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Biology

अरबिडोप्सिस डी-एटियोलेशन के प्रारंभिक चरणों के दौरान क्लोरोफिल बायोसिंथेसिस कैनेटीक्स निर्धारण के लिए गैर-इनवेसिव परख

Published: January 12, 2024 doi: 10.3791/66087
Automatic Translation
*1,2, *1,3, 1,2, 1,2,4, 5, 5, 5, 1,2
1CEITEC - Central European Institute of Technology, Masaryk University, 2National Centre for Biomolecular Research, Faculty of Science, Masaryk University, 3Institute of Food Biotechnology and Genomics, National Academy of Sciences of Ukraine, 4Labdeers s.r.o, 5Photon Systems Instruments, Prumyslova
* These authors contributed equally

Summary

यहां, हम अरबिडोप्सिस अंकुर डी-एटियोलेशन के शुरुआती चरणों के दौरान क्लोरोफिल जैवसंश्लेषण निगरानी के लिए डिज़ाइन किए गए एक उन्नत उपकरण का वर्णन करते हैं। उपन्यास पद्धति उच्च स्थानिक और लौकिक संकल्प पर गैर इनवेसिव वास्तविक समय क्लोरोफिल प्रतिदीप्ति इमेजिंग प्रदान करता है.

Abstract

क्लोरोफिल जैवसंश्लेषण डी-एटिओलेशन की एक बानगी है, जो पौधे के जीवन चक्र में सबसे नाटकीय चरणों में से एक है। क्लोरोफिल जैवसंश्लेषण की कसकर नियंत्रित और अत्यधिक गतिशील प्रक्रिया फूलों के पौधों में अंधेरे से प्रकाश में बदलाव के दौरान शुरू होती है। उस समय जब एटिओलेटेड रोपे सूर्य के प्रकाश के पहले निशान के संपर्क में आते हैं, क्लोरोफिलाइड में प्रोटोक्लोरोफिलाइड के तेजी से (सेकंड के क्रम में) रूपांतरण अद्वितीय प्रकाश-स्वीकार प्रोटीन परिसरों द्वारा मध्यस्थता की जाती है, जो पूरी तरह कार्यात्मक क्लोरोफिल के उत्पादन के लिए बाद के चयापचय चरणों के माध्यम से अग्रणी होती है। क्लोरोफिल सामग्री विश्लेषण के लिए मानक तकनीकों में अलग पौधे के ऊतकों से वर्णक निष्कर्षण शामिल है, जो इस तरह की तेज प्रक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए लागू नहीं होता है। प्रकाश-प्रेरित डी-एटिओलेशन के बाद पहले घंटों में उच्च सटीकता और स्पैटिओटेम्पोरल रिज़ॉल्यूशन के साथ विवो में क्लोरोफिल कैनेटीक्स की जांच करने के लिए, एक उपकरण और प्रोटोकॉल विकसित किए गए थे। यहां, हम अरबिडोप्सिस डी-एटियोलेशन के शुरुआती चरणों में क्लोरोफिल के सांख्यिकीय रूप से मजबूत मात्रा का ठहराव के लिए डिज़ाइन की गई एक विस्तृत प्रक्रिया प्रस्तुत करते हैं।

Introduction

डी-एटिओलेशन पौधे के जीवन चक्र में सबसे नाटकीय चरण का प्रतिनिधित्व करता है, जो कई रूपात्मक परिवर्तनों और पौधे के चयापचय (हेटेरो- से ऑटो-ट्रॉपिक)1के पूर्ण पुनर्व्यवस्था की विशेषता है। क्लोरोफिल जैवसंश्लेषण पौधों में प्रकाश-प्रेरित डी-एटिओलेशन की एक बानगी है और एक बहुत ही गतिशील प्रक्रिया है। अंधेरे उत्पादित अग्रदूत प्रोटोक्लोरोफिलाइड से क्लोरोफिल का गठन प्रतिक्रियाशील उपोत्पादों के कारण क्षति से बचने के लिए कसकर समन्वित किया जाना चाहिए2. क्लोरोफिलाइड में प्रोटोक्लोरोफिलाइड की कमी प्रकाश-निर्भर प्रोटोक्लोरोफिलाइड ऑक्सीडोरडक्टेस (पीओआर) द्वारा उत्प्रेरित होती है, जो प्रकाश द्वारा सीधे सक्रिय अद्वितीय एंजाइम होते हैं। प्रतिक्रिया बहुत तेजी से है, एमएस के क्रम में एस3 के क्रम में जगह ले रही है, जिससे एटिओलेटेड अंकुरविकिरण 4,5,6 के बाद मिनटों के भीतर पहचानने योग्य क्लोरोफिल संचय हो जाता है। क्लोरोप्लास्ट जैवजनन के लिए पूरी तरह कार्यात्मक प्रकाश संश्लेषक उपकरण स्थापित करने के लिए अधिक समय (घंटों से दिनों तक) की आवश्यकता होतीहै।

क्लोरोफिल सामग्री का विश्लेषण करने के लिए विभिन्न विधियां मौजूद हैं, जिनमें उच्च प्रदर्शन तरल क्रोमैटोग्राफी (एचपीएलसी) या स्पेक्ट्रोफोटोमेट्री शामिल हैं। आमतौर पर, इन तकनीकों संयंत्र ऊतक 4,5,6 के विनाश की मांग, समय के साथ क्लोरोफिल के स्तर में परिवर्तन के निर्धारण को प्रतिबंधित. गैर-इनवेसिव क्लोरोफिल कैनेटीक्स स्थापना की अनुमति देने वाले तरीके मौलिक अनुसंधान प्रश्नों से लेकर विभिन्न पहलुओं में पौधों का अध्ययन करने के लिए एक नया दृष्टिकोण खोल सकते हैं, जैसे कि समय और स्थान में क्लोरोफिल संश्लेषण की प्रक्रिया का विश्लेषण करना, अधिक व्यावहारिक अनुप्रयोगों के लिए, जैसे कि तनाव सहिष्णुता का आकलन या क्लोरोफिल कैनेटीक्स पर बायोस्टिमुलेंट्स का प्रभाव। इसे ध्यान में रखते हुए, हमने क्लोरोफिल गठन की निगरानी के लिए एक प्रणाली पेश की, iReenCAM7। इसमें एक सीसीडी कैमरा, उत्सर्जन फिल्टर, प्रकाश स्रोत और स्वचालित प्रतिदीप्ति विश्लेषण (चित्रा 1) के लिए एक पाइपलाइन शामिल है। विकसित डिवाइस की मुख्य विशेषता उच्च स्थानिक और लौकिक संकल्प है, वर्तमान दृष्टिकोण में इस्तेमाल मापदंडों में बेहतर प्रदर्शन, और पर्याप्त संवेदनशीलता और विशिष्टता जब मानक विश्लेषणात्मक तरीकों7 के साथ तुलना में.

यहां वर्णित गैर-इनवेसिव प्रक्रिया में न्यूनतम अभिकर्मकों की आवश्यकता होती है और इसमें सरल कदम शामिल होते हैं, जिससे डी-एटिओलेशन के शुरुआती चरणों के दौरान जीवित अरबिडोप्सिस अंकुरों में क्लोरोफिल कैनेटीक्स प्रोफाइल प्राप्त करने की अनुमति मिलती है। प्रोटोकॉल क्लोरोफिल संश्लेषण की अत्यधिक गतिशील प्रक्रिया के अध्ययन के लिए उपयोगी हो सकता है, जो कई कारकों से प्रभावित होता है, दोनों बहिर्जात (नमक, सूखा, बायोस्टिमुलेंट्स, भारी धातुओं, आदि) और अंतर्जात (आमतौर पर जीन गतिविधि में परिवर्तन से जुड़े) मूल में किसी भी पौधे के ऊतकों को अलग करने की आवश्यकता के बिना, इस प्रकार अतिरिक्त तनाव से बचना।

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Protocol

1. मध्यम तैयारी

  1. एक पेट्री प्लेट (120 x 120 x 17 मिमी) के लिए 1.5% (डब्ल्यू / वी) एकाग्रता प्राप्त करने के लिए एक कांच की बोतल में बाँझ विआयनीकृत पानी के 50 एमएल के साथ गेलिंग एजेंट के 0.75 ग्राम मिश्रण करके खेती माध्यम तैयार करें। मिश्रण को धीरे से हिलाएं और फिर इसे माइक्रोवेव में तब तक गर्म करें जब तक कि गेलिंग एजेंट को भंग करने के लिए उबाल न आ जाए (समाधान स्पष्ट हो जाता है)।
  2. अगले चरणों के लिए आगे बढ़ने से पहले माध्यम को 58-60 डिग्री सेल्सियस तक ठंडा होने दें। सभी बाद के चरणों संदूषण को रोकने के लिए एक लामिना का प्रवाह हुड के भीतर बाँझ शर्तों के तहत प्रदर्शन किया जाना चाहिए.
  3. माप के दौरान अत्यधिक actinic प्रकाश प्रतिबिंब और उच्च पृष्ठभूमि autofluorescence से बचने के लिए प्रकाश तंग किनारों के साथ पेट्री प्लेटों का प्रयोग करें. इसके लिए, खाली पेट्री प्लेट (चित्रा 2) के सभी पक्षों को कवर करने के लिए काले चिपकने वाला टेप (या अन्य साधन उपलब्ध) लागू करें।
  4. 20-30 मिनट के लिए कीटाणुनाशक यूवी दीपक के साथ विकिरण द्वारा टेप आवेदन के बाद प्लेट (ओं) की नसबंदी करें।
  5. यदि प्रयोग में रासायनिक उपचार (यानी, अजैविक / जैविक तनाव, पौधे हार्मोन और / या विकास नियामक, आदि) शामिल हैं, तो सीधे माध्यम में संबंधित रसायन की उचित मात्रा जोड़ें। मीडिया में जोड़े जा रहे एक चुने हुए रासायनिक स्थिरता से अवगत रहें (उदाहरण के लिए, यदि रसायन थर्मोस्टेबल नहीं है, तो प्लेट में डालने से ठीक पहले ठंडा होने पर माध्यम में जोड़ें)। रसायन का एक समान वितरण सुनिश्चित करने के लिए मिलाते हुए माध्यम को अच्छी तरह मिलाएं।
  6. मीडिया डाला जाता है के बाद यूवी प्रकाश के लिए प्लेटों की रोशनी से बचें (ऑक्सीजन कट्टरपंथी उत्पादन है कि प्रयोग के साथ हस्तक्षेप हो सकता है के लिए नेतृत्व करेंगे).
  7. वर्ग पेट्री प्लेट (ओं) में तैयार माध्यम डालो और कमरे के तापमान पर जमना करने के लिए माध्यम की अनुमति देते हैं.

2. बीज की सतह नसबंदी और पौधे की वृद्धि की स्थिति

  1. स्टॉक बाल्क (10-20 मिलीग्राम) से Arabidopsis thaliana Col-0 बीज की आवश्यक मात्रा प्राप्त करें और इसे 2 एमएल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में जोड़ें।
    नोट: विभिन्न Arabidopsis लाइनों (ecotype/उत्परिवर्ती लाइनों) के साथ काम करते समय कोई विशिष्ट संशोधन आवश्यक हैं। बीज के आकार, अंकुरण दर और अंकुर के आकार में अंतर को ध्यान में रखते हुए अन्य पौधों की प्रजातियों के लिए आरा ग्रिड और मापने के चरणों का संशोधन किया जाना चाहिए।
  2. 2 मिनट के लिए ट्यूब में 70% इथेनॉल जोड़कर सतह-स्टरलाइज़ Arabidopsis बीज। नसबंदी के दौरान ट्यूबों को धीरे से हिलाएं।
  3. ध्यान से pipetting द्वारा इथेनॉल निकालें, किसी भी बीज खोने के लिए नहीं ख्याल रखना. किसी भी अवशिष्ट इथेनॉल को हटाने के लिए 5 मिनट के लिए ट्यूब में बाँझ पानी जोड़कर बीज धो लें (धीरे धोने की अवधि के दौरान ट्यूबों को हिलाएं)।
  4. गुरुत्वाकर्षण द्वारा ट्यूब के नीचे बीज तलछट दें, शेष पानी को हटा दें।
  5. चरण 2.3 में वर्णित बाँझ पानी के साथ बीज को फिर से 2x कुल्ला करें ताकि यह सुनिश्चित हो सके कि वे किसी भी इथेनॉल लक्षण से मुक्त हैं। गुरुत्वाकर्षण द्वारा ट्यूब के नीचे बीज तलछट दें, शेष पानी को हटा दें।
  6. बीज-जल निलंबन बनाने के लिए बीज युक्त ट्यूब में बाँझ पानी की समान मात्रा जोड़ें।
  7. मध्यम प्लेट के चयनित क्षेत्रों पर दिए गए जीनोटाइप के बीज-जल निलंबन को समान रूप से वितरित करने के लिए बुवाई ग्रिड का उपयोग करें (चित्र 2 और अनुपूरक चित्र 1)। एक विस्तृत विंदुक टिप का उपयोग कर प्रत्येक क्षेत्र में एक पंक्ति में बीज (लगभग 30-40) वितरित.
  8. के बारे में 30 मिनट के लिए बीज क्षेत्रों में पानी सूखी करते हैं, प्लेट (ओं) एक लामिना का प्रवाह हुड में खुला रखने संदूषण को रोकने के लिए. माइक्रोपोर टेप के साथ प्लेट को सील करें और इसे एल्यूमीनियम पन्नी के साथ लपेटें।
  9. अंधेरे में 4 डिग्री सेल्सियस पर 3 दिनों के लिए बीज स्तरीकृत करें (इस्तेमाल किए गए इकोटाइप के आधार पर) बीज सुप्तता को दूर करने और/या समान अंकुरण को बढ़ावा देने के लिए।
  10. अंकुरण को प्रेरित करने के लिए 1 घंटे के लिए स्तरीकृत बीजों के साथ प्लेट को सफेद रोशनी (150 μmol/m2/s) में स्थानांतरित करें (केवल हल्के उपचार के लिए पन्नी को खोलें)।
  11. प्रकाश उपचार के बाद, बीज को प्रकाश से बचाने के लिए प्लेट को एल्यूमीनियम पन्नी के साथ लपेटें और इसे विकास कक्ष में ऊर्ध्वाधर स्थिति में रखें और 21 डिग्री सेल्सियस पर अंधेरे में 4 दिनों के लिए खेती करें।

3. क्लोरोफिल प्रतिदीप्ति माप और विश्लेषण

  1. iReenCAM सिस्टम चालू करें और सुनिश्चित करें कि सिस्टम तैयार है और स्वचालित रूप से शुरू किए गए PS सर्वर सॉफ़्टवेयर में ठीक से कॉन्फ़िगर किया गया है (उदाहरण के लिए, यदि प्रयोग डेटा के लिए पर्याप्त संग्रहण स्थान है, यदि प्रतिदीप्ति कैमरा पीसी से जुड़ा है, आदि)।
  2. नए प्रयोग के > प्रयोग पर क्लिक करके मापन के लिए प्रयोगात्मक योजना बनाने के लिए शेड्यूलर सॉफ़्टवेयर को सक्रिय करें। प्रयोग के लिए एक वर्णनात्मक नाम प्रदान करें और विवरण (विवरण) भरें।
  3. क्रिया जोड़ें पर क्लिक करके प्रयोग के लिए आवश्यक क्रियाएं सेट करें जो प्रयोगात्मक क्रियाओं के शेड्यूल की ओर ले जाएगा।
    नोट: यहां शब्द कार्रवाई का अर्थ है एक पूर्ण प्रयोग करना (यानी, एक प्लेट माप करने के लिए आवश्यक सभी चरणों सहित)।
  4. एकल दौर माप (यानी, प्रकाश/अंधेरे की अवधि की लंबाई) के लिए शर्तें निर्दिष्ट करें।
  5. जनरेट लिस्ट पर क्लिक करके, राउंड मापने के बीच के समय अंतराल को परिभाषित करें। वह समय चुनें जब राउंड शुरू और खत्म होगा (कुल में 4 घंटे) और राउंड के बीच का अंतराल (वर्तमान सेटअप में हर 2 मिनट में एक राउंड)।
  6. जनरेट पर क्लिक करें और सुनिश्चित करें कि स्क्रीन के बाईं ओर उत्पन्न सूची की जांच करके प्रकाश आवेगों के बीच समय सीमा और अंतराल सही हैं।
  7. मापने प्रोटोकॉल (अनुपूरक चित्रा 2) चुनें. भविष्य के संदर्भ के लिए डेटाबेस में सभी संशोधनों को सहेजें।
  8. माप शुरू होने से ठीक पहले, अंधेरे कमरे के अंदर कम तीव्रता ( सामग्री की तालिकादेखें) के हरे रंग की रोशनी का उपयोग करें और मापने वाले कक्ष के अंदर शेल्फ के स्तर को समायोजित करें या पेट्री प्लेट से पन्नी को हटाने से पहले अन्य तैयारी के कदम उठाएं। फिर प्रकाश बंद करें और प्लेटों को पूर्ण अंधेरे में मापने वाले कक्ष में स्थानांतरित करें।
  9. ध्यान से 4 दिन पुराने अंकुर युक्त पेट्री प्लेट को कवर एल्यूमीनियम पन्नी हटा दें. पेट्री प्लेट क्षैतिज डिवाइस को मापने कक्ष के अंदर रखें. कक्ष के अंदर, एक्टिनिक प्रकाश दालों को प्रेरित करें, और चरण 3.1-3.7 में निर्धारित प्रयोग योजना (क्रियाओं) के अनुसार इमेजिंग करें।
    नोट: उन्हें मापने कक्ष में रखने से पहले etiolated अंकुर के साथ प्लेटों के किसी भी रोशनी से बचने के लिए यह महत्वपूर्ण है. एटिओलेटेड रोपाई के साथ प्लेट के साथ हेरफेर अंधेरे कमरे / कक्ष में किया जाना चाहिए (एक संभव प्रयोगात्मक सेटअप के लिए पूरक चित्रा 3 देखें)।

4. डेटा निष्कर्षण और विश्लेषण

  1. माप पूरा करने के बाद, विश्लेषक सॉफ्टवेयर में इसी प्रयोग खोलें.
  2. रोपाई की प्रतिदीप्ति का विश्लेषण करने के लिए, दो प्रकार के मास्क उत्पन्न करें- एक मोटा (ट्रे) मुखौटा जो उस क्षेत्र को कवर करता है जहां अंकुर स्थित हैं, और एक सटीक (पौधा) मुखौटा जो केवल ब्याज के ऊतक (आमतौर पर बीजपत्र) को कवर करता है।
  3. क्लिक करके ट्रे मास्क जनरेट करें नया ट्रे प्रकार बनाएं विकल्प। प्लेट छवि पर संबंधित क्षेत्रों के लिए उपयुक्त जीनोटाइप नाम असाइन करें।
  4. जीनोटाइप असाइन करने के लिए, राउंड में एक इमेज नंबर चुनें और फिर स्क्रीन के ऊपरी हिस्से में लोड इमेज पर क्लिक करें। प्लेट का प्रतिबिंब स्क्रीन पर दिखाया जाएगा। बटन है कि विभिन्न आकार ड्राइंग उपकरण (अनुपूरक चित्रा 4) का प्रतिनिधित्व के सेट में से किसी पर क्लिक करके, प्लेट छवि पर ब्याज के क्षेत्र आकर्षित करने की अनुमति देता है कि नई आकृति मोड दर्ज करें. आवश्यक क्षेत्रों (जैसे, प्लेट पर विभिन्न जीनोटाइप) चुनें और उनके उचित नामकरण प्रदान करते हैं।
  5. आकृति मोड से बाहर निकलने के लिए Esc क्लिक करें। स्टोर ट्रे प्रकार पर क्लिक करके जनरेट किए गए ट्रे मास्क (इसके लिए एक नाम प्रदान करने के बाद) को सहेजें।
  6. एक कदम पीछे जाएं और पिछले चरणों में उत्पन्न मास्क को ट्रे प्रकार विकल्प से उसका नाम चुनकर लागू करें।
  7. उच्च सटीकता के साथ संयंत्र मुखौटा उत्पन्न करने के लिए, प्रतिदीप्ति संकेत तीव्रता के लिए न्यूनतम सीमा मूल्य निर्धारित करने के लिए माप (दौर 91) के 180 मिनट के बाद प्राप्त छवि का उपयोग करें, पृष्ठभूमि शोर घटाव को सक्षम करने. इस के लिए, ऑटो थ्रेसहोल्ड से टिक हटा दें और 0 (अनुपूरक चित्रा 4) पर एक मैनुअल थ्रेशोल्ड सेट.
  8. यह सुनिश्चित करने के लिए पूर्वावलोकन पर क्लिक करें कि ट्रे मास्क प्लेट छवि पर सभी आवश्यक क्षेत्रों (जीनोटाइप) को कवर करता है। इसके लिए राउंड 91 चुनें और रिफ्रेश प्रीव्यू पर क्लिक करें।
  9. रन पर क्लिक करके रन मेनू दर्ज करें। केवल राउंड 91 पर टिक लगाकर राउंड 91 के लिए विशेष रूप से विश्लेषण चलाएं। फिर आउटपुट पथ चुनें और विश्लेषण शुरू करें पर क्लिक करें।
  10. विश्लेषण समाप्त होने के बाद समाप्त मेनू स्वचालित रूप से खुल जाएगा। प्रयोगों से निष्पादित दौर (यह केवल एक ही होगा) उठाओ और इस विशिष्ट समय बिंदु (दौर 91) के लिए डेटा निर्यात करने के लिए विश्लेषण डेटा के लिए विश्लेषक स्विच करें क्लिक करें.
  11. निर्यात किए गए संग्रह से .xsel फ़ाइल निकालें, क्योंकि इस फ़ाइल में ओपन एक्सपोर्ट पार्ट आइकन पर क्लिक करके आवश्यक प्लांट मास्क जानकारी है।
  12. Open Local Analysis Part आइकन पर क्लिक करके प्रयोग को फिर से खोलें। मास्क बिल्डर मेनू फिर से दर्ज करें, छवि लोड करें पर क्लिक करें, राउंड 1 चुनें और फिर स्क्रीन के ऊपरी दाएं कोने में फ़ाइल से लोड करें और पहले निकाली गई .xsel फ़ाइल लोड करें। प्लेट की छवि लागू ट्रे मास्क के साथ दिखाई जाएगी।
  13. स्टोर ट्रे प्रकार पर क्लिक करके मास्क को सहेजें और ट्रे प्रकार द्वारा बदलें विकल्प में इसका नाम चुनकर इसे लागू करें।
  14. प्रतिदीप्ति संकेत तीव्रता सीमा को समायोजित करके संयंत्र मुखौटा उत्पन्न करें। मैनुअल थ्रेसहोल्ड के मूल्य में वृद्धि जब तक पूर्वावलोकन मेनू में उत्पन्न मुखौटा जीनोटाइप (पूरक चित्रा 4) में आरओआई (जैसे, cotyledons) के लिए पूरी तरह से फिट बैठता है. जांचें कि क्या मास्क पूर्वावलोकन मेनू में राउंड में स्क्रॉल करके माप के सभी राउंड में फिट बैठता है (राउंड 1, 61 और 121 पर उचित मास्क पोजिशनिंग की जांच करना पर्याप्त होना चाहिए)।
  15. सभी मापने के दौर और निर्यात डेटा के लिए विश्लेषण करें।
    नोट: आउटपुट फ़ाइल में प्रत्येक समय बिंदु के लिए किसी दिए गए जीनोटाइप के क्लोरोफिल प्रतिदीप्ति मान शामिल हैं, जो पसंद के चार्ट के निर्माण को सक्षम करते हैं और आगे सांख्यिकीय मूल्यांकन की सुविधा प्रदान करते हैं।

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Representative Results

जंगली प्रकार (डब्ल्यूटी), इकोटाइप कोलंबिया -0 (कर्नल -0) के 4-दिवसीय डी-एटिओलेटेड अरबिडोप्सिस अंकुर में नव विकसित प्रक्रिया का उपयोग करके प्राप्त विशिष्ट आउटपुट चित्र 3में दिखाया गया है। नियंत्रण की स्थिति (डीएमएसओ-पूरक एमएस मीडिया) के तहत, क्लोरोफिल बायोसिंथेटिक वक्र क्लोरोफिल संश्लेषण के प्रारंभिक विस्फोट से शुरू होता है, जिसमें विकास के स्कोटोमोर्फोजेनिक चरण के दौरान संश्लेषित प्रोटोक्लोरफिलाइड पूल, प्रकाश-प्रेरित पीओआर 7,8,9 के कारण जल्दी से क्लोरोफिल में परिवर्तित हो जाता है. तेजी से क्लोरोफिल संचय के प्रारंभिक चरण में लगभग 10 मिनट लगते हैं और इसके बाद एक अंतराल चरण होता है, जिसके दौरान अंधेरे-संश्लेषित प्रोटोक्लोरोफिलाइड का मिनिमा पहुंच जाता है (विकिरण के लगभग 30 मिनट बाद; एचपीएलसी-मापा प्रोटोक्लोरोफिलाइड वक्र के लिए,7 देखें)। अंतराल चरण के दौरान, क्लोरोफिल biosynthetic जीन10 upregulated कर रहे हैं, protochlorophyllide के प्रकाश प्रेरित उत्पादन के लिए अग्रणी. नव संश्लेषित प्रोटोक्लोरोफिलाइड को तुरंत क्लोरोफिल में परिवर्तित किया जाता है, घातीय चरण के रूप में पता लगाने योग्य (डब्ल्यूटी कर्नल -0 के मामले में विकिरण के बाद लगभग 120 मिनट से शुरू होता है), डी-एटिओलेटेड अंकुर विकिरण (चित्रा 3) के बाद लगभग 4 घंटे में एक और अंतराल चरण के साथ समाप्त होता है। 6-बेंज़ाइलामिनोप्यूरिन (बीएपी) की उपस्थिति में, घातीय चरण7 के दौरान पहले महत्वपूर्ण अंतर का पता लगाया जा सकता है, क्लोरोफिल जैवसंश्लेषण के बाद के चरणों में क्लोरोफिल कैनेटीक्स पर बीएपी के नकारात्मक प्रभाव का सुझाव देता है (एक्टिनिक प्रकाश के साथ रोशनी की शुरुआत के बाद लगभग 2 घंटे में; चित्रा 3)।

विभिन्न स्थितियों और/या जीनोटाइप की तुलना के लिए, कच्चे डेटा का सामान्यीकरण आवश्यक है। चूंकि विभिन्न परिस्थितियों और/या एटिओलेटेड रोपाई में विभिन्न जीनोटाइप के तहत एचपीएलसी का उपयोग करके कोई क्लोरोफिल पता लगाने योग्य नहीं था, इसलिए हमने संबंधित उपचार और/या जीनोटाइप7 के लिए मापा गया टी0 प्रतिदीप्ति स्तर (एफ0) के लिए सामान्यीकरण (एफ/एफ0) किया। सामान्यीकरण के महत्व को प्रदर्शित करने के लिए, हम कच्चे डेटा और डेटा दोनों को T0 (F0; चित्रा 3 ए और चित्रा 3 बी, क्रमशः)।

Figure 1
चित्रा 1: मापने डिवाइस प्रोटोकॉल अवलोकन। iReenCAM माप और विश्लेषण पाइपलाइन की योजना। (ए) ग्रिड-परिभाषित बीज बुवाई, स्तरीकरण, अंकुरण के प्रकाश प्रेरण और अंधेरे में लंबवत उन्मुख पेट्री प्लेट खेती द्वारा नमूना तैयार करना। (बी) प्लांटस्क्रीन फेनोटाइपिंग एसडब्ल्यू टूलबॉक्स के आधार पर स्वचालित और प्रोग्राम करने योग्य छवि अधिग्रहण और डेटा प्रबंधन के लिए नियंत्रण मॉड्यूल उपयोगकर्ता परिभाषित माप और विश्लेषण प्रोटोकॉल के साथ एचडब्ल्यू ऑपरेशन को नियंत्रित और सिंक्रनाइज़ करके पूरे सिस्टम के संचालन का आयोजन करता है। (सी) मापने प्रोटोकॉल कुल में 4 घंटे के लिए 2 मिनट अंतराल में फ्लोरोसेंट नमूना छवियों के गतिशील माप के लिए डिज़ाइन किया गया है, यानी, 120 मापने के दौर. समय 180 मिनट में अधिग्रहित लंबवत उन्मुख 4-दिन पुराने Arabidopsis अंकुर की प्रतिनिधि झूठी रंग छवि का समय दृश्य फ्रेम ROI मुखौटा पीढ़ी के लिए उपयोग किया जाता है। (डी) ब्याज के एक ऊतक (जैसे, बीजपत्र, hypocotyl, या रूट ज़ोन) के लिए आरओआई को परिभाषित मास्क समय दृश्य फ्रेम पर लागू किया जाता है, पृष्ठभूमि घटाव प्रदर्शन किया जाता है और पिक्सेल प्रतिदीप्ति मूल्यों द्वारा पिक्सेल प्रत्येक आरओआई के लिए (संयंत्र मुखौटा द्वारा परिभाषित) सभी माप दौर से निकाला जाता है. अंत में, कच्चे डेटा (प्रतिदीप्ति एफ) T0 (F0) पर मतलब प्रतिदीप्ति मूल्य के लिए सामान्यीकृत है. स्केल बार = 1 सेमी (ए) और 0.25 सेमी (सी)। आंकड़ा7 से संशोधित किया गया था। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: बीज प्लेसमेंट। यह आंकड़ा आरा ग्रिड का उपयोग करके हल्के-तंग किनारों के साथ पेट्री प्लेट पर अरबिडोप्सिस बीज रखने को दर्शाता है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: अरबिडोप्सिस डी-एटियोलेशन के शुरुआती चरणों में क्लोरोफिल संचय कैनेटीक्स। एटिओलेटेड WT Col-0 अंकुर BAP या DMSO (मॉक) के साथ पूरक मीडिया पर उगाए गए थे। (ए) एसडी (छायांकित क्षेत्र) ± औसत मूल्य, कच्चे डेटा का एन = 9 और (बी) डेटा टी 0 (एफ 0) पर औसत प्रतिदीप्ति मूल्य के लिए सामान्यीकृत है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

अनुपूरक चित्र 1: बुवाई ग्रिड। बाएं: प्रत्येक जीनोटाइप के बीज को एक्टिनिक प्रकाश समरूपता (अधिकतम प्रकाश तीव्रता के 0.7 ≥ प्रकाश तीव्रता) के क्षेत्र में स्थित मापने वाले स्थान पर रखने के लिए उल्लिखित आयताकार बक्से के साथ बुवाई ग्रिड। दाएं: विश्लेषण के लिए उगाए गए 4 दिन पुराने, एटिओलेटेड अरबिडोप्सिस अंकुर का योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व। बुवाई ग्रिड अरबिडोप्सिस बीजों की स्थिति के लिए एक संभावित योजना प्रदान करता है जो प्रकाश एकरूपता और उचित बीज घनत्व सुनिश्चित करता है (प्रत्येक स्लॉट का उपयोग बीज प्लेसमेंट के लिए किया जा सकता है क्योंकि स्लॉट का आकार, स्लॉट के बीच की दूरी और ग्रिड के क्षेत्र में प्रकाश एकरूपता एकीकृत होती है)। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

अनुपूरक चित्रा 2: प्रतिदीप्ति मापने प्रोटोकॉल. कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

अनुपूरक चित्रा 3: अवांछित प्रकाश जोखिम से बचने के लिए अनुमति देता है प्रयोगात्मक विन्यास. (ए) मापने वाले उपकरण को वॉक-इन फाइटोट्रॉन में रखा गया है, (बी) हल्के-तंग दरवाजे से अलग किए गए कक्ष में। (सी) परिभाषित परिस्थितियों (तापमान और सापेक्ष आर्द्रता) के तहत एटिओलेटेड रोपाई के विकास के लिए समर्पित इन विट्रो खेती बक्से (लाल एरोहेड) को डिवाइस (पीले तीरहेड) के ठीक नीचे रखा जाता है, जिससे प्रकाश जोखिम का न्यूनतम जोखिम सुनिश्चित होता है। हरे मंद प्रकाश (नीले तीरहेड) का स्रोत नियंत्रण पीसी (नारंगी तीरहेड) के बगल में दीवार पर लगाया गया है। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

अनुपूरक चित्रा 4: पीएस डेटा विश्लेषक सॉफ्टवेयर का उपयोग कर कार्यप्रवाह में मुखौटा पीढ़ी प्रक्रिया. ट्रे मास्क (चरण 4.3-4.6) और प्लांट मास्क (चरण 4.12) पीढ़ी और डेटा विश्लेषण (चरण 4.7 और 4.13) के लिए किए जाने वाले व्यक्तिगत चरणों के स्क्रीनशॉट प्रिंट करें। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

अनुपूरक चित्रा 5: माप परिवर्तनशीलता को प्रभावित करने वाली बुवाई घनत्व। 4 दिन पुराने, एटिओलेटेड अरबिडोप्सिस डब्ल्यूटी कर्नल -0 अंकुरों में क्लोरोफिल संचय कैनेटीक्स अलग-अलग ( ए) अलग-अलग (व्यक्तिगत अंकुरों के रूप में, यहां एन = 5) या (बी) उच्च (एचडी, एन = 30-40) या (सी) के समूह में कम घनत्व (एलडी, एन = 10-15)। एन बुवाई ग्रिड के प्रति स्लॉट रोपाई की संख्या से मेल खाती है, डेटा एसडी (छायांकित क्षेत्र) ± औसत मूल्यों का प्रतिनिधित्व करता है। उच्च या निम्न घनत्व बुवाई ग्रिड के प्रति स्लॉट रोपाई की संख्या से मेल खाती है जैसा कि उल्लेख किया गया है। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

अनुपूरक चित्र 6: खेती अंतराल और स्थान के लिए प्रजाति-विशिष्ट अनुकूलन की आवश्यकता होती है। "अरबिडोप्सिस-अनुकूलित प्रोटोकॉल का उपयोग करके विभिन्न पौधों की प्रजातियों का विकास"। (ए) बुवाई ग्रिड पर बीज प्लेसमेंट। (बी) 4-दिन पुराने, एटिओलेटेड अंकुर (बाएं से दाएं) अरबिडोप्सिस थालियाना, ब्रैसिका नेपस, और क्रैम्बे एबिसिनिका। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

प्रोटोकॉल और समस्या निवारण के महत्वपूर्ण कदम - कोई प्रकाश नहीं और मास्क का ख्याल रखना
के रूप में ऊपर प्रोटोकॉल विवरण में सीधे प्रकाश डाला गया है, यहां तक कि प्रकाश की ट्रेस मात्रा से परहेज दोनों etiolated पौधों अंकुर की खेती के दौरान या सिर्फ प्रोटोकॉल शुरू करने से पहले महत्वपूर्ण महत्व11 है. हमारे सेटअप में, हम वॉक-इन फाइटोट्रॉन में स्थित एक समर्पित अंधेरे कक्ष का उपयोग करते हैं और लाइट-टाइट घूर्णन दरवाजे(अनुपूरक चित्रा 3)के साथ बाकी फाइटोट्रॉन से अलग होते हैं। कक्ष पौधे की खेती की जगह और कार्यक्षेत्र से सुसज्जित है जो नियंत्रण पीसी और धूआं हुड के साथ डिवाइस को समायोजित करने की अनुमति देता है। यह हम दोनों को अंधेरे में पौधों को विकसित करने और प्लेट परिवहन की आवश्यकता के बिना माप शुरू करने की अनुमति देता है।

प्रस्तावित परख के माध्यम से क्लोरोफिल प्रतिदीप्ति संकेत के बाद की मात्रा का ठहराव के लिए पौधे की खेती और मुखौटा पीढ़ी का तरीका महत्वपूर्ण है। मीडिया में गेलिंग एजेंट या छोटे दृश्य कचरा/धूल के गुच्छों से बचना चाहिए क्योंकि इससे प्रकाश प्रतिबिंब हो सकता है। चूंकि सॉफ्टवेयर द्वारा क्लोरोफिल प्रतिदीप्ति की मान्यता मास्क द्वारा सीमित है, एक संयंत्र क्षेत्र जो मास्क द्वारा कवर नहीं किया जाएगा, बस सॉफ्टवेयर द्वारा विश्लेषण नहीं किया जाएगा। 4 घंटे माप के दौरान, अंकुर थोड़ा बढ़ने/चलते हैं, इसलिए नामित मुखौटा समायोजन की आवश्यकता हो सकती है क्योंकि यह सटीक सिग्नल तीव्रता मात्रा का ठहराव के लिए सभी माप राउंड के माध्यम से फिट नहीं हो सकता है। हमारे अनुभव के अनुसार, अपूर्ण मुखौटा परिभाषा परिवर्तनशीलता का मुख्य स्रोत प्रतीत होती है। अनुकूलन प्रयोगों के दौरान, हमने i) व्यक्तिगत अंकुरों और ii) उच्च (30-40 बीज) और iii) कम (10-15 बीज) घनत्व बुवाई (पूरक चित्रा 5) के साथ रोपाई के एक समूह में विश्लेषण के लिए लिए गए क्लोरोफिल प्रतिदीप्ति मूल्यों की परिवर्तनशीलता में परिवर्तन की निगरानी की। हमने बीज बुवाई के उच्च घनत्व का उपयोग किया क्योंकि इसमें सबसे कम परिवर्तनशीलता दिखाई देती है। व्यक्तिगत पौधों/कम घनत्व वाली बुवाई के मामले में देखी जाने वाली उच्च परिवर्तनशीलता ज्यादातर सिग्नल और पृष्ठभूमि के बीच किनारे पर स्थित पिक्सल के उच्च अनुपात और 4 घंटे माप अंतराल के दौरान अंकुरों की मामूली गति से उत्पन्न होती है।

यह सुनिश्चित करने के लिए कि सभी माप सटीक हैं, जांचें कि क्या प्लांट मास्क पहले दौर में फिट बैठता है, फिर 15वें, 30वें, 45वें, 60वें 75वें और इसी तरह अंतिम एक तक (राउंड की संख्या चुनकर और रिफ्रेश प्रीव्यू पर क्लिक करके)। इसमें केवल कुछ मिनट लगेंगे लेकिन यह सुनिश्चित करेगा कि पूरे बीजपत्र क्षेत्र को कवर और मूल्यांकन किया जा रहा है। यदि किसी भी दौर में पौधे का मुखौटा फिट नहीं होता है (आवश्यक क्षेत्र पूरी तरह से कवर नहीं किया गया है), प्रयोग को कई भागों में विभाजित करें। फिर प्रयोग के प्रत्येक भाग के लिए अलग से एक विशिष्ट मुखौटा बनाने के लिए चरण 4 (4.1-4.13) से शुरू प्रोटोकॉल प्रदर्शन. उदाहरण के लिए, यदि आप राउंड 60-61 (या थोड़ा पहले) पर प्लांट मास्क के विस्थापन को नोटिस करते हैं, तो प्रयोग को दो भागों में विभाजित करें -पहला भाग ( 1-60 राउंड) औरदूसरा भाग ( 61-121 राउंड)। पहलेभाग के लिए प्लांट मास्क उत्पन्न करने के लिए राउंड 41 की छवि का उपयोग करें औरदूसरे भाग के लिए राउंड 91 का उपयोग करें। चरण 4.13 पर, डेटा का विश्लेषण करते समय, विश्लेषण पर क्लिक करने से पहले प्रयोग के संबंधित भाग के अनुसार राउंड चुनने के लिए सावधान रहें (उदाहरण के लिए, पहले भाग के लिए राउंड 1-60 और दूसरे के लिए 61-121, जैसा कि उपरोक्त उदाहरण में है)। Arabidopsis के साथ काम करते समय, पौधों की गति नगण्य होती है क्योंकि वे धीरे-धीरे बढ़ते हैं लेकिन यदि विभिन्न प्रजातियों के लिए प्रोटोकॉल लागू करते हैं (नीचे देखें), तो विकास की गति को ध्यान में रखा जाना चाहिए।

संशोधन और सीमाएं
मापदंडों की संख्या को संशोधित किया जा सकता है, जिसमें एक्टिनिक प्रकाश की तीव्रता और तरंग दैर्ध्य और/या एक्टिनिक प्रकाश अनुप्रयोग के अंतराल के बीच लागू होने वाले प्रकाश शामिल हैं। मापने वाले उपकरण में एकीकृत, पूरी तरह से मोटर चालित और सॉफ्टवेयर-नियंत्रित फिल्टर व्हील शामिल हैं। इस प्रकार, अन्य पिगमेंट की मात्रा का ठहराव के लिए उपयुक्त मापने एल्गोरिथ्म, आमतौर पर टेट्रापाइरोल बायोसिंथेटिक मार्ग10,12 के उत्पादों को भी उपयुक्त फिल्टर जोड़ने के मामले में प्रोटोकॉल में शामिल किया जा सकता है।

इसके अलावा, जैसा कि पहले उल्लेख किया गया था, प्रोटोकॉल का उपयोग न केवल अरबिडोप्सिस पौधों के लिए किया जा सकता है। हालांकि, जब अन्य पौधों की प्रजातियों के साथ काम करते हैं, तो प्रोटोकॉल के प्रत्येक चरण को तदनुसार अंकुरण और विकास दर और/या आकार(अनुपूरक चित्रा 6)सहित प्रजाति-विशिष्ट विशेषताओं को ध्यान में रखते हुए संशोधित किया जाना चाहिए।

प्रोटोकॉल की महत्वपूर्ण सीमाओं में से एक समय अवधि है, जिसके दौरान क्लोरोफिल परिमाणीकरण विश्लेषण किया जा सकता है। क्लोरोफिल फोटोसिस्टम परिसरों में एकीकृत हो जाता है के बाद, प्रतिदीप्ति संकेत प्रकाश संश्लेषण ऊर्जा खपत (क्या चर क्लोरोफिल फ्लोरेसेंस कहा जाता है कहा जाता है मौजूद है) के रूप में डी-etiolation13 के बाद के चरणों के दौरान मनाया गया है द्वारा पक्षपाती हो जाता है. ओजीआईपी यात्रियों परख14,15 का उपयोग करके परख के रूप में, प्रकाश संश्लेषक गतिविधि का कोई संकेत डी-एटिओलेशन7 के पहले 4 घंटे के दौरान इस प्रयोगात्मक सेटअप का उपयोग करके पता लगाने योग्य नहीं था। हालांकि, अगर फोटोमोर्फोजेनेसिस की विस्तारित समय अवधि को परख के लिए माना जाता है, तो फोटोसिस्टम असेंबली का स्तर और समग्र प्रतिदीप्ति स्तरों पर प्रकाश संश्लेषण के संभावित प्रभाव का परीक्षण किया जाना चाहिए।

अंत में, यह उल्लेख किया जाना चाहिए कि प्रतिदीप्ति माप के आधार पर हमारा प्रोटोकॉल, सापेक्ष की अनुमति देता है, पूर्ण क्लोरोफिल मात्रा का ठहराव नहीं। यदि पूर्ण मात्रा का ठहराव की आवश्यकता है, तो इसी अंशांकन को एक विकल्प का उपयोग करके किया जाना चाहिए, जैसे एचपीएलसी दृष्टिकोण।

मौजूदा तरीकों के संबंध में महत्व - उच्च समय और स्थानिक संकल्प के साथ सरल, तेज और सांख्यिकीय रूप से मजबूत क्लोरोफिल मात्रा का ठहराव
यहां वर्णित प्रक्रिया डी-एटियोलेशन के शुरुआती चरणों के दौरान जीवित अरबिडोप्सिस अंकुरों में क्लोरोफिल के वास्तविक समय का पता लगाने और मात्रा का ठहराव करने की अनुमति देती है। ज्यादातर अलग संयंत्र सामग्री16,17 या हाल ही में विकसित ऑप्टिकल तरीकों18,19 से क्लोरोफिल निष्कर्षण पर निर्भर अन्य दृष्टिकोण की तुलना में इस दृष्टिकोण विशुद्ध रूप से गैर इनवेसिव है, प्रतिदीप्ति तीव्रता के विवो माप में द्वारा क्लोरोफिल मात्रा का ठहराव की अनुमति देता है. इसके अलावा, उपरोक्त एचपीएलसी- या स्पेक्ट्रोफोटोमेट्री-आधारित दृष्टिकोणों सहित अन्य मौजूदा वैकल्पिक तरीकों के साथ नमूना तैयार करने के लिए आवश्यक अतिरिक्त अभिकर्मकों की कोई आवश्यकता नहीं है। नया पेश किया गया प्रोटोकॉल सरल, तेज और सटीक है, जैसा कि पहले एचपीएलसी5 का उपयोग करके सत्यापित किया गया था। मानक प्रोटोकॉल सेटिंग्स का उपयोग करते हुए, एक एकल जैविक दोहराने का अंतिम वक्र माप के 4 घंटे के दौरान लिए गए 120 मापने बिंदुओं (प्रतिदीप्ति तीव्रता साधन) से बना है, प्रत्येक में 15 मापने वाले स्पॉट शामिल हैं। आमतौर पर, अंतिम वक्र में तीन जैविक प्रतिकृतियां (जैसे, तीन स्वतंत्र रूप से तैयार प्लेटें), और तीन मापने वाले स्पॉट (तीन तकनीकी प्रतिकृतियां) का डेटा शामिल होता है, जिनमें से प्रत्येक में 30-40 अंकुर होते हैं। इस प्रकार, वहाँ लगभग 300 अंकुर हर समय अंतराल में परख रहे हैं, सांख्यिकीय मजबूत डेटासेट प्रदान करने, मज़बूती से भी छोटे अंतर का पता लगाने के रूप में क्लोरोफिल जैवसंश्लेषण7 के विभिन्न चरणों में प्रभावित म्यूटेंट पर प्रदर्शन के रूप में पता लगाने के लिए अनुमति देता है. यहाँ हम उपयोगकर्ता क्लोरोफिल कैनेटीक्स डेटा विश्लेषण20 के लिए एक उपयुक्त उपकरण के रूप में शास्त्रीय समय श्रृंखला मॉडल के साथ संयुक्त सामान्यीकृत रैखिक मिश्रित मॉडल के आधार पर हाल ही में विकसित सांख्यिकीय दृष्टिकोण को रोजगार के लिए प्रोत्साहित करते हैं.

तकनीक के भविष्य के अनुप्रयोग - तेज और सस्ते स्क्रीनिंग
उपर्युक्त विशेषताएं इस दृष्टिकोण को तेज और सस्ते स्क्रीनिंग और क्लोरोफिल जैवसंश्लेषण के साथ जुड़े लक्षणों (प्रत्यक्ष या अप्रत्यक्ष रूप से) की अत्यधिक सटीक मात्रा का ठहराव के लिए उपयुक्त एक उपयोगी उपकरण बनाती हैं। इसमें क्लोरोफिल जैवसंश्लेषण 10,12,21के जटिल और बहु-स्तरीय नियमों को बेहतर ढंग से चिह्नित करने के लिए आगे आनुवंशिक स्क्रीनिंग को नियोजित करने वाले अध्ययन शामिल हो सकते हैं। विभिन्न यौगिक उपचार की संभावना को ध्यान में रखते हुए, प्रोटोकॉल भी अध्ययन करने के लिए अत्यधिक मूल्यवान है, उदाहरण के लिए, क्लोरोफिल संचय कैनेटीक्स पर संभावित प्रभाव के साथ कम आणविक यौगिकों के लिए प्रकाश-मध्यस्थता हार्मोनल नियमों22,23 या स्क्रीनिंग का महत्व।

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Disclosures

Z.B. और K.P. PSI के कर्मचारी हैं और मार्टिन ट्रिलेक iReenCAM का उत्पादन करने वाली PSI कंपनी के CEO और मालिक हैं। ये सभी लेखक उपकरण के विकास में शामिल थे जैसा कि पहले वर्णितथा 7.

Acknowledgments

इस काम को यूरोपीय क्षेत्रीय विकास कोष-प्रोजेक्ट सिंगिंग प्लांट (सं। CZ.02.1.01/0.0/0.0/16_026/0008446)। इस परियोजना को MSCA4Ukraine परियोजना (आईडी 1233580) के माध्यम से धन प्राप्त हुआ है, जिसे यूरोपीय संघ द्वारा वित्त पोषित किया गया है। हम चित्रा 1 के चित्रमय डिजाइन के लिए लेनका सोचुरकोवा के आभारी हैं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
6-benzylaminopurine Duchefa Biochemie B0904.0001
Aluminum foil Merck Z691577
Arabidopsis thaliana Col-0 seeds NASC collection N1092
Cultivation chamber PSI custom made
Dimethilsulfoxid Thermo Fisher Scientific 042780.AK
Eppendorf single-channeled, variable (100-1000 μL) Merck EP3123000063
Gelrite Duchefa Biochemie G1101
iReenCAM device PSI custom made/prototype
Laboratory bottles, with caps (Duran), 100mL Merck Z305170-10EA
Laminar-flow box UniGreenScheme ITEM-31156
Linerless Rubber Splicing Tape, 19 mm width, black, Scotch 3M Science. Applied to Life 7000006085
Microcentrifuge tube, 2 mL with lid, PPT, BRAND Merck BR780546-500EA
Micropore tape 3M Science. Applied to Life 7100225115
Osram lumilux green l18w/66 Ovalamp 200008833
Petri plates - Greiner dishes, square, 120 x 120 x17mm, vented Merck Z617679-240EA
Pipet tips, 1000 μL, Axygen Merck AXYT1000B
The Plant Screen Data Analyzer software PSI delivered as a part of the iReenCAM

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References

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जीव विज्ञान अंक 203
<em>अरबिडोप्सिस</em> डी-एटियोलेशन के प्रारंभिक चरणों के दौरान क्लोरोफिल बायोसिंथेसिस कैनेटीक्स निर्धारण के लिए गैर-इनवेसिव परख
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Balakhonova, V., Pushkarova, N.,… More

Balakhonova, V., Pushkarova, N., Skalak, J., Dobisova, T., Benedikty, Z., Panzarova, K., Trtilek, M., Hejátko, J. Non-invasive Assay for Chlorophyll Biosynthesis Kinetics Determination during Early Stages of Arabidopsis De-etiolation. J. Vis. Exp. (203), e66087, doi:10.3791/66087 (2024).

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