Summary
Här beskriver vi ett avancerat verktyg som är utformat för övervakning av klorofyllbiosyntes under de tidiga stadierna av Arabidopsis plantavetiolering. Den nya metoden ger icke-invasiv klorofyllfluorescensavbildning i realtid med hög rumslig och tidsmässig upplösning.
Abstract
Klorofyllbiosyntes är ett kännetecken för de-etiolation, ett av de mest dramatiska stadierna i växternas livscykel. Den hårt kontrollerade och mycket dynamiska processen för klorofyllbiosyntes utlöses under övergången från mörker till ljus hos blommande växter. I det ögonblick då etiolerade plantor utsätts för de första spåren av solljus förmedlas snabb (i sekundordning) omvandling av protoklorofyllid till klorofyllid av unika ljusaccepterande proteinkomplex, vilket via efterföljande metaboliska steg leder till produktion av fullt fungerande klorofyll. Standardtekniker för analys av klorofyllinnehåll inkluderar pigmentextraktion från fristående växtvävnader, vilket inte gäller för att studera så snabba processer. För att undersöka klorofyllkinetiken in vivo med hög noggrannhet och spatiotemporal upplösning under de första timmarna efter ljusinducerad de-etiolering utvecklades ett instrument och ett protokoll. Här presenterar vi en detaljerad procedur utformad för statistiskt robust kvantifiering av klorofyll i de tidiga stadierna av Arabidopsis de-etiolation.
Introduction
Avetiolering representerar den mest dramatiska fasen i växternas livscykel, kännetecknad av ett antal morfologiska förändringar och fullständig omorganisering av växtmetabolismen (från hetero- till autotropisk)1. Klorofyllbiosyntes är ett kännetecken för ljusinducerad de-etiolation i växter och en mycket dynamisk process. Bildning av klorofyll från mörkt framställd prekursorprotoklorofyllid måste samordnas noggrant för att undvika skador på grund av reaktiva biprodukter2. Protoklorofyllidreduktionen till klorofyllid katalyseras av ljusberoende protoklorofyllidoxidoreduktaser (POR), unika enzymer som aktiveras direkt av ljus. Reaktionen är mycket snabb och sker i storleksordningen ms till s3, vilket leder till igenkännbar klorofyllackumulering inom några minuter efter bestrålning av etiolerade plantor 4,5,6. Mer tid (från timmar till dagar) krävs för kloroplastbiogenes för att etablera en fullt fungerande fotosyntetisk apparat3.
Det finns olika metoder för att analysera klorofyllhalten, inklusive högpresterande vätskekromatografi (HPLC) eller spektrofotometri. Vanligtvis kräver dessa tekniker förstörelse av växtvävnad 4,5,6, vilket begränsar bestämningen av förändringar i klorofyllnivåer över tiden. Metoder som möjliggör icke-invasiv klorofyllkinetik kan öppna ett helt nytt perspektiv för att studera växter i olika aspekter som sträcker sig från grundläggande forskningsfrågor, såsom analys av processen för klorofyllsyntes i tid och rum, till mer praktiska tillämpningar, såsom bedömning av stresstolerans eller effekt av biostimulanter på klorofyllkinetiken. Med detta i åtanke introducerade vi ett system för övervakning av klorofyllbildning, iReenCAM7. Den innehåller en CCD-kamera, emissionsfilter, ljuskällor och en pipeline för automatiserad fluorescensanalys (figur 1). Huvuddragen i den utvecklade enheten är hög rumslig och tidsmässig upplösning, som överträffar de parametrar som används i nuvarande metoder, och tillräcklig känslighet och specificitet jämfört med standardanalysmetoder7.
Den icke-invasiva procedur som beskrivs här kräver minimalt med reagenser och omfattar enkla steg, vilket gör det möjligt att erhålla en klorofyllkinetisk profil i levande Arabidopsis-plantor under mycket tidiga stadier av de-etiolering. Protokollet kan vara användbart för studier av en mycket dynamisk process för klorofyllsyntes som påverkas av ett antal faktorer, både exogena (salt, torka, biostimulanter, tungmetaller, etc.) och endogena (vanligtvis förknippade med förändringar i genaktiviteten) i ursprung utan att behöva lossa någon växtvävnad, vilket undviker ytterligare stress.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Medium förberedelse
- Bered odlingsmediet genom att blanda 0,75 g geleringsmedel med 50 ml sterilt avjoniserat vatten i en glasflaska för att uppnå en koncentration på 1,5 % (w/v) för en petriskål (120 x 120 x 17 mm). Skaka blandningen försiktigt och värm den sedan i mikrovågsugn tills den kokar för att lösa upp geleringsmedlet (lösningen blir klar).
- Låt mediet svalna till 58-60 °C innan du fortsätter till nästa steg. Alla efterföljande steg måste utföras under sterila förhållanden i en huv med laminärt flöde för att förhindra kontaminering.
- Använd petriplattor med ljustäta kanter för att undvika överdriven aktinisk ljusreflektion och hög bakgrundsautofluorescens under mätningarna. För detta, applicera svart tejp (eller annat tillgängligt medel) för att täcka alla sidor av den tomma petriskålen (Figur 2).
- Utför sterilisering av plattan/plattorna efter applicering av tejp genom bestrålning med bakteriedödande UV-lampa i 20-30 min.
- Om försöket omfattar kemisk behandling (dvs. abiotiska/biotiska stressfaktorer, växthormoner och/eller tillväxtreglerande medel etc.), tillsätt lämplig mängd av motsvarande kemikalie direkt till mediet. Var medveten om att en vald kemisk stabilitet tillsätts till mediet (t.example, om kemikalien inte är termostabil, tillsätt till mediet när det svalnar precis innan du häller det i plattan). Blanda mediet noggrant genom att skaka för att säkerställa en jämn fördelning av kemikalien.
- Undvik att belysa plattorna med UV-ljus efter att mediet har hällts (skulle leda till produktion av syreradikaler som kan störa experimentet).
- Häll det beredda mediet i den fyrkantiga petriskålen/petriskålarna och låt mediet stelna i rumstemperatur.
2. Sterilisering av utsädesytor och växternas tillväxtförhållanden
- Ta den nödvändiga mängden Arabidopsis thaliana Col-0-frön från buljongbalken (10-20 mg) och tillsätt den till ett 2 ml mikrocentrifugrör.
OBS: Inga specifika modifieringar är nödvändiga när du arbetar med olika Arabidopsis-linjer (ekotyp/mutantlinjer). Översyn av såggallret och mätstegen bör utföras för andra växtarter med hänsyn till skillnader i fröstorlek, grobarhet och plantstorlek. - Ytsterilisera Arabidopsis-frön genom att tillsätta 70 % etanol i röret i 2 minuter. Skaka rören försiktigt under steriliseringen.
- Ta bort etanol genom att pipettera försiktigt, var noga med att inte förlora några frön. Tvätta fröna genom att tillsätta sterilt vatten i röret i 5 minuter för att ta bort eventuella rester av etanol (skaka försiktigt rören under tvättperioden).
- Låt fröna sedimentera till botten av röret med hjälp av gravitationen, ta bort det återstående vattnet.
- Skölj fröna igen 2 gånger med sterilt vatten enligt beskrivningen i steg 2.3 för att säkerställa att de är fria från etanolegenskaper. Låt fröna sedimentera till botten av röret med hjälp av gravitationen, ta bort det återstående vattnet.
- Tillsätt en lika stor volym sterilt vatten till röret som innehåller fröna för att skapa en frö-vattensuspension.
- Använd ett sågaller för att jämnt fördela frö-vattensuspensionen av den givna genotypen på de valda områdena på mediumplattan (figur 2 och kompletterande figur 1). Fördela fröna (ca 30-40) i en rad i varje område med hjälp av en bred pipettspets.
- Låt vattnet torka i fröområdena i cirka 30 minuter, håll plattan/plattorna öppna i en huv med laminärt flöde för att förhindra kontaminering. Försegla plattan med mikroportejp och linda in den med aluminiumfolie.
- Stratifiera fröna i 3 dagar vid 4 °C i mörker för att (beroende på vilken ekotyp som används) övervinna frövilan och/eller för att främja jämn groning.
- Överför plattan med stratifierade frön till vitt ljus (150 μmol/m2/s) i 1 timme för att inducera groning (packa upp folien endast för ljusbehandlingen).
- Efter ljusbehandlingen, linda in plattan med aluminiumfolie för att skydda fröna från ljus och placera den i vertikalt läge i en odlingskammare och odla i 4 dagar i mörker vid 21 °C.
3. Mätning och analys av klorofyllfluorescens
- Slå på iReenCAM-systemet och se till att systemet är klart och korrekt konfigurerat i den automatiskt initierade PS-serverprogramvaran (t.ex. om det finns tillräckligt med lagringsutrymme för experimentdata, om fluorescenskameran är ansluten till PC, etc.).
- Aktivera programvaran Scheduler för att skapa experimentplanen för mätningen genom att klicka på Experiment > Nytt experiment. Ange ett beskrivande namn för experimentet och fyll i informationen (beskrivning).
- Ange de åtgärder som krävs för experimentet genom att klicka på Lägg till åtgärd , vilket leder till schemat för experimentella åtgärder.
OBS: Ordet åtgärd betyder här att utföra ett komplett experiment (dvs. inklusive alla steg som krävs för att utföra en plattmätning). - Ange villkoren för en enda omgångsmätning (dvs. längden på ljus-/mörkerperioden).
- Genom att klicka på Generera lista definierar du tidsintervallen mellan mätomgångarna. Välj tid när rundan ska börja och sluta (4 h totalt) och intervallerna mellan varven (i den aktuella inställningen ett varv varannan minut).
- Klicka på Generera och se till att tidsramen och intervallen mellan ljusimpulserna är korrekta genom att kontrollera listan som genereras till vänster på skärmen.
- Välj mätprotokoll (kompletterande figur 2). Spara alla ändringar i databasen för framtida referens.
- Strax innan mätningen startar, använd grönt ljus med låg intensitet (se materialtabell) inne i mörkrummet och justera nivån på hyllan inuti mätkammaren eller utför andra förberedande steg innan du tar bort folien från petriplattan. Stäng sedan av ljuset och överför plattorna till mätkammaren i fullständigt mörker.
- Ta försiktigt bort aluminiumfolien som täcker petriskålen som innehåller de 4 dagar gamla plantorna. Placera petriskålen horisontellt inuti enhetens mätkammare. Inuti kammaren, inducera aktiniska ljuspulser och utför avbildning enligt experimentplanen (åtgärder) som anges i steg 3.1-3.7.
OBS: Det är viktigt att undvika belysning av plattorna med etiolerade plantor innan du placerar dem i mätkammaren. Manipulationen med plattan med etiolerade plantor måste utföras i mörkrummet/kammaren (för en möjlig experimentuppställning, se kompletterande figur 3).
4. Extrahering och analys av data
- När du har slutfört mätningen öppnar du motsvarande experiment i analysatorns programvara.
- För att analysera plantornas fluorescens, generera två typer av masker - en grov (bricka) mask som täcker området där plantorna är belägna, och en exakt (växt) mask som endast täcker vävnaden av intresse (vanligtvis hjärtblad).
- Skapa en fackmask genom att klicka på alternativet Skapa ny facktyp . Tilldela lämpliga genotypnamn till respektive område på plåtbilden.
- För att tilldela genotyp, välj ett bildnummer i Round och klicka sedan på Ladda bild i den övre delen av skärmen. Bilden av plattan kommer att visas på skärmen. Genom att klicka på någon av de knappar som representerar olika former av ritverktyg (kompletterande figur 4) går du in i Nytt formläge som gör det möjligt att rita intresseområdet på plåtbilden. Välj de nödvändiga områdena (t.ex. olika genotyper på plattan) och ange lämplig namngivning.
- Klicka på Esc för att avsluta formläget. Spara den genererade maskeringen i aktivitetsfältet (efter att du har angett ett namn för den) genom att klicka på Typ av aktivitetsfält.
- Gå tillbaka ett steg och använd masken som skapades i föregående steg genom att välja dess namn i alternativet Ändra efter facktyp .
- För att generera växtmask med hög noggrannhet, använd bilden som tagits efter 180 minuters mätning (omgång 91) för att ställa in det lägsta tröskelvärdet för fluorescenssignalens intensitet, vilket möjliggör subtraktion av bakgrundsbrus. För detta, ta bort bocken från Auto Threshold och ställ in en manuell tröskel på 0 (kompletterande figur 4).
- Klicka på Förhandsgranska för att se till att kassettmasken täcker alla nödvändiga områden (genotyper) på plåtbilden. För detta väljer du omgång 91 och klickar på Uppdatera förhandsgranskning.
- Gå in i menyn Kör genom att klicka på Kör. Kör analysen exklusivt för omgång 91 genom att endast sätta en bock på omgång 91. Välj sedan utdatasökvägen och klicka på Starta analys.
- När analysen är klar öppnas menyn Slutför automatiskt. Välj den utförda omgången (det kommer att vara den enda) från experimenten och klicka på Växla analysverktyg till Analyserade data för att exportera data för den här specifika tidpunkten (omgång 91).
- Extrahera .xsel-filen från det exporterade arkivet, eftersom den här filen innehåller den viktigaste växtmaskinformationen genom att klicka på ikonen Öppna exportdel .
- Öppna experimentet igen genom att klicka på ikonen Öppna lokal analysdel . Gå in i Mask Builder-menyn igen, klicka på Ladda bild, välj omgång 1 och sedan Ladda från fil i det övre högra hörnet av skärmen och ladda den tidigare extraherade .xsel-filen. Bilden av plattan kommer att visas med brickmasken applicerad.
- Spara masken genom att klicka på Lagra kassetttyp och använd den genom att välja dess namn i alternativet Ändra efter facktyp .
- Generera växtmasken genom att justera tröskelvärdet för fluorescenssignalens intensitet. Öka värdet för Manuellt tröskelvärde tills masken som genereras i menyn Förhandsgranska passar perfekt till ROI (t.ex. hjärtblad) i var och en av genotyperna (tilläggsfigur 4). Kontrollera om masken passar till alla varv i mätningarna genom att bläddra genom varven (det bör räcka med att kontrollera maskens korrekta placering på varv 1, 61 och 121) i Preview menyn.
- Utför analysen för alla mätomgångar och exportera data.
OBS: Utdatafilen innehåller klorofyllfluorescensvärden för en given genotyp för varje tidpunkt, vilket gör det möjligt att konstruera valfria diagram och underlätta ytterligare statistisk utvärdering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den typiska produktionen som erhålls med den nyutvecklade metoden i de 4 dagar gamla avetiolerade Arabidopsis-plantorna av vildtyp (WT), ekotyp Columbia-0 (Col-0) visas i figur 3. Under kontrollbetingelser (DMSO-kompletterade MS-medier) börjar klorofyllbiosynteskurvan med en första explosion av klorofyllsyntesen, i vilken protoklorfyllidpoolen som syntetiseras under den skotomorfogena fasen av tillväxten, snabbt omvandlas till klorofyll på grund av de ljusinducerade PORs 7,8,9. Den inledande fasen av snabb klorofyllackumulering tar cirka 10 minuter och följs av en fördröjningsfas, under vilken minima för den mörksyntetiserade protoklorofylliden uppnås (cirka 30 minuter efter bestrålning; för den HPLC-uppmätta protoklorofyllidkurvan, se7). Under fördröjningsfasen uppregleras klorofyllbiosyntesgenerna10, vilket leder till ljusinducerad produktion av protoklorofyllid. Den nysyntetiserade protoklorofylliden omvandlas omedelbart till klorofyll, som kan detekteras som exponentiell fas (i fallet med WT Col-0 som börjar cirka 120 minuter efter bestrålning), och avslutas med en annan fördröjningsfas cirka 4 timmar efter den avetiolerade bestrålningen av plantor (figur 3). I närvaro av 6-bensylaminopurin (BAP) kan de första signifikanta skillnaderna detekteras under den exponentiella fas7, vilket tyder på negativ effekt av BAP på klorofyllkinetiken i senare stadier av klorofyllbiosyntesen (cirka 2 timmar efter starten av belysning med aktiniskt ljus; Figur 3).
För jämförelse av olika förhållanden och/eller genotyper är normalisering av rådata nödvändig. Eftersom inget klorofyll kunde detekteras med HPLC under olika betingelser och/eller olika genotyper i etiolerade plantor, utförde vi normaliseringen (F/F0) till T0-fluorescensnivåerna (F0) uppmätta för motsvarande behandling och/eller genotyp7. För att demonstrera vikten av normalisering presenterar vi både rådata och data normaliserade till det genomsnittliga klorofyllfluorescensvärdet för kontrollen mätt vid T0 (F0; Figur 3A respektive figur 3B).
Figur 1: Översikt över mätinstrumentets protokoll. Schemat för iReenCAM mät- och analyspipeline. (A) Provberedning genom rutnätssådd, stratifiering, ljusinduktion av groning och vertikalt orienterad petriskålsodling i mörker. (B) Kontrollmodul för automatisk och programmerbar bildinsamling och datahantering baserad på PlantScreen-fenotypning SW toolbox organiserar driften av hela systemet genom att styra och synkronisera HW-driften med användardefinierat mät- och analysprotokoll. (C) Mätprotokollet är utformat för dynamiska mätningar av de fluorescerande provbilderna i 2 minuters intervall under totalt 4 timmar, dvs 120 mätrundor. Tidsvisuell ram av representativ falsk färgbild av vertikalt orienterade 4-dagars gamla Arabidopsis-plantor som förvärvats vid en tidpunkt på 180 minuter används för generering av ROI-mask. (D) Mask som definierar ROI för en vävnad av intresse (t.ex. hjärtblad, hypokotyl eller rotzon) appliceras på den visuella tidsramen, bakgrundssubtraktion utförs och pixel för pixel fluorescensvärden för varje ROI (definieras av växtmasken) från alla mätomgångar extraheras. Slutligen normaliseras rådata (fluorescens F) till det genomsnittliga fluorescensvärdet vid T0 (F0). Skalstreck = 1 cm (A) och 0,25 cm (C). Siffran ändrades från7. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Placering av frö. Figuren visar hur man placerar Arabidopsisfrön på petriskålen med ljustäta kanter med hjälp av såggallret. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Klorofyllackumuleringskinetik i de tidiga stadierna av Arabidopsis de-etiolation. Etiolerade WT Col-0-plantor odlades på media kompletterat med BAP eller DMSO (mock). (A) Medelvärdet ± SD (skuggat område), n=9 för rådata och (B) data normaliserat till medelfluorescensvärdet vid T0 (F0). Klicka här för att se en större version av denna figur.
Kompletterande figur 1: Sågaller. Vänster: Sågaller med konturerade rektangulära rutor för placering av fröna av varje genotyp på en mätpunkt belägen i området för aktinisk ljushomogenitet (ljusintensitet ≥ 0,7 av den maximala ljusintensiteten). Höger: Schematisk representation av 4 dagar gamla, etiolerade Arabidopsis-plantor som odlats för analysen. Sågallret ger ett möjligt schema för Arabidopsis-fröpositionering som säkerställer lätt homogenitet och korrekt frödensitet (varje slits kan användas för fröplacering eftersom storleken på en slits, avståndet mellan slitsarna och den lätta homogeniteten i rutnätets område är enhetliga). Klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletterande figur 2: Protokoll för fluorescensmätning. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletterande figur 3: Experimentell konfiguration som gör det möjligt att undvika oönskad ljusexponering. (A) Mätanordningen placeras i walk-in-fytotronen, (B) till kammaren som är åtskild av en ljustät dörr. C) De in vitro-odlingslådor (röd pilspets) som är avsedda för tillväxt av etiolerade plantor under definierade förhållanden (temperatur och relativ luftfuktighet) placeras precis under anordningen (gul pilspets), vilket säkerställer minimal risk för ljusexponering. Källan till grönt svagt ljus (blå pilspets) är monterad på väggen bredvid kontrolldatorn (orange pilspets). Klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletterande figur 4: Maskgenereringsprocedur i arbetsflödet med hjälp av PS Data Analyzer-programvara. Skriv ut skärmdumpar av enskilda steg som ska utföras för generering av fackmask (steg 4.3-4.6) och växtmask (steg 4.12) och dataanalys (steg 4.7 och 4.13). Klicka här för att ladda ner den här filen.
Tilläggsfigur 5: Såtäthet som påverkar mätvariabiliteten. Klorofyllackumuleringskinetik i 4 dagar gamla, etiolerade Arabidopsis WT Col-0-plantor som odlas (A) separat (som enskilda plantor, här n = 5) eller i en grupp av (B) hög (HD, n = 30-40) eller (C) låg densitet (LD, n = 10-15). N motsvarar antalet plantor per lucka i sågallret, data representerar medelvärdena ± SD (skuggat område). Den höga eller låga densiteten motsvarar antalet plantor per lucka i sågallret som nämnts. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletterande figur 6: Odlingsintervall och odlingsutrymme kräver artspecifik optimering. Tillväxt av olika växtarter med hjälp av det Arabidopsis-optimerade protokollet. (A) Utsädets placering på sågallret. (B) 4 dagar gamla, etiolerade plantor av (från vänster till höger) Arabidopsis thaliana, Brassica napus och Crambe abyssinica. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kritiska steg i protokollet och felsökning - inget ljus och ta hand om masken
Som framhålls direkt i protokollbeskrivningen ovan är det av avgörande betydelse att undvika även spårmängder av ljus både under odling av etiolerade plantor eller strax innan protokollet påbörjas11. I vår installation använder vi en dedikerad mörk kammare som är placerad i den ingångna fytotronen och separerad från resten av fytotronen med ljustät roterande dörr (kompletterande figur 3). Kammaren är utrustad med växtodlingsutrymme och arbetsbänk som gör det möjligt att rymma enheten tillsammans med kontroll-PC och dragskåp. Detta gör att vi både kan odla plantorna i mörker och starta mätningen utan behov av platttransport.
Sättet att odla och generera masker är avgörande för efterföljande kvantifiering av klorofyllfluorescenssignalen via den föreslagna analysen. Man bör undvika att få klumpar av geleringsmedel eller små visuella skräp/damm i mediet eftersom det kan orsaka ljusreflektion. Eftersom programvarans igenkänning av klorofyllfluorescens begränsas av masken, kommer ett anläggningsområde som inte kommer att täckas av masken helt enkelt inte att analyseras av programvaran. Under 4 timmars mätning växer/rör sig plantor lite, därför kan den utsedda masken kräva justeringar eftersom den kanske inte passar igenom alla mätomgångar för den exakta kvantifieringen av signalintensiteten. Enligt vår erfarenhet verkar den ofullständiga maskdefinitionen vara den främsta källan till variabilitet. Under optimeringsexperimenten övervakade vi förändringarna i variabiliteten av klorofyllfluorescensvärden som togs för analys i i) enskilda plantor och en grupp plantor med ii) högre (30-40 frön) och iii) lägre (10-15 frön) densitetssådd (tilläggsfigur 5). Vi använde en högre täthet av frösådd eftersom den visade den lägsta variabiliteten. Den högre variabiliteten som ses vid enskilda plantor/sådd med lägre densitet beror främst på den högre andelen pixlar som ligger vid kanten mellan signalen och bakgrunden och plantornas lilla rörelse under det 4 timmar långa mätintervallet.
För att säkerställa att alla mätningar är korrekta, kontrollera om växtmasken passar den första omgången, sedan till den 15:e, 30:e, 45:e, 60:e 75:e och så vidare till den sista (genom att välja omgångens nummer och klicka på Uppdatera förhandsgranskning). Detta tar bara ett par minuter men kommer att säkerställa att hela hjärtbladsområdet täcks och utvärderas. Om växtmasken inte passar i någon omgång (det önskade området är inte helt täckt), dela upp experimentet i flera delar. Utför sedan protokollet från steg 4 (4.1-4.13) för att skapa en specifik mask separat för varje del av experimentet. Om du till exempel märker att växtmasken förskjuts vid varv 60-61 (eller något tidigare), dela upp experimentet i två delar - 1st del (1-60 varv) och 2st del (61-121 varv). För den 1:a delen använder du bilden av varv 41 för att skapa en växtmask och för den 2:a delen använder du varv 91. I steg 4.13, när du analyserar data, var noga med att välja omgångar enligt motsvarande del av experimentet (t.ex. avrundningar 1-60 för den första delen och 61-121 för den andra, som i det tidigare nämnda exemplet) innan du klickar på Analysera. När man arbetar med Arabidopsis är växternas rörelse försumbar eftersom de växer ganska långsamt, men om man tillämpar protokollet för olika arter (se nedan) bör tillväxttakten beaktas.
Ändringar och begränsningar
Antalet parametrar kan ändras, inklusive intensiteten och våglängden för det aktiniska ljuset och/eller det ljus som appliceras mellan intervallen för aktinisk ljusapplicering. Mätanordningen inkluderar det integrerade, helt motoriserade och mjukvarustyrda filterhjulet. Den mätalgoritm som lämpar sig för kvantifiering av andra pigment, vanligtvis även produkter av tetrapyrolens biosyntesväg10,12, kan därför ingå i protokollet om lämpliga filter tillsätts.
Dessutom, som det nämndes tidigare, kan protokollet användas inte bara för Arabidopsis-växter . Vid arbete med andra växtarter bör dock varje steg i protokollet revideras i enlighet med detta, med beaktande av artspecifika egenskaper, inklusive grobarhet och tillväxthastighet och/eller storlek (kompletterande figur 6).
En av de viktiga begränsningarna i protokollet är den tidsperiod under vilken klorofyllkvantifieringsanalysen kan utföras. Efter att klorofyll har integrerats i fotosystemkomplexen blir fluorescenssignalen förspänd av fotosyntesens energiförbrukning (det som kallas den variabla klorofyllblomman är närvarande) som har observerats under senare stadier av de-etiolation13. Som analyserades med OJIP-transientanalys14,15 kunde inga tecken på fotosyntetisk aktivitet detekteras med denna experimentella uppställning under de första 4 timmarna av de-etiolation7. Om den förlängda tidsperioden för fotomorfogenes antas/måste analyseras, bör dock fotosystemens sammansättningsnivå och fotosyntesens möjliga effekt på de totala fluorescensnivåerna testas.
Slutligen bör det nämnas att vårt protokoll baserat på fluorescensmätningarna tillåter relativ, inte absolut klorofyllkvantifiering. Om absolut kvantifiering krävs måste motsvarande kalibrering utföras med hjälp av en alternativ metod, t.ex. HPLC-metod.
Betydelse i förhållande till befintliga metoder - enkel, snabb och statistiskt robust klorofyllkvantifiering med hög tids- och rumslig upplösning
Proceduren som beskrivs här gör det möjligt att i realtid detektera och kvantifiera klorofyll i levande Arabidopsis-plantor under tidiga stadier av de-etiolering. Jämfört med andra metoder som främst bygger på klorofyllextraktion från avskilt växtmaterial 16,17 eller nyligen utvecklade optiska metoder18,19 är detta tillvägagångssätt helt icke-invasivt, vilket möjliggör klorofyllkvantifiering genom in vivo-mätning av fluorescensintensiteten. Det finns inte heller något behov av ytterligare reagenser som är nödvändiga för provberedning som med andra befintliga alternativa metoder, inklusive de tidigare nämnda HPLC- eller spektrofotometribaserade metoderna. Det nyligen introducerade protokollet är enkelt, snabbt och exakt, vilket tidigare verifierats med HPLC5. Med hjälp av standardprotokollinställningarna görs den slutliga kurvan för en enda biologisk upprepning av 120 mätpunkter (fluorescensintensitetsmedelvärden) som tas under 4 timmar av mätningen, var och en bestående av upp till 15 mätpunkter. Vanligtvis innehåller den slutliga kurvan data från tre biologiska repliker (t.ex. tre oberoende preparerade plattor) och tre mätpunkter (tre tekniska kopior), var och en bestående av 30-40 plantor. Således finns det cirka 300 plantor analyserade i varje tidsintervall, vilket ger statistiskt robust data, vilket gör det möjligt att på ett tillförlitligt sätt detektera även små skillnader som demonstrerats på mutanter som påverkas i olika steg av klorofyllbiosyntes7. Här uppmuntrar vi användaren att använda den nyligen utvecklade statistiska metoden baserad på generaliserade linjära blandade modeller i kombination med klassiska tidsseriemodeller som ett lämpligt verktyg för analys av klorofyllkinetikdata20.
Framtida tillämpningar av tekniken - snabb och billig screening
De ovan nämnda egenskaperna gör detta tillvägagångssätt till ett användbart verktyg som lämpar sig för snabb och billig screening och mycket exakt kvantifiering av egenskaper som är associerade (direkt eller indirekt) med klorofyllbiosyntes. Detta kan inkludera studier som använder den framåtriktade genetiska screeningen för att bättre karakterisera de komplexa och flernivåregleringarna av klorofyllbiosyntes 10,12,21. Med tanke på möjligheten till olika sammansatta behandlingar är protokollet också mycket värdefullt för att studera till exempel betydelsen av ljusmedierad hormonell reglering22,23 eller screening för lågmolekylära föreningar med möjlig inverkan på klorofyllackumuleringskinetiken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Z.B. och K.P. är anställda av PSI och Martin Trtilek är VD och ägare av PSI-företaget som tillverkar iReenCAM. Alla dessa författare var involverade i utvecklingen av instrumentet som tidigare beskrivits7.
Acknowledgments
Detta arbete har fått stöd från Europeiska regionala utvecklingsfonden-projektet SINGING PLANT (nr. CZ.02.1.01/0.0/0.0/16_026/0008446). Detta projekt har fått finansiering genom MSCA4Ukraine-projektet (ID 1233580), som finansieras av Europeiska unionen. Vi är tacksamma mot Lenka Sochurkova för den grafiska designen av figur 1.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6-benzylaminopurine | Duchefa Biochemie | B0904.0001 | |
| Aluminum foil | Merck | Z691577 | |
| Arabidopsis thaliana Col-0 seeds | NASC collection | N1092 | |
| Cultivation chamber | PSI | custom made | |
| Dimethilsulfoxid | Thermo Fisher Scientific | 042780.AK | |
| Eppendorf single-channeled, variable (100-1000 μL) | Merck | EP3123000063 | |
| Gelrite | Duchefa Biochemie | G1101 | |
| iReenCAM device | PSI | custom made/prototype | |
| Laboratory bottles, with caps (Duran), 100mL | Merck | Z305170-10EA | |
| Laminar-flow box | UniGreenScheme | ITEM-31156 | |
| Linerless Rubber Splicing Tape, 19 mm width, black, Scotch | 3M Science. Applied to Life | 7000006085 | |
| Microcentrifuge tube, 2 mL with lid, PPT, BRAND | Merck | BR780546-500EA | |
| Micropore tape | 3M Science. Applied to Life | 7100225115 | |
| Osram lumilux green l18w/66 | Ovalamp | 200008833 | |
| Petri plates - Greiner dishes, square, 120 x 120 x17mm, vented | Merck | Z617679-240EA | |
| Pipet tips, 1000 μL, Axygen | Merck | AXYT1000B | |
| The Plant Screen Data Analyzer software | PSI | delivered as a part of the iReenCAM |
References
- Arsovski, A. A., Galstyan, A., Guseman, J. M., Nemhauser, J. L.
- Reinbothe, S., Reinbothe, C., Apel, K., Lebedev, N. Evolution of chlorophyll biosynthesis--the challenge to survive photooxidation. Cell. 86 (5), 703-705 (1996).
- Heyes, D. J., et al. Photocatalysis as the 'master switch' of photomorphogenesis in early plant development. Nat Plants. 7 (3), 268-276 (2021).
- Hu, X. Y., Tanaka, A., Tanaka, R. Simple extraction methods that prevent the artifactual conversion of chlorophyll to chlorophyllide during pigment isolation from leaf samples. Plant Methods. 9 (1), 19 (2013).
- Chazaux, M., Schiphorst, C., Lazzari, G., Caffarri, S. Precise estimation of chlorophyll a, b and carotenoid content by deconvolution of the absorption spectrum and new simultaneous equations for chl determination. Plant J. 109 (6), 1630-1648 (2022).
- Marr, I. L., Suryana, N., Lukulay, P., Marr, M. I. Determination of chlorophyll-a and chlorophyll-b by simultaneous multicomponent spectrophotometry. Fresenius J Anal Chem. 352 (5), 456-460 (1995).
- Balakhonova, V., et al. Ireencam: Automated imaging system for kinetic analysis of photosynthetic pigment biosynthesis at high spatiotemporal resolution during early deetiolation. Front Plant Sci. 14, 1093292 (2023).
- Virgin, H. I., Kahn, A., Vonwettstein, D. The physiology of chlorophyll formation in relation to structural changes in chloroplasts. Photochem Photobiