Summary
在这里，我们描述了一种先进的工具，用于在 拟南芥 幼苗脱硫的早期阶段监测叶绿素生物合成。该新方法在高空间和时间分辨率下提供非侵入性实时叶绿素荧光成像。
Abstract
叶绿素生物合成是脱硫的标志，脱叶醇是植物生命周期中最引人注目的阶段之一。叶绿素生物合成的严格控制和高度动态的过程是在开花植物从黑暗到光明的转变过程中触发的。在幼苗暴露在第一丝阳光下的那一刻，原叶绿素的快速（以秒为单位）转化为叶绿素是由独特的光接受蛋白复合物介导的，通过随后的代谢步骤导致产生功能齐全的叶绿素。叶绿素含量分析的标准技术包括从分离的植物组织中提取色素，这不适用于研究这种快速过程。为了在光诱导的去乙醇化后的最初几个小时内以高精度和时空分辨率研究 体内 叶绿素动力学，开发了一种仪器和方案。在这里，我们提出了一个详细的程序，旨在在 拟南芥 去乙醇化的早期阶段对叶绿素进行统计学上的稳健定量。
Introduction
去乙醇化是植物生命周期中最引人注目的阶段，其特征是植物新陈代谢（从异性到自热带）的许多形态变化和完全重排1。叶绿素生物合成是植物光诱导的脱硫的标志，也是一个非常动态的过程。从深色产生的前体原叶绿素形成的叶绿素必须紧密协调，以避免由于反应性副产物造成的损害 2.原叶绿素还原为叶绿素是由光依赖性原叶绿素氧化还原酶（PORs）催化的，PORs是直接由光激活的独特酶。反应速度非常快，以 ms 到s 3 的量级发生，导致在辐照幼苗后几分钟内可识别的叶绿素积累 4,5,6。叶绿体生物发生需要更多的时间（从几小时到几天）来建立功能齐全的光合作用装置3.
有多种方法可以分析叶绿素含量，包括高效液相色谱法（HPLC）或分光光度法。通常，这些技术需要破坏植物组织4,5,6，限制了叶绿素水平随时间变化的测定。允许非侵入性叶绿素动力学建立的方法可能为研究植物开辟一个全新的视角，从基础研究问题，如分析叶绿素合成过程在时间和空间上，到更实际的应用，如评估胁迫耐受性或生物刺激剂对叶绿素动力学的影响。考虑到这一点，我们引入了一种监测叶绿素形成的系统，即iReenCAM7。它集成了 CCD 相机、发射滤光片、光源和用于自动荧光分析的管道（图 1）。所开发的设备的主要特点是空间和时间分辨率高，在当前方法中使用的参数中表现出色，并且与标准分析方法相比具有足够的灵敏度和特异性7。
这里描述的非侵入性程序需要最少的试剂，包括简单的步骤，允许在脱硫的早期阶段获得活 拟南芥 幼苗的叶绿素动力学谱。该方案可用于研究叶绿素合成的高动态过程，该过程受许多因素的影响，包括外源性（盐，干旱，生物刺激剂，重金属等）和内源性（通常与基因活性的变化有关）起源，而无需分离任何植物组织，从而避免额外的压力。
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Protocol
1.培养基制备
- 通过在玻璃瓶中将 0.75 g 胶凝剂与 50 mL 无菌去离子水混合来制备培养基，以达到一个培养皿 （120 x 120 x 17 mm） 的 1.5% （w/v） 浓度。轻轻摇晃混合物，然后在微波炉中加热至沸腾以溶解胶凝剂（溶液变得清澈）。
- 在继续下一步之前，让培养基冷却至58-60°C。所有后续步骤必须在层流罩内的无菌条件下进行，以防止污染。
- 使用具有耐光边缘的培养皿，以避免在测量过程中出现过度的光化光反射和高背景自发荧光。为此，使用黑色胶带（或其他可用的方法）覆盖空培养皿的所有侧面（图2）。
- 胶带应用后，用杀菌紫外线灯照射20-30分钟，对板进行灭菌。
- 如果实验涉及化学处理（即非生物/生物应激源、植物激素和/或生长调节剂等），则将适量的相应化学物质直接添加到培养基中。请注意将所选的化学稳定性添加到培养基中（例如，如果化学品不具有热稳定性，则在将其倒入板中之前将其冷却后添加到培养基中）。通过振荡充分混合培养基，以确保化学品均匀分布。
- 倒入介质后，避免将板照射到紫外光下（会导致氧自由基的产生，从而干扰实验）。
- 将制备好的培养基倒入方形培养皿中，让培养基在室温下凝固。
