用します。ステップ4.13でデータを分析するときは、 分析をクリックする前に、実験の対応する部分(たとえば、最初の部分に1〜60、2番目の部分に61〜121)に従ってラウンドを選択するように注意してください。 シロイヌナズナを扱う場合、植物の成長はかなり遅いため、植物の動きはごくわずかですが、異なる種(下記参照)にプロトコルを適用する場合は、成長ペースを考慮する必要があります。
変更と制限
活性光の強度と波長、および/または活性光の適用間隔の間に照射される光など、パラメータの数を変更することができます。測定装置には、完全に電動化されたソフトウェア制御のフィルターホイールが内蔵されています。したがって、他の色素、典型的にはテトラピロール生合成経路10、12の生成物も定量化に適した測定アルゴリズムは、適切なフィルターを添加する場合にプロトコルに含まれ得る。
また、前述したように、このプロトコルは シロイヌナズ ナの植物だけでなく、使用することができます。ただし、他の植物種を扱う場合は、発芽率や成長率、サイズなど、種固有の特徴を考慮して、プロトコルの各ステップを適宜改訂する必要があります(補足図6)。
プロトコルの重要な制限の1つは、クロロフィル定量分析を実行できる期間です。クロロフィルが光化学系複合体に組み込まれた後、蛍光シグナルは、脱エチオレーションの後期段階で観察されたように、光合成エネルギー消費(いわゆる可変クロロフィル蛍光が存在するものが存在する)によって偏るようになる13。OJIPトランジェントアッセイ14,15を用いてアッセイしたように、脱エチオレーション7の最初の4時間の間、この実験装置を用いて光合成活性の兆候は検出されなかった。ただし、光形態形成の長期間をアッセイする必要があると想定される場合は、光化学系の組み立てのレベルと、全体的な蛍光レベルに対する光合成の影響の可能性をテストする必要があります。
最後に、蛍光測定に基づく当社のプロトコルでは、クロロフィルの絶対定量ではなく、相対的な定量が可能であることに言及する必要があります。絶対定量が必要な場合は、HPLCアプローチなどの代替法を使用して対応するキャリブレーションを実施する必要があります。
既存の方法に対する重要性 - 高い時間分解能と空間分解能による、単純、迅速、統計的に頑健なクロロフィル定量
ここで説明する手順により、脱etiolationの初期段階における生きているシロイヌナズナの苗木のクロロフィルのリアルタイム検出と定量が可能になります。剥離した植物材料からのクロロフィル抽出16,17や最近開発された光学的方法18,19に大きく依存する他のアプローチと比較して、このアプローチは純粋に非侵襲的であり、蛍光強度のin vivo測定によるクロロフィル定量を可能にします。また、前述のHPLCまたは分光光度法ベースのアプローチを含む他の既存の代替方法のように、サンプル調製に必要な追加の試薬は必要ありません。新しく導入されたプロトコルは、以前にHPLC5を使用して検証されたように、シンプル、高速、正確です。標準的なプロトコル設定を使用して、1回の生物学的反復の最終曲線は、測定の4時間の間に取得された120の測定ポイント(蛍光強度手段)から作成され、それぞれが最大15の測定スポットで構成されます。典型的には、最終曲線は、3つの生物学的レプリカ(例えば、3つの独立して調製されたプレート)と、3つの測定スポット(3つの技術的レプリカ)のデータを含むが、それぞれ30〜40個の苗木からなる。したがって、各時間間隔で約300の苗木がアッセイされ、統計的に堅牢なデータセットを提供し、クロロフィル生合成のさまざまなステップで影響を受けた変異体で実証されたように、わずかな違いでも確実に検出することができます7。ここでは、クロロフィル動態データ解析20に適したツールとして、古典的時系列モデルと組み合わせた一般化線形混合モデルに基づく最近開発された統計的アプローチを採用することをユーザーに奨励する。
この技術の将来の応用 - 迅速で安価なスクリーニング
前述の特徴により、このアプローチは、クロロフィル生合成に関連する形質の迅速かつ安価なスクリーニングと高精度の定量化に適した有用なツールになります。これには、クロロフィル生合成の複雑で多段階の調節をよりよく特徴付けるために、前方遺伝子スクリーニングを採用した研究が含まれる可能性があります10,12,21。さまざまな化合物処理の可能性を考慮すると、このプロトコルは、たとえば、光を介したホルモン調節の重要性22,23や、クロロフィル蓄積動態に影響を与える可能性のある低分子化合物のスクリーニングを研究するためにも非常に価値があります。
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Disclosures
Z.B.とK.P.はPSIの従業員であり、Martin TrtilekはiReenCAMを製造するPSI社のCEO兼オーナーです。これらすべての著者は、前述のように機器の開発に関与しました7。
Acknowledgments
本研究は、欧州地域開発基金プロジェクト「SINGING PLANT」(No.CZ.02.1.01/0.0/0.0/16_026/0008446)。このプロジェクトは、欧州連合(EU)が資金提供するMSCA4Ukraineプロジェクト(ID 1233580)を通じて資金提供を受けています。 図 1 のグラフィカルなデザインをしてくれた Lenka Sochurkova に感謝します。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6-benzylaminopurine | Duchefa Biochemie | B0904.0001 | |
| Aluminum foil | Merck | Z691577 | |
| Arabidopsis thaliana Col-0 seeds | NASC collection | N1092 | |
| Cultivation chamber | PSI | custom made | |
| Dimethilsulfoxid | Thermo Fisher Scientific | 042780.AK | |
| Eppendorf single-channeled, variable (100-1000 μL) | Merck | EP3123000063 | |
| Gelrite | Duchefa Biochemie | G1101 | |
| iReenCAM device | PSI | custom made/prototype | |
| Laboratory bottles, with caps (Duran), 100mL | Merck | Z305170-10EA | |
| Laminar-flow box | UniGreenScheme | ITEM-31156 | |
| Linerless Rubber Splicing Tape, 19 mm width, black, Scotch | 3M Science. Applied to Life | 7000006085 | |
| Microcentrifuge tube, 2 mL with lid, PPT, BRAND | Merck | BR780546-500EA | |
| Micropore tape | 3M Science. Applied to Life | 7100225115 | |
| Osram lumilux green l18w/66 | Ovalamp | 200008833 | |
| Petri plates - Greiner dishes, square, 120 x 120 x17mm, vented | Merck | Z617679-240EA | |
| Pipet tips, 1000 μL, Axygen | Merck | AXYT1000B | |
| The Plant Screen Data Analyzer software | PSI | delivered as a part of the iReenCAM |
References
- Arsovski, A. A., Galstyan, A., Guseman, J. M., Nemhauser, J. L.
