Summary
Burada, Arabidopsis fide de-etiolasyonunun erken aşamalarında klorofil biyosentezinin izlenmesi için tasarlanmış gelişmiş bir aracı açıklıyoruz. Yeni metodoloji, yüksek uzamsal ve zamansal çözünürlükte non-invaziv gerçek zamanlı klorofil floresan görüntüleme sağlar.
Abstract
Klorofil biyosentezi, bitki yaşam döngüsündeki en dramatik aşamalardan biri olan de-etiolasyonun ayırt edici özelliğidir. Sıkı bir şekilde kontrol edilen ve son derece dinamik olan klorofil biyosentezi süreci, çiçekli bitkilerde karanlıktan aydınlığa geçiş sırasında tetiklenir. Etiollü fidelerin güneş ışığının ilk izlerine maruz kaldığı anda, protoklorofilidin klorofilide hızlı (saniye sırasına göre) dönüşümüne, sonraki metabolik adımlarla tamamen işlevsel klorofil üretimine yol açan benzersiz ışık kabul eden protein kompleksleri aracılık eder. Klorofil içerik analizi için standart teknikler, bu tür hızlı işlemlerin incelenmesi için geçerli olmayan, ayrılmış bitki dokularından pigment ekstraksiyonunu içerir. Klorofil kinetiğini, ışık kaynaklı de-etiolasyondan sonraki ilk saatlerde yüksek doğruluk ve uzay-zamansal çözünürlükle in vivo olarak araştırmak için bir alet ve protokol geliştirilmiştir. Burada, Arabidopsis de-etiolasyonunun erken aşamalarında klorofilin istatistiksel olarak sağlam miktar tayini için tasarlanmış ayrıntılı bir prosedür sunuyoruz.
Introduction
De-etiolasyon, bir dizi morfolojik değişiklik ve bitki metabolizmasının tamamen yeniden düzenlenmesi (hetero-tropikten oto-tropik)1 ile karakterize edilen bitki yaşam döngüsündeki en dramatik aşamayı temsil eder. Klorofil biyosentezi, bitkilerde ışığa bağlı de-etiolasyonun ve çok dinamik bir sürecin ayırt edici özelliğidir. Koyu renkli üretilen öncü protoklorofilden klorofil oluşumu, reaktif yan ürünlerden kaynaklanan hasarı önlemek için sıkı bir şekilde koordine edilmelidir2. Protoklorofilidin klorofide indirgenmesi, doğrudan ışıkla aktive edilen benzersiz enzimler olan ışığa bağımlı protoklorofil oksidoredüktazlar (POR'lar) tarafından katalize edilir. Reaksiyon çok hızlıdır, ms ila s3 sırasına göre gerçekleşir ve etiollü fide ışınlamasından birkaç dakika sonratanınabilir klorofil birikimine yol açar 4,5,6. Kloroplast biyogenezinin tamamen işlevsel bir fotosentetik aparat oluşturması için daha fazla zaman (saatlerden günlere) gerekir3.
Klorofil içeriğini analiz etmek için yüksek performanslı sıvı kromatografisi (HPLC) veya spektrofotometri dahil olmak üzere çeşitli yöntemler mevcuttur. Genellikle, bu teknikler bitki dokusunun 4,5,6 tahrip edilmesini gerektirir ve zaman içinde klorofil seviyelerindeki değişikliklerin belirlenmesini kısıtlar. Non-invaziv klorofil kinetiğinin kurulmasına izin veren yöntemler, zaman ve mekanda klorofil sentezi sürecini analiz etmek gibi temel araştırma sorularından, stres toleransının değerlendirilmesi veya biyostimülanların klorofil kinetiği üzerindeki etkisi gibi daha pratik uygulamalara kadar çeşitli yönlerden bitkileri incelemek için yepyeni bir bakış açısı açabilir. Bunu göz önünde bulundurarak, klorofil oluşumunu izlemek için bir sistem olan iReenCAM7'yi tanıttık. Bir CCD kamera, emisyon filtreleri, ışık kaynakları ve otomatik floresan analizi için bir boru hattı içerir (Şekil 1). Geliştirilen cihazın temel özelliği, yüksek uzamsal ve zamansal çözünürlük, mevcut yaklaşımlarda kullanılan parametrelerde daha iyi performans göstermesi ve standart analitik yöntemlerle karşılaştırıldığında yeterli hassasiyet ve özgüllüktür7.
Burada tarif edilen non-invaziv prosedür, minimum reaktifler gerektirir ve de-etiolasyonun çok erken aşamalarında canlı Arabidopsis fidelerinde bir klorofil kinetik profili elde edilmesine izin veren basit adımlardan oluşur. Protokol, hem eksojen (tuz, kuraklık, biyostimülanlar, ağır metaller, vb.) hem de endojen (tipik olarak gen aktivitesindeki değişikliklerle ilişkili) faktörlerden etkilenen klorofil sentezinin son derece dinamik sürecinin incelenmesi için yararlı olabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Orta hazırlık
- Bir Petri plakası (120 x 120 x 17 mm) için% 1.5 (a / h) konsantrasyon elde etmek için 0.75 g jelleştirici maddeyi 50 mL steril deiyonize su ile bir cam şişede karıştırarak yetiştirme ortamını hazırlayın. Karışımı hafifçe çalkalayın ve ardından jelleştirici maddeyi çözmek için kaynayana kadar bir mikrodalgada ısıtın (çözelti berraklaşır).
- Sonraki adımlara geçmeden önce ortamın 58-60 °C'ye soğumasını bekleyin. Sonraki tüm adımlar, kontaminasyonu önlemek için laminer akışlı bir başlık içinde steril koşullar altında gerçekleştirilmelidir.
- Ölçümler sırasında aşırı aktinik ışık yansımasını ve yüksek arka plan otofloresansını önlemek için ışık geçirmez kenarlı Petri plakaları kullanın. Bunun için, boş Petri plakasının tüm kenarlarını kaplayacak şekilde siyah yapışkan bant (veya mevcut diğer araçlar) uygulayın (Şekil 2).
- Bant uygulamasından sonra 20-30 dakika boyunca mikrop öldürücü UV lambası ile ışınlanarak plaka(lar)ın sterilizasyonunu gerçekleştirin.
- Deney kimyasal işlem içeriyorsa (yani, abiyotik/biyotik stres faktörleri, bitki hormonları ve/veya büyüme düzenleyiciler, vb.), uygun miktarda karşılık gelen kimyasalı doğrudan ortama ekleyin. Ortama eklenen seçilmiş bir kimyasal stabilitenin farkında olun (örneğin, kimyasal termostabil değilse, plakaya dökmeden hemen önce soğuduğunda ortama ekleyin). Kimyasalın eşit dağılımını sağlamak için ortamı çalkalayarak iyice karıştırın.
- Ortam döküldükten sonra plakaların UV ışığına aydınlatılmasından kaçının (deneye müdahale edebilecek oksijen radikali üretimine yol açar).
- Hazırlanan besiyerini kare Petri tabağına/plakalarına dökün ve besiyerinin oda sıcaklığında katılaşmasına izin verin.
2. Tohum yüzey sterilizasyonu ve bitki büyüme koşulları
- Gerekli miktarda Arabidopsis thaliana Col-0 tohumunu stok balkından (10-20 mg) alın ve 2 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpüne ekleyin.
NOT: Farklı Arabidopsis hatlarıyla (ekotip/mutant hatlar) çalışırken belirli bir değişiklik gerekli değildir. Testere ızgarasının revizyonu ve ölçüm adımları, tohum büyüklüğü, çimlenme oranı ve fide büyüklüğündeki farklılıklar dikkate alınarak diğer bitki türleri için yapılmalıdır. - Arabidopsis tohumlarını tüpe 2 dakika boyunca %70 etanol ekleyerek yüzey sterilize edin. Sterilizasyon sırasında tüpleri hafifçe sallayın.
- Etanolü dikkatlice pipetleyerek çıkarın, tohumları kaybetmemeye dikkat edin. Kalan etanolü çıkarmak için tüpe 5 dakika steril su ekleyerek tohumları yıkayın (yıkama süresi boyunca tüpleri hafifçe sallayın).
- Tohumların yerçekimi ile tüpün dibine çökmesine izin verin, kalan suyu çıkarın.
- Herhangi bir etanol özelliğinden arınmış olduklarından emin olmak için tohumları adım 2.3'te açıklandığı gibi tekrar 2 kez steril suyla durulayın. Tohumların yerçekimi ile tüpün dibine çökmesine izin verin, kalan suyu çıkarın.
- Bir tohum suyu süspansiyonu oluşturmak için tohumları içeren tüpe eşit miktarda steril su ekleyin.
- Verilen genotipin tohum-su süspansiyonunu orta plakanın seçilen alanlarına eşit olarak dağıtmak için bir ekim ızgarası kullanın (Şekil 2 ve Ek Şekil 1). Tohumları (yaklaşık 30-40) geniş bir pipet ucu kullanarak her alana arka arkaya dağıtın.
- Tohum alanlarında suyun yaklaşık 30 dakika kurumasını bekleyin, kontaminasyonu önlemek için plaka(lar)ı laminer akış başlığında açık tutun. Plakayı mikro gözenekli bantla kapatın ve alüminyum folyo ile sarın.
- (Kullanılan ekotipe bağlı olarak) tohum uyku halinin üstesinden gelmek ve/veya homojen çimlenmeyi teşvik etmek için tohumları karanlıkta 3 gün boyunca 4 °C'de katmanlandırın.
- Tabakalı tohumlu plakayı beyaz ışığa (150 μmol/m2/s) 1 saat boyunca çimlenmeyi indüklemek için aktarın (folyoyu yalnızca ışık işlemi için açın).
- Işık işleminden sonra, tohumları ışıktan korumak için plakayı alüminyum folyo ile sarın ve bir büyüme odasına dikey bir konuma yerleştirin ve karanlıkta 21 ° C'de 4 gün boyunca yetiştirin.
3. Klorofil floresan ölçümü ve analizi
- iReenCAM sistemini açın ve sistemin hazır olduğundan ve otomatik olarak başlatılan PS sunucu yazılımında doğru şekilde yapılandırıldığından emin olun (örneğin, deney verileri için yeterli depolama alanı varsa, floresan kamera PC'ye bağlıysa vb.).
- Denemeler > Yeni Deneme'ye tıklayarak ölçüm için deney planı oluşturmak üzere Zamanlayıcı yazılımını etkinleştirin. Deneme için açıklayıcı bir ad girin ve ayrıntıları (açıklama) doldurun.
- Deneme eylemlerinin zamanlamasına yol açacak olan İşlem Ekle'yi tıklayarak deneme için gerekli eylemleri ayarlayın.
NOT: Buradaki eylem kelimesi, tam bir deney yapmak anlamına gelir (yani, bir plaka ölçümü yapmak için gerekli tüm adımları içerir). - Tek bir yuvarlak ölçüm için koşulları belirtin (yani, aydınlık/karanlık periyodunun uzunluğu).
- Liste Oluştur'a tıklayarak, ölçüm turları arasındaki zaman aralıklarını tanımlayın. Turun başlayacağı ve biteceği zamanı (toplam 4 saat) ve turlar arasındaki aralıkları (mevcut kurulumda her 2 dakikada bir tur) seçin.
- Oluştur'a tıklayın ve ekranın sol tarafında oluşturulan listeyi kontrol ederek ışık darbeleri arasındaki zaman çerçevesinin ve aralıkların doğru olduğundan emin olun.
- Ölçüm protokolünü seçin (Ek Şekil 2). İleride başvurmak üzere tüm değişiklikleri veritabanına kaydedin.
- Ölçüm başlamadan hemen önce, karanlık odanın içinde düşük yoğunluklu yeşil ışık kullanın ( Malzeme Tablosuna bakın) ve folyoyu Petri plakasından çıkarmadan önce ölçüm odasının içindeki rafın seviyesini ayarlayın veya diğer hazırlık adımlarını gerçekleştirin. Ardından ışığı kapatın ve plakaları tamamen karanlıkta ölçüm odasına aktarın.
- 4 günlük fideleri içeren Petri plakasını kaplayan alüminyum folyoyu dikkatlice çıkarın. Petri plakasını cihaz ölçüm odasının içine yatay olarak yerleştirin. Odanın içinde, aktinik ışık darbelerini indükleyin ve 3.1-3.7 adımlarında belirlenen deney planına (eylemlere) göre görüntüleme yapın.
NOT: Plakaları ölçüm odasına yerleştirmeden önce etiollü fidelerle aydınlatılmaktan kaçınmak çok önemlidir. Etiollü fidelerin bulunduğu plaka ile manipülasyon karanlık odada/odada yapılmalıdır (olası bir deney düzeneği için Ek Şekil 3'e bakınız).
4. Veri çıkarma ve analiz
- Ölçümü tamamladıktan sonra, analizör yazılımında ilgili deneyi açın.
- Fidelerin floresansını analiz etmek için iki tür maske oluşturun - fidelerin bulunduğu alanı kaplayan kaba (tepsi) bir maske ve yalnızca ilgilenilen dokuyu (tipik olarak kotiledonlar) kaplayan hassas bir (bitki) maske.
- Yeni Tepsi Türü Oluştur seçeneğini tıklatarak bir tepsi maskesi oluşturun. Plaka görüntüsündeki ilgili alanlara uygun genotip adlarını atayın.
- Genotip atamak için, Yuvarlak'ta bir görüntü numarası seçin ve ardından ekranın üst kısmındaki Resmi Yükle'ye tıklayın. Plakanın görüntüsü ekranda gösterilecektir. Farklı şekiller çizim araçlarını temsil eden düğme setlerinden herhangi birine tıklayarak (Ek Şekil 4), plaka görüntüsünde ilgi alanını çizmeye izin veren Yeni Şekil Moduna girin. Gerekli alanları seçin (örneğin, plakadaki farklı genotipler) ve uygun isimlendirmelerini sağlayın.
- Şekil modundan çıkmak için Esc tuşuna tıklayın. Oluşturulan tepsi maskesini kaydedin (bir ad verdikten sonra) Tepsi Türünü Sakla'yı tıklatarak.
- Bir adım geri gidin ve Tepsi Türüne Göre Değiştir seçeneğinden adını seçerek önceki adımlarda oluşturulan maskeyi uygulayın.
- Bitki maskesini yüksek doğrulukla oluşturmak için, floresan sinyal yoğunluğu için minimum eşik değerini ayarlamak için 180 dakikalık ölçümden (yuvarlak 91) sonra elde edilen görüntüyü kullanın ve arka plan gürültüsünün çıkarılmasını sağlayın. Bunun için Otomatik Eşik'ten onay işaretini kaldırın ve Manuel Eşiği 0 olarak ayarlayın (Ek Şekil 4).
- Tepsi maskesinin plaka görüntüsündeki tüm gerekli alanları (genotipler) kapsadığından emin olmak için Önizleme'ye tıklayın. Bunun için 91. turu seçin ve Önizlemeyi Yenile'ye tıklayın.
- Çalıştır'a tıklayarak Çalıştır menüsüne girin. Sadece 91. turda bir onay işareti koyarak analizi yalnızca 91. tur için çalıştırın. Ardından çıkış yolunu seçin ve Analizi Başlat'a tıklayın.
- Analiz bittikten sonra Bitir menüsü otomatik olarak açılacaktır. Deneylerden yürütülen turu (tek tur olacaktır) seçin ve bu belirli zaman noktası (91. tur) için verileri dışa aktarmak için Analizörü Analiz Edilen Verilere Değiştir'e tıklayın.
- .xsel dosyasını dışa aktarılan arşivden ayıklayın, çünkü bu dosya Dışa Aktarma Bölümünü Aç simgesine tıklayarak temel bitki maskesi bilgilerini içerir.
- Yerel Analiz Bölümünü Aç simgesine tıklayarak denemeyi yeniden açın. Maske Oluşturucu menüsüne tekrar girin, Görüntü Yükle'ye tıklayın, yuvarlak 1'i seçin ve ardından ekranın sağ üst köşesindeki Dosyadan Yükle'yi seçin ve önceden çıkarılan .xsel dosyasını yükleyin. Tepsi maskesi uygulanmış olarak plakanın görüntüsü gösterilecektir.
- Tepsi Türünü Sakla'yı tıklatarak maskeyi kaydedin ve Tepsi Türüne Göre Değiştir seçeneğinde adını seçerek uygulayın.
- Floresan sinyal yoğunluğu eşiğini ayarlayarak bitki maskesini oluşturun. Önizleme menüsünde oluşturulan maske, genotiplerin her birindeki ROI'ye (örn. kotiledonlar) mükemmel şekilde uyana kadar Manuel Eşik değerini artırın (Ek Şekil 4). Önizleme menüsünde turlar boyunca kaydırarak maskenin ölçümlerin tüm turlarına uyup uymadığını kontrol edin (1, 61 ve 121. turlarda uygun maske konumunu kontrol etmek yeterli olacaktır).
- Tüm ölçüm turları için analiz gerçekleştirin ve verileri dışa aktarın.
NOT: Çıktı dosyası, her bir zaman noktası için belirli bir genotipin klorofil floresan değerlerini içerir, bu da seçim çizelgelerinin oluşturulmasını sağlar ve daha fazla istatistiksel değerlendirmeyi kolaylaştırır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Yabani tip (WT), ekotip Columbia-0 (Col-0) 4 günlük etiolasyondan arındırılmış Arabidopsis fidelerinde yeni geliştirilen prosedür kullanılarak elde edilen tipik çıktı Şekil 3'te gösterilmektedir. Kontrol koşulları altında (DMSO takviyeli MS ortamı), klorofil biyosentetik eğrisi, büyümenin skotomorfojenik fazı sırasında sentezlenen protoklorfilid havuzunun, ışıkla indüklenen POR'lar 7,8,9 sayesinde hızla klorofile dönüştürüldüğü klorofil sentezinin ilk patlamasıyla başlar. Hızlı klorofil birikiminin ilk aşaması yaklaşık 10 dakika sürer ve bunu karanlık sentezlenen protoklorofilidin minimumuna ulaşıldığı bir gecikme aşaması izler (ışınlamadan yaklaşık 30 dakika; HPLC ile ölçülen protoklorofil eğrisi için bkz.7). Gecikme fazı sırasında, klorofil biyosentetik genleri yukarı regüle edilir10, bu da ışığa bağlı protoklorofil üretimine yol açar. Yeni sentezlenen protoklorofil derhal klorofile dönüştürülür, üstel faz olarak tespit edilebilir (ışınlamadan yaklaşık 0 dakika sonra başlayan WT Col-120 durumunda), etiolasyondan arındırılmış fide ışınlamasından yaklaşık 4 saat sonra başka bir gecikme fazı ile biter (Şekil 3). 6-benzilaminopurin (BAP) varlığında, ilk önemli farklılıklar üstel faz7 sırasında tespit edilebilir, bu da BAP'nin klorofil biyosentezinin sonraki aşamalarında klorofil kinetiği üzerindeki olumsuz etkisini düşündürür (aktinik ışıkla aydınlatmanın başlamasından yaklaşık 2 saat sonra; Şekil 3).
Farklı koşulların ve/veya genotiplerin karşılaştırılması için ham verilerin normalleştirilmesi gereklidir. Etiollü fidelerde çeşitli koşullar altında ve/veya farklı genotiplerde HPLC kullanılarak klorofil saptanamadığından, ilgili tedavi ve/veya genotip7 için ölçülen T0 floresan seviyelerine (F0) normalizasyonu (F/F0) gerçekleştirdik. Normalizasyonun önemini göstermek için, hem ham verileri hem de T0'da ölçülen kontrolün ortalama klorofil floresan değerine normalleştirilmiş verileri sunuyoruz (F0; Sırasıyla Şekil 3A ve Şekil 3B).
Şekil 1: Ölçüm cihazı protokolüne genel bakış. iReenCAM ölçüm ve analiz boru hattının şeması. (A) Izgara tanımlı tohum ekimi, tabakalaşma, çimlenmenin ışık indüksiyonu ve karanlıkta dikey olarak yönlendirilmiş Petri plakası ekimi ile numune hazırlama. (B) PlantScreen fenotipleme SW araç kutusuna dayalı otomatik ve programlanabilir görüntü toplama ve veri yönetimi için kontrol modülü, HW işlemini kullanıcı tanımlı ölçüm ve analiz protokolü ile kontrol ederek ve senkronize ederek tüm sistemin çalışmasını düzenler. (C) Ölçüm protokolü, floresan numune görüntülerinin 2 dakikalık aralıklarla toplam 4 saat, yani 120 ölçüm turu boyunca dinamik ölçümleri için tasarlanmıştır. ROI maskesi üretimi için 180 dakikada elde edilen dikey olarak yönlendirilmiş 4 günlük Arabidopsis fidelerinin temsili sahte renkli görüntüsünün zaman görsel çerçevesi kullanılır. (D) İlgilenilen bir doku (örneğin, kotiledon, hipokotil veya kök bölgesi) için ROI'yi tanımlayan maske, görsel çerçeveye uygulanır, arka plan çıkarma işlemi gerçekleştirilir ve tüm ölçüm turlarından her ROI (bitki maskesi tarafından tanımlanan) için piksel piksel floresan değerleri çıkarılır. Son olarak, ham veriler (floresan F), T0'daki (F0) ortalama floresan değerine normalleştirilir. Ölçek çubukları = 1 cm (A) ve 0,25 cm (C). Rakam7'den değiştirildi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Tohum yerleştirme. Şekil, Arabidopsis tohumlarının testere ızgarası kullanılarak hafif geçirmez kenarlı Petri plakasına yerleştirilmesini göstermektedir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Arabidopsis de-etiolasyonunun erken evrelerinde klorofil birikimi kinetiği. Etiolated WT Col-0 fideleri, BAP veya DMSO (mock) ile desteklenmiş ortamlarda yetiştirildi. (A) SD (gölgeli alan) ± ortalama değer, ham verilerin n=9'u ve (B) T0'daki (F0) ortalama floresan değerine normalleştirilmiş veriler. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Ek Şekil 1: Ekim ızgarası. Sol: Her bir genotipin tohumlarını aktinik ışık homojenliği alanında bulunan bir ölçüm noktasına yerleştirmek için ana hatlarıyla dikdörtgen kutulara sahip ekim ızgarası (ışık yoğunluğu maksimum ışık yoğunluğunun 0,7'si ≥). Sağda: Analiz için yetiştirilen 4 günlük, etiollü Arabidopsis fidelerinin şematik gösterimi. Ekim ızgarası, hafif homojenlik ve uygun tohum yoğunluğu sağlayan Arabidopsis tohumlarının konumlandırılması için olası bir şema sağlar (her yuva, bir yuvanın boyutu, yuvalar arasındaki mesafe ve ızgara alanındaki ışık homojenliği birleştirildiğinden tohum yerleştirme için kullanılabilir). Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Ek Şekil 2: Floresan ölçüm protokolü. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Ek Şekil 3: İstenmeyen ışığa maruz kalmayı önlemeye izin veren deneysel konfigürasyon. (A) Ölçüm cihazı, gömme fitotrona, (B) ışık geçirmez kapı ile ayrılmış bölmeye yerleştirilir. (C) Tanımlanmış koşullar altında (sıcaklık ve bağıl nem) etiolasyonlu fidelerin büyümesi için ayrılmış in vitro yetiştirme kutuları (kırmızı ok ucu), minimum ışığa maruz kalma riskini sağlamak için cihazın hemen altına (sarı ok ucu) yerleştirilir. Yeşil loş ışık kaynağı (mavi ok ucu) kontrol PC'sinin (turuncu ok ucu) yanındaki duvara monte edilmiştir. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Ek Şekil 4: PS veri analizörü yazılımı kullanılarak iş akışında maske oluşturma prosedürü. Tepsi maskesi (adım 4.3-4.6) ve bitki maskesi (adım 4.12), oluşturma ve veri analizi (adım 4.7 ve 4.13) için gerçekleştirilecek bireysel adımların ekran görüntülerini yazdırın. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Ek Şekil 5: Ölçüm değişkenliğini etkileyen ekim yoğunluğu. (A) ayrı ayrı (tek tek fidan olarak, burada n=5) veya (B) yüksek (HD, n=30-40) veya (C) düşük yoğunluklu (LD, n=10-15) bir grupta yetiştirilen 4 günlük, etiollü Arabidopsis WT Col-0 fidelerinde klorofil birikim kinetiği. N, ekim ızgarasının yuvası başına fide sayısına karşılık gelir, veriler SD'± (gölgeli bölge) ortalama değerlerini temsil eder. Yüksek veya düşük yoğunluk, belirtildiği gibi ekim ızgarasının yuvası başına fide sayısına karşılık gelir. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Ek Şekil 6: Yetiştirme aralığı ve alanı, türe özgü optimizasyon gerektirir. Arabidopsis için optimize edilmiş protokol kullanılarak çeşitli bitki türlerinin büyümesi. (A) Tohumların ekim ızgarasına yerleştirilmesi. (B) 4 günlük, etiollü fidanlar (soldan sağa) Arabidopsis thaliana, Brassica napus ve Crambe abyssinica. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Protokolün kritik adımları ve sorun giderme - ışık yok ve maskeye dikkat edin
Yukarıdaki protokol açıklamasında doğrudan vurgulandığı gibi, hem etiollenmiş bitki fidelerinin yetiştirilmesi sırasında hem de protokole başlamadan hemen önce eser miktarda ışıktan bile kaçınmak kritik öneme sahiptir11. Kurulumumuzda, içeri giren fitotronda bulunan ve fitotronun geri kalanından ışık geçirmez dönen kapı ile ayrılmış özel bir karanlık oda kullanıyoruz (Ek Şekil 3). Oda, cihazı kontrol PC'si ve davlumbaz ile birlikte barındırmaya izin veren bitki yetiştirme alanı ve çalışma tezgahı ile donatılmıştır. Bu sayede hem bitkileri karanlıkta yetiştirebilelim hem de plaka taşımaya gerek kalmadan ölçüme başlayabilelim.
Bitki yetiştirme ve maske oluşturma şekli, önerilen tahlil yoluyla klorofil floresan sinyalinin daha sonra ölçülmesi için kritik öneme sahiptir. Işık yansımasına neden olabileceğinden, ortama jelleştirici madde kümeleri veya küçük görsel çöp/toz bulaşmasını önlemek gerekir. Klorofil floresansının yazılım tarafından tanınması maske ile sınırlı olduğundan, maske tarafından kapsanmayacak bir bitki alanı yazılım tarafından analiz edilmeyecektir. 4 saatlik ölçüm sırasında fideler biraz büyür/hareket eder, bu nedenle belirlenen maske, doğru sinyal yoğunluğu ölçümü için tüm ölçüm turlarına uymayabileceğinden ayarlamalar gerektirebilir. Deneyimlerimize göre, kusurlu maske tanımı, değişkenliğin ana kaynağı gibi görünmektedir. Optimizasyon deneyleri sırasında, i) tek tek fidelerde ve ii) daha yüksek (30-40 tohum) ve iii) daha düşük (10-15 tohum) yoğunluklu ekimli bir fide grubunda analiz için alınan klorofil floresan değerlerinin değişkenliğindeki değişiklikleri izledik (Ek Şekil 5). En düşük değişkenliği gösterdiği için daha yüksek yoğunluklu tohum ekimi kullandık. Bireysel fideler/daha düşük yoğunluklu ekim durumunda görülen daha yüksek değişkenlik, çoğunlukla sinyal ile arka plan arasındaki kenarda bulunan piksellerin daha yüksek oranından ve fidelerin 4 saatlik ölçüm aralığı sırasında hafif hareketinden kaynaklanmaktadır.
Tüm ölçümlerin doğru olduğundan emin olmak için, bitki maskesinin ilk tura, ardından15'inci, 30'uncu, 45'inci, 60'ıncı, 75'inci ve sonuncusuna kadar devam edip etmediğini kontrol edin (tur numarasını seçip Önizlemeyi Yenile'ye tıklayarak). Bu sadece birkaç dakika sürecek, ancak tüm kotiledon alanının kaplanmasını ve değerlendirilmesini sağlayacaktır. Herhangi bir turda bitki maskesi uymuyorsa (gerekli alan tam olarak kaplanmamışsa), deneyi birkaç parçaya bölün. Ardından, deneyin her bölümü için ayrı ayrı belirli bir maske oluşturmak için Adım 4'ten (4.1-4.13) başlayarak protokolü uygulayın. Örneğin, bitki maskesinin 60-61 turunda (veya biraz daha erken) yer değiştirdiğini fark ederseniz, deneyi iki kısma bölün - 1. kısım (1-60 tur) ve 2. kısım (61-121 tur). 1. kısım için bir bitki maskesi oluşturmak için 41. turun görüntüsünü kullanın ve 2. kısım için 91. turu kullanın. Adım 4.13'te, verileri analiz ederken, Analiz Et'e tıklamadan önce turları denemenin ilgili bölümüne göre seçmeye dikkat edin (örneğin, yukarıda belirtilen örnekte olduğu gibi ilk bölüm için 1-60 ve ikinci bölüm için 61-121 turları). Arabidopsis ile çalışırken, bitkilerin hareketi oldukça yavaş büyüdükleri için ihmal edilebilir, ancak farklı türler için protokol uygulanıyorsa (aşağıya bakınız), büyüme hızı dikkate alınmalıdır.
Değişiklikler ve sınırlamalar
Aktinik ışığın yoğunluğu ve dalga boyu ve/veya aktinik ışık uygulama aralıkları arasında uygulanan ışık dahil olmak üzere parametrelerin sayısı değiştirilebilir. Ölçüm cihazı, entegre, tam motorlu ve yazılım kontrollü filtre tekerleğini içerir. Bu nedenle, diğer pigmentlerin, tipik olarak tetrapyrolle biyosentetik yolunun10,12 ürünlerinin miktar tayini için uygun ölçüm algoritması, uygun filtrelerin eklenmesi durumunda protokole dahil edilebilir.
Ayrıca, daha önce de belirtildiği gibi, protokol sadece Arabidopsis bitkileri için kullanılamaz. Bununla birlikte, diğer bitki türleriyle çalışırken, protokolün her adımı, çimlenme ve büyüme hızı ve/veya büyüklüğü dahil olmak üzere türe özgü özellikler dikkate alınarak buna göre revize edilmelidir (Ek Şekil 6).
Protokolün önemli sınırlamalarından biri, klorofil miktar tayin analizinin gerçekleştirilebileceği zaman aralığıdır. Klorofil fotosistem komplekslerine entegre olduktan sonra, floresan sinyali, de-etiolasyonun sonraki aşamalarında gözlemlendiği gibi, fotosentez enerji tüketimi (değişken klorofil floresansı olarak adlandırılan şey mevcuttur) tarafından önyargılı hale gelir13. OJIP geçici deneyi14,15 kullanılarak test edildiği gibi, etiolasyonun ilk 4 saati boyunca bu deney düzeneği kullanılarak hiçbir fotosentetik aktivite belirtisi tespit edilemedi7. Bununla birlikte, fotomorfogenezin uzatılmış süresinin test edilmesi gerekiyorsa/gerekliyse, fotosistem montaj seviyesi ve fotosentezin genel floresan seviyeleri üzerindeki olası etkisi test edilmelidir.
Son olarak, floresan ölçümlerine dayanan protokolümüzün mutlak klorofil miktar tayinine değil, göreceli olarak izin verdiği belirtilmelidir. Mutlak miktar tayini gerekiyorsa, ilgili kalibrasyon alternatif bir yaklaşım, örneğin HPLC yaklaşımı kullanılarak gerçekleştirilmelidir.
Mevcut yöntemlere göre önemi - yüksek zaman ve uzamsal çözünürlük ile basit, hızlı ve istatistiksel olarak sağlam klorofil miktar tayini
Burada açıklanan prosedür, etiolasyonun erken aşamalarında canlı Arabidopsis fidelerinde klorofilin gerçek zamanlı olarak tespit edilmesini ve miktarının belirlenmesini sağlar. Çoğunlukla müstakil bitki materyalinden klorofil ekstraksiyonunadayanan diğer yaklaşımlarla karşılaştırıldığında 16,17 veya yakın zamanda geliştirilen optik yöntemler18,19 bu yaklaşım tamamen invaziv değildir ve floresan yoğunluğunun in vivo ölçümü ile klorofil miktar tayinine izin verir. Ayrıca, yukarıda bahsedilen HPLC veya spektrofotometri tabanlı yaklaşımlar da dahil olmak üzere mevcut diğer alternatif yöntemlerde olduğu gibi, numune hazırlama için gerekli ek reaktiflere gerek yoktur. Yeni tanıtılan protokol, daha önce HPLC5 kullanılarak doğrulandığı gibi basit, hızlı ve doğrudur. Standart protokol ayarları kullanılarak, tek bir biyolojik tekrarın son eğrisi, ölçümün 4 saati boyunca alınan ve her biri 15'e kadar ölçüm noktasından oluşan 120 ölçüm noktasından (floresan yoğunluk ortalamaları) yapılır. Tipik olarak, son eğri, her biri 30-40 fideden oluşan üç biyolojik kopyanın (örneğin, bağımsız olarak hazırlanmış üç plaka) ve üç ölçüm noktasının (üç teknik kopya) verilerini içerir. Bu nedenle, her zaman aralığında test edilen yaklaşık 300 fide vardır ve istatistiksel olarak sağlam bir veri seti sağlar ve klorofil biyosentezinin çeşitli adımlarında etkilenen mutantlarda gösterildiği gibi küçük farklılıkları bile güvenilir bir şekilde tespit etmeye olanak tanır7. Burada kullanıcıyı, klorofil kinetik veri analizi için uygun bir araç olarak klasik zaman serisi modelleriyle birleştirilmiş genelleştirilmiş doğrusal karma modellere dayalı yeni geliştirilen istatistiksel yaklaşımı kullanmaya teşvik ediyoruz20.
Tekniğin gelecekteki uygulamaları - hızlı ve ucuz tarama
Yukarıda belirtilen özellikler, bu yaklaşımı, klorofil biyosentezi ile ilişkili özelliklerin (doğrudan veya dolaylı olarak) hızlı ve ucuz taraması ve son derece hassas bir şekilde ölçülmesi için uygun kullanışlı bir araç haline getirir. Bu, klorofil biyosentezinin karmaşık ve çok seviyeli düzenlemelerini daha iyi karakterize etmek için ileri genetik taramayı kullanan çalışmaları içerebilir 10,12,21. Çeşitli bileşik muamele olasılığı göz önüne alındığında, protokol, örneğin, ışık aracılı hormonal düzenlemelerin22,23 önemini veya klorofil birikim kinetiği üzerinde olası etkisi olan düşük moleküler bileşiklerin taranmasını incelemek için de oldukça değerlidir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Z.B. ve K.P. PSI'ın çalışanlarıdır ve Martin Trtilek, iReenCAM'i üreten PSI şirketinin CEO'su ve sahibidir. Tüm bu yazarlar, daha önce açıklandığı gibi enstrümanın geliştirilmesinde yer aldı7.
Acknowledgments
Bu çalışma, Avrupa Bölgesel Kalkınma Fonu-SINGING PLANT Projesi (No. CZ.02.1.01/0.0/0.0/16_026/0008446). Bu proje, Avrupa Birliği tarafından finanse edilen MSCA4Ukraine projesi (ID 1233580) aracılığıyla fon almıştır. Şekil 1'in grafik tasarımı için Lenka Sochurkova'ya minnettarız.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6-benzylaminopurine | Duchefa Biochemie | B0904.0001 | |
| Aluminum foil | Merck | Z691577 | |
| Arabidopsis thaliana Col-0 seeds | NASC collection | N1092 | |
| Cultivation chamber | PSI | custom made | |
| Dimethilsulfoxid | Thermo Fisher Scientific | 042780.AK | |
| Eppendorf single-channeled, variable (100-1000 μL) | Merck | EP3123000063 | |
| Gelrite | Duchefa Biochemie | G1101 | |
| iReenCAM device | PSI | custom made/prototype | |
| Laboratory bottles, with caps (Duran), 100mL | Merck | Z305170-10EA | |
| Laminar-flow box | UniGreenScheme | ITEM-31156 | |
| Linerless Rubber Splicing Tape, 19 mm width, black, Scotch | 3M Science. Applied to Life | 7000006085 | |
| Microcentrifuge tube, 2 mL with lid, PPT, BRAND | Merck | BR780546-500EA | |
| Micropore tape | 3M Science. Applied to Life | 7100225115 | |
| Osram lumilux green l18w/66 | Ovalamp | 200008833 | |
| Petri plates - Greiner dishes, square, 120 x 120 x17mm, vented | Merck | Z617679-240EA | |
| Pipet tips, 1000 μL, Axygen | Merck | AXYT1000B | |
| The Plant Screen Data Analyzer software | PSI | delivered as a part of the iReenCAM |
References
- Arsovski, A. A., Galstyan, A., Guseman, J. M., Nemhauser, J. L.
- Reinbothe, S., Reinbothe, C., Apel, K., Lebedev, N. Evolution of chlorophyll biosynthesis--the challenge to survive photooxidation. Cell. 86 (5), 703-705 (1996).
- Heyes, D. J., et al. Photocatalysis as the 'master switch' of photomorphogenesis in early plant development. Nat Plants. 7 (3), 268-276 (2021).
- Hu, X. Y., Tanaka, A., Tanaka, R. Simple extraction methods that prevent the artifactual conversion of chlorophyll to chlorophyllide during pigment isolation from leaf samples. Plant Methods. 9 (1), 19 (2013).
- Chazaux, M., Schiphorst, C., Lazzari, G., Caffarri, S. Precise estimation of chlorophyll a, b and carotenoid content by deconvolution of the absorption spectrum and new simultaneous equations for chl determination. Plant J. 109 (6), 1630-1648 (2022).
- Marr, I. L., Suryana, N., Lukulay, P., Marr, M. I. Determination of chlorophyll-a and chlorophyll-b by simultaneous multicomponent spectrophotometry. Fresenius J Anal Chem. 352 (5), 456-460 (1995).
- Balakhonova, V., et al. Ireencam: Automated imaging system for kinetic analysis of photosynthetic pigment biosynthesis at high spatiotemporal resolution during early deetiolation. Front Plant Sci. 14, 1093292 (2023).
- Virgin, H. I., Kahn, A., Vonwettstein, D. The physiology of chlorophyll formation in relation to structural changes in chloroplasts. Photochem Photobiol. 2 (2), 83-91 (1963).
- Reinbothe, C., et al. Chlorophyll biosynthesis: Spotlight on protochlorophyllide reduction. Trends Plant Sci. 15 (11), 614-624 (2010).
- Kobayashi, K., Masuda, T. Transcriptional regulation of tetrapyrrole biosynthesis in arabidopsis thaliana. Front Plant Sci. 7, 1811 (2016).
- Wang, Y., Folta, K. M. Contributions of green light to plant growth and development. Am J Bot. 100 (1), 70-78 (2013).
- Brzezowski, P., Richter, A. S., Grimm, B. Regulation and function of tetrapyrrole biosynthesis in plants and algae. Biochim Biophys Acta. 1847 (9), 968-985 (2015).
- Pipitone, R., et al. A multifaceted analysis reveals two distinct phases of chloroplast biogenesis during de-etiolation in arabidopsis. eLife. 10, e62709 (2021).
- Stirbet, A. G. On the relation between the kautsky effect (chlorophyll a fluorescence induction) and photosystem ii: Basics and applications of the ojip fluorescence transient. J Photochem Photobiol B-Biol. 104 (1-2), 236-257 (2011).
- Kupper, H., et al. Analysis of ojip chlorophyll fluorescence kinetics and q(a) reoxidation kinetics by direct fast imaging. Plant Physiol. 179 (2), 369-381 (2019).
- Avin-Wittenberg, T., et al. Global analysis of the role of autophagy in cellular metabolism and energy homeostasis in arabidopsis seedlings under carbon starvation. Plant Cell. 27 (2), 306-322 (2015).
- Kósa, A., Preininger, É, Böddi, B. Nitrogen deficiency hinders etioplast development in stems of dark-grown pea (pisum sativum) shoot cultures. Physiol Plant. 155 (3), 330-337 (2015).
- Liang, Y., et al. A nondestructive method to estimate the chlorophyll content of arabidopsis seedlings. Plant Met. 13 (1), 26 (2017).
- Pérez-Patricio, M., et al. Optical method for estimating the chlorophyll contents in plant leaves. Sensors. 18 (2), 650 (2018).
- Spyroglou, I., et al. Mixed models as a tool for comparing groups of time series in plant sciences. Plants (Basel). 10 (2), (2021).
- Tanaka, R., Kobayashi, K., Masuda, T.
- De Wit, M., Galvao, V. C., Fankhauser, C. Light-mediated hormonal regulation of plant growth and development. Annu Rev Plant Biol. 67, 513-537 (2016).
- Liu, X., Li, Y., Zhong, S. Interplay between light and plant hormones in the control of arabidopsis seedling chlorophyll biosynthesis. Front Plant Sci. 8, 1433 (2017).