2.种子表面灭菌和植物生长条件
- 从储备液（10-20mg）中获取所需量的 拟南芥 Col-0种子，并将其加入2mL微量离心管中。
注意：使用不同的 拟南芥 品系（生态型/突变品系）时无需进行特定修改。考虑到种子大小、发芽率和幼苗大小的差异，应对其他植物物种进行锯切网格的修改和测量步骤。 - 通过向试管中加入70%乙醇2分钟来对 拟南芥 种子进行表面灭菌。灭菌过程中轻轻摇晃试管。
- 小心移液除去乙醇，注意不要丢失任何种子。通过向试管中加入无菌水5分钟来洗涤种子，以除去任何残留的乙醇（在洗涤期间轻轻摇晃试管）。
- 让种子在重力作用下沉淀到管底，除去剩余的水分。
- 如步骤2.3所述，再次用无菌水冲洗种子2次，以确保它们不含任何乙醇特性。让种子在重力作用下沉淀到管底，除去剩余的水分。
- 在装有种子的试管中加入等体积的无菌水，以产生种子水悬浮液。
- 使用播种网格将给定基因型的种子-水悬浮液均匀分布在培养基板的选定区域（图2 和 补充图1）。使用宽移液管吸头将种子（约30-40个）排在每个区域。
- 让种子区域的水干燥约 30 分钟，在层流罩中保持板打开以防止污染。用微孔胶带密封板，并用铝箔包裹。
- 在黑暗中在4°C下将种子分层3天，以（取决于所使用的生态型）克服种子休眠和/或促进均匀发芽。
- 将带有分层种子的板转移到白光（150μmol/m2 / s）下1小时以诱导发芽（仅展开箔片进行光处理）。
- 光处理后，用铝箔包裹板以保护种子免受光照，并将其垂直放置在生长室中，并在21°C的黑暗中培养4天。
3. 叶绿素荧光测量与分析
- 打开iReenCAM系统，确保系统已准备就绪，并在自动启动的PS服务器软件中正确配置（例如，如果有足够的存储空间用于实验数据，如果荧光相机连接到PC等）。
- 通过单击 “实验”（Experiments） >“新建实验”（New Experiment），激活 Scheduler 软件以创建测量的实验计划。为实验提供描述性名称并填写详细信息（描述）。
- 通过单击 “添加操作 ”来设置实验所需的操作，这将导致实验操作的计划。
注意：这里的“操作”一词是指执行一个完整的实验（即，包括执行一次板测量所需的所有步骤）。 - 指定单轮测量的条件（即光/暗周期的长度）。
- 通过单击 “生成列表”（Generate List ），定义测量轮次之间的时间间隔。选择回合开始和结束的时间（总共 4 小时）和回合之间的间隔（在当前设置中每 2 分钟一轮）。
- 单击 “生成 ”，通过检查屏幕左侧生成的列表，确保光脉冲之间的时间范围和间隔正确。
- 选择测量方案（补充图2）。保存对数据库的所有修改以备将来参考。
- 在测量开始之前，在暗室内使用低强度的绿光（见 材料表），并在从培养皿上取下箔片之前调整测量室内架子的水平或执行其他准备步骤。然后关掉灯，在完全黑暗的情况下将板转移到测量室中。
- 小心地取下覆盖含有 4 天龄幼苗的培养皿的铝箔。将培养皿水平放置在设备测量室内。在腔室内，诱导光化光脉冲，并根据步骤3.1-3.7中设定的实验计划（动作）进行成像。
注意： 在将幼苗放入测量室之前，避免对带有幼苗的板进行任何照明至关重要。必须在暗室/暗室中对带有幼苗的板进行操作（有关可能的实验设置，请参阅 补充图3）。
4. 数据提取与分析
- 完成测量后，在分析仪软件中打开相应的实验。
- 为了分析幼苗的荧光，生成两种类型的掩膜 - 覆盖幼苗所在区域的粗糙（托盘）掩膜，以及仅覆盖感兴趣组织（通常是子叶）的精确（植物）掩膜。
- 通过单击 “创建新托盘类型 ”选项生成纸盒掩膜。将适当的基因型名称分配给板图像上的相应区域。
- 要分配基因型，请在 “四舍五入 ”中选择图像编号，然后单击屏幕上部的 “加载图像 ”。盘子的图像将显示在屏幕上。通过单击表示不同形状绘图工具（补充图 4）的任意一组按钮，进入允许在板图像上绘制感兴趣区域 的新形状模式 。选择必要的区域（例如，平板上的不同基因型）并提供适当的命名。
- 单击 Esc 退出形状模式。通过单击 “存储托盘类型”保存生成的托盘掩码（在为其提供名称后）。
- 返回一个步骤，通过从“ 按托盘类型更改 ”选项中选择其名称来应用在前面步骤中生成的蒙版。
- 为了生成高精度的植物掩膜，请使用测量 180 分钟后（第 91 轮）后获取的图像设置荧光信号强度的最小阈值，从而实现背景噪声减法。为此，请从 “自动阈值 ”中删除勾号，并将 手动阈值 设置为 0（补充图 4）。
- 单击 “预览”（Preview ），确保托盘掩模覆盖孔板图像上的所有必要区域（基因型）。为此，请选择第 91 轮，然后单击 刷新预览。
- 单击 “运行”进入“运行”菜单。仅在第 91 轮上打勾，专门针对第 91 轮运行分析。然后选择输出路径，然后单击 开始分析。
- 分析完成后，“完成”菜单将自动打开。从实验中选择已执行的回合（这将是唯一的回合），然后单击 “将分析器切换到分析数据 ”以导出此特定时间点（第 91 回合）的数据。
- 从导出的存档中提取 .xsel 文件，因为此文件包含基本的植物掩模信息，方法是单击 “打开导出零件” 图标。
- 单击“ 打开局部分析零件 ”图标重新打开实验。再次进入 Mask Builder 菜单，单击 Load Image，选择 round 1，然后选择屏幕右上角的 Load from File ，然后加载之前提取的 .xsel 文件。印版的图像将在应用托盘掩膜的情况下显示。
- 通过单击 “存储托盘类型 ”保存蒙版，并通过在 “按托盘类型更改 ”选项中选择其名称来应用蒙版。
- 通过调整荧光信号强度阈值生成植物掩模。增加 手动阈值 ，直到 预览菜单中 生成的掩模完全符合每个基因型的 ROI（例如子叶）（补充图 4）。通过 在预览 菜单中滚动整个回合来检查掩模是否适合所有回合的测量（检查第 1、61 和 121 回合的掩模位置是否正确就足够了）。
- 对所有测量轮次进行分析并导出数据。
注意：输出文件包括每个时间点给定基因型的叶绿素荧光值，从而能够构建选择的图表并促进进一步的统计评估。
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Representative Results
图3显示了在野生型（WT）生态型Columbia-0（Col-0）的4日龄去乙酸化拟南芥幼苗中使用新开发的程序获得的典型输出。在对照条件下（补充DMSO的MS培养基），叶绿素生物合成曲线从叶绿素合成的初始爆发开始，其中在生长的异形形成阶段合成的原虫叶库由于光诱导的PORs而迅速转化为叶绿素7,8,9.快速叶绿素积累的初始阶段大约需要10分钟，然后是滞后阶段，在此期间达到暗合成的原叶绿素的最小值（辐照后约30分钟;HPLC测量的原叶绿素曲线，见7）。在滞后期，叶绿素生物合成基因上调10，导致光诱导的原叶绿素产生。新合成的原叶绿素迅速转化为叶绿素，可检测为指数阶段（在辐照后约120分钟开始WT Col-0的情况下），在去电化幼苗辐照后约4小时以另一个滞后阶段结束（图3）。在6-苄基氨基嘌呤（BAP）存在下，在指数阶段7期间可检测到第一个显着差异，表明BAP在叶绿素生物合成的后期阶段（在光化光开始照明后约2小时;图3）。
为了比较不同的条件和/或基因型，需要对原始数据进行归一化。由于在各种条件下使用HPLC和/或不同基因型在叶绿化幼苗中未检测到叶绿素，因此我们对相应处理和/或基因型7测量的T0荧光水平（F0）进行了归一化（F/F0）。为了证明归一化的重要性，我们提供了原始数据和归一化为在T0（F0; 图3A 和 图3B）。
图 1：测量设备协议概述。 iReenCAM测量和分析流水线的方案。 （A） 通过网格定义的种子播种、分层、光诱导发芽和在黑暗中垂直定向培养皿培养进行样品制备。 （B） 基于PlantScreen表型软件工具箱的自动可编程图像采集和数据管理控制模块，通过控制硬件操作并将其与用户定义的测量和分析协议同步，组织整个系统的操作。 （C） 测量协议设计用于以 2 分钟的间隔对荧光样品图像进行动态测量，总共 4 小时，即 120 轮测量。在180 min时间获得的垂直方向4日龄拟南芥幼苗的代表性伪彩色图像的时间视觉框架用于ROI掩膜生成。 （D） 在时间视觉框架上应用定义感兴趣组织（例如子叶、下胚轴或根区）的 ROI 的掩膜，执行背景减法并提取来自所有测量轮的每个 ROI（由植物掩膜定义）的逐像素荧光值。最后，将原始数据（荧光F）归一化为T0（F0）处的平均荧光值。比例尺 = 1 cm （A） 和 0.25 cm （C）。该数字从7修改而来。 请点击这里查看此图的较大版本.
图 2：种子放置。 该图显示了使用锯切网格将 拟南芥 种子放置在具有轻密边缘的培养皿上。 请点击这里查看此图的较大版本.
图3： 拟南芥 去乙醇化早期阶段的叶绿素积累动力学。 在补充了BAP或DMSO（模拟）的培养基上生长了经过处理的WT Col-0幼苗。 （A） SD（阴影区域）的平均值±原始数据的 n=9， （B） 数据归一化为 T0 （F0） 处的平均荧光值。 请点击这里查看此图的较大版本.
补充图1：播种网格。 左：播种网格，带有轮廓的矩形框，用于将每个基因型的种子放入位于光化光均匀性区域（光强度≥最大光强度的 0.7）的测量点中。右图：为分析而种植的 4 天龄 拟南芥 幼苗的示意图。播种网格为 拟南芥 种子定位提供了一种可能的方案，确保了光的均匀性和适当的种子密度（每个插槽可用于种子放置，因为槽的大小、槽之间的距离和网格区域的光均匀性是统一的）。 请点击此处下载此文件。
补充图2：荧光测量方案。请点击此处下载此文件。
补充图 3：实验配置允许避免不必要的光照射。（A） 将测量装置放置在步入式植物加速器 中，（B） 由光密门隔开的腔室。 （C） 在规定条件（温度和相对湿度）下，专用用于幼苗生长的 体外 培养箱（红色箭头）放置在设备（黄色箭头）下方，确保将光照风险降至最低。绿色暗光源（蓝色箭头）安装在控制 PC 旁边的墙上（橙色箭头）。 请点击此处下载此文件。
补充图 4：使用 PS 数据分析器软件在工作流程中生成模板的过程。 打印托盘掩模（步骤4.3-4.6）和植物掩模（步骤4.12）生成和数据分析（步骤4.7和4.13）要执行的各个步骤的屏幕截图。 请点击此处下载此文件。
补充图5：播种密度影响测量变异性。 叶绿素积累动力学在 4 日龄的 拟南芥 WT Col-0 幼苗 中分别生长 （A） 单独（作为单个幼苗，此处 n=5）或一组 （B） 高 （HD， n=30-40） 或 （C） 低密度 （LD， n=10-15）。 n对应于播种网格每个槽的幼苗数，数据表示SD（阴影区域±的平均值）。如前所述，高密度或低密度对应于播种网格每个槽的幼苗数量。 请点击此处下载此文件。
补充图6：栽培间隔和空间需要针对特定物种进行优化。 使用 拟南芥优化方案生长各种植物物种。 （A） 在播种网格上放置种子。 （B） 拟 南芥（Arabidopsis thaliana）、 芸苔型油菜（Brassica napus ）和 Crambe abyssinica的4日龄幼苗。 请点击此处下载此文件。
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Discussion
协议的关键步骤和故障排除 - 没有光并照顾好口罩
正如上面的协议描述中直接强调的那样，在栽培植物幼苗期间或开始协议之前，即使是微量的光也至关重要11.在我们的设置中，我们使用位于步入式植物加速器中的专用暗室，并通过光密旋转门与植物加速器的其余部分隔开（补充图 3）。该腔室配备了植物栽培空间和工作台，可以将设备与控制PC和通风柜一起容纳。这使我们能够在黑暗中种植植物并开始测量，而无需运输板。
植物栽培和掩膜的产生方式对于通过所提出的测定法对叶绿素荧光信号的后续定量至关重要。应避免在介质中沾上胶凝剂团块或小的视觉垃圾/灰尘，因为它可能会导致光反射。由于软件对叶绿素荧光的识别受到掩模的限制，因此不会被掩模覆盖的植物区域根本不会被软件分析。在 4 小时的测量过程中，幼苗会生长/移动一点，因此指定的掩模可能需要调整，因为它可能不适合所有测量轮次以进行准确的信号强度量化。根据我们的经验，不完美的掩码定义似乎是变异性的主要来源。在优化实验期间，我们监测了i）单个幼苗和一组幼苗的叶绿素荧光值变异性的变化，其中ii）较高（30-40粒种子）和iii）较低（10-15粒种子）密度播种（补充图5）。我们使用了更高密度的种子播种，因为它显示出最低的变异性。在单个幼苗/较低密度播种的情况下，较高的可变性主要源于位于信号和背景之间边缘的较高比例的像素以及幼苗在 4 小时测量间隔内的轻微移动。
为确保所有测量值准确无误，请检查植物掩模是否适合第一轮，然后检查第 15轮、第 30轮、第 45轮、第 60轮 、第 75轮 ，依此类推，直到最后一轮（通过选择轮次编号并单击 刷新预览）。这只需要几分钟，但将确保覆盖和评估整个子叶区域。如果在任何一轮植物面膜上都不适合（所需区域未完全覆盖），请将实验分成几个部分。然后执行从步骤4（4.1-4.13）开始的协议，为实验的每个部分分别创建一个特定的掩模。例如，如果您注意到植物面具在 60-61 轮（或稍早）时位移，请将实验分为两部分 -第一 部分（1-60 轮）和第二部分（ 61-121 轮）。对于第 1 部分，使用第 41 轮的图像生成植物面具，对于第 2 部分，使用第 91 轮。在步骤 4.13 中，在分析数据时，请注意根据实验的相应部分选择轮次（例如，第一部分的轮次为 1-60，第二部分的轮次为 61-121，如前例所示），然后单击 “分析”。当使用 拟南芥时，植物的运动可以忽略不计，因为它们的生长速度相当缓慢，但如果将方案应用于不同的物种（见下文），则应考虑生长速度。
修改和限制
可以修改参数的数量，包括光化光的强度和波长和/或光化光应用间隔之间施加的光。测量设备包括集成式、全电动和软件控制的滤光片转轮。因此，在添加适当过滤器的情况下，适用于定量其它色素的测量算法，通常也是四吡咯生物合成途径10,12的产物。
此外，如前所述，该协议不仅可以用于 拟南芥 植物。然而，当与其他植物物种合作时，应考虑到物种的特定特征，包括发芽和生长速度和/或大小，相应地修改协议的每个步骤（补充图6）。
该协议的一个重要限制是时间跨度，在此期间可以进行叶绿素定量分析。在叶绿素整合到光系统复合物中后，荧光信号因光合作用能量消耗（存在所谓的可变叶绿素荧光）而偏置，正如在去叶绿素化的后期阶段所观察到的那样13。如使用OJIP瞬态测定14,15测定，在脱硫7的前4小时内，使用该实验装置未检测到光合活性的迹象。然而，如果假定/有必要测定光形态发生的延长时间，则应测试光系统组装的水平和光合作用对整体荧光水平的可能影响。
最后，应该提到的是，我们基于荧光测量的方案允许相对而不是绝对叶绿素定量。如果需要绝对定量，则必须使用替代方法（例如HPLC方法）进行相应的校准。
与现有方法相比具有重要意义 - 简单、快速且具有高时间和空间分辨率的具有统计学上稳健的叶绿素定量
这里描述的程序允许在脱硫的早期阶段实时检测和定量活拟南芥幼苗中的叶绿素。与主要依靠从分离的植物材料中提取叶绿素16,17或最近开发的光学方法18,19的其他方法相比，这种方法是纯非侵入性的，允许通过体内测量荧光强度来定量叶绿素。此外，与其他现有的替代方法（包括上述基于HPLC或分光光度法的方法）一样，样品制备不需要额外的试剂。新推出的实验方案简单、快速、准确，正如之前使用HPLC5验证的那样。使用标准方案设置，单个生物重复序列的最终曲线由在测量的4小时内采集的120个测量点（荧光强度平均值）组成，每个测量点由多达15个测量点组成。通常，最终曲线包括三个生物复制品（例如，三个独立制备的板）和三个测量点（三个技术复制品）的数据，每个测量点由 30-40 株幼苗组成。因此，在每个时间间隔内测定了大约 300 株幼苗，提供了统计上稳健的数据集，甚至可以可靠地检测在叶绿素生物合成的各个步骤中受影响的突变体所证明的微小差异7。在这里，我们鼓励用户采用最近开发的基于广义线性混合模型的统计方法，并结合经典时间序列模型，作为叶绿素动力学数据分析的合适工具20。
该技术的未来应用 - 快速和廉价的筛选
上述特点使这种方法成为一种有用的工具，适用于快速、廉价的筛选和高度精确地定量与叶绿素生物合成相关的性状（直接或间接）。这可能包括采用正向遗传筛选的研究，以更好地表征叶绿素生物合成的复杂和多层次调控10,12,21。考虑到各种化合物处理的可能性，该方案对于研究例如光介导的激素调节22,23或筛选可能影响叶绿素积累动力学的低分子化合物的重要性也非常有价值。
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Disclosures
Z.B. 和 K.P. 是 PSI 的员工，Martin Trtilek 是生产 iReenCAM 的 PSI 公司的首席执行官和所有者。如前所述，所有这些作者都参与了该仪器的开发7.
Acknowledgments
这项工作得到了欧洲区域发展基金项目SINGING PLANT（No.CZ.02.1.01/0.0/0.0/16_026/0008446）。该项目已通过由欧盟资助的MSCA4Ukraine项目（ID 1233580）获得资金。我们感谢 Lenka Sochurkova 提供 图 1 的图形设计。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6-benzylaminopurine | Duchefa Biochemie | B0904.0001 | |
| Aluminum foil | Merck | Z691577 | |
| Arabidopsis thaliana Col-0 seeds | NASC collection | N1092 | |
| Cultivation chamber | PSI | custom made | |
| Dimethilsulfoxid | Thermo Fisher Scientific | 042780.AK | |
| Eppendorf single-channeled, variable (100-1000 μL) | Merck | EP3123000063 | |
| Gelrite | Duchefa Biochemie | G1101 | |
| iReenCAM device | PSI | custom made/prototype | |
| Laboratory bottles, with caps (Duran), 100mL | Merck | Z305170-10EA | |
| Laminar-flow box | UniGreenScheme | ITEM-31156 | |
| Linerless Rubber Splicing Tape, 19 mm width, black, Scotch | 3M Science. Applied to Life | 7000006085 | |
| Microcentrifuge tube, 2 mL with lid, PPT, BRAND | Merck | BR780546-500EA | |
| Micropore tape | 3M Science. Applied to Life | 7100225115 | |
| Osram lumilux green l18w/66 | Ovalamp | 200008833 | |
| Petri plates - Greiner dishes, square, 120 x 120 x17mm, vented | Merck | Z617679-240EA | |
| Pipet tips, 1000 μL, Axygen | Merck | AXYT1000B | |
| The Plant Screen Data Analyzer software | PSI | delivered as a part of the iReenCAM |
References
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