- Reinbothe, S., Reinbothe, C., Apel, K., Lebedev, N. Evolution of chlorophyll biosynthesis--the challenge to survive photooxidation. Cell. 86 (5), 703-705 (1996).
- Heyes, D. J., et al. Photocatalysis as the 'master switch' of photomorphogenesis in early plant development. Nat Plants. 7 (3), 268-276 (2021).
- Hu, X. Y., Tanaka, A., Tanaka, R. Simple extraction methods that prevent the artifactual conversion of chlorophyll to chlorophyllide during pigment isolation from leaf samples. Plant Methods. 9 (1), 19 (2013).
- Chazaux, M., Schiphorst, C., Lazzari, G., Caffarri, S. Precise estimation of chlorophyll a, b and carotenoid content by deconvolution of the absorption spectrum and new simultaneous equations for chl determination. Plant J. 109 (6), 1630-1648 (2022).
- Marr, I. L., Suryana, N., Lukulay, P., Marr, M. I. Determination of chlorophyll-a and chlorophyll-b by simultaneous multicomponent spectrophotometry. Fresenius J Anal Chem. 352 (5), 456-460 (1995).
- Balakhonova, V., et al. Ireencam: Automated imaging system for kinetic analysis of photosynthetic pigment biosynthesis at high spatiotemporal resolution during early deetiolation. Front Plant Sci. 14, 1093292 (2023).
- Virgin, H. I., Kahn, A., Vonwettstein, D. The physiology of chlorophyll formation in relation to structural changes in chloroplasts. Photochem Photobiol. 2 (2), 83-91 (1963).
- Reinbothe, C., et al. Chlorophyll biosynthesis: Spotlight on protochlorophyllide reduction. Trends Plant Sci. 15 (11), 614-624 (2010).
- Kobayashi, K., Masuda, T. Transcriptional regulation of tetrapyrrole biosynthesis in arabidopsis thaliana. Front Plant Sci. 7, 1811 (2016).
- Wang, Y., Folta, K. M. Contributions of green light to plant growth and development. Am J Bot. 100 (1), 70-78 (2013).
- Brzezowski, P., Richter, A. S., Grimm, B. Regulation and function of tetrapyrrole biosynthesis in plants and algae. Biochim Biophys Acta. 1847 (9), 968-985 (2015).
- Pipitone, R., et al. A multifaceted analysis reveals two distinct phases of chloroplast biogenesis during de-etiolation in arabidopsis. eLife. 10, e62709 (2021).
- Stirbet, A. G. On the relation between the kautsky effect (chlorophyll a fluorescence induction) and photosystem ii: Basics and applications of the ojip fluorescence transient. J Photochem Photobiol B-Biol. 104 (1-2), 236-257 (2011).
- Kupper, H., et al. Analysis of ojip chlorophyll fluorescence kinetics and q(a) reoxidation kinetics by direct fast imaging. Plant Physiol. 179 (2), 369-381 (2019).
- Avin-Wittenberg, T., et al. Global analysis of the role of autophagy in cellular metabolism and energy homeostasis in arabidopsis seedlings under carbon starvation. Plant Cell. 27 (2), 306-322 (2015).
- Kósa, A., Preininger, É, Böddi, B. Nitrogen deficiency hinders etioplast development in stems of dark-grown pea (pisum sativum) shoot cultures. Physiol Plant. 155 (3), 330-337 (2015).
- Liang, Y., et al. A nondestructive method to estimate the chlorophyll content of arabidopsis seedlings. Plant Met. 13 (1), 26 (2017).
- Pérez-Patricio, M., et al. Optical method for estimating the chlorophyll contents in plant leaves. Sensors. 18 (2), 650 (2018).
- Spyroglou, I., et al. Mixed models as a tool for comparing groups of time series in plant sciences. Plants (Basel). 10 (2), (2021).
- Tanaka, R., Kobayashi, K., Masuda, T.
- De Wit, M., Galvao, V. C., Fankhauser, C. Light-mediated hormonal regulation of plant growth and development. Annu Rev Plant Biol. 67, 513-537 (2016).
- Liu, X., Li, Y., Zhong, S. Interplay between light and plant hormones in the control of arabidopsis seedling chlorophyll biosynthesis. Front Plant Sci. 8, 1433 (2017).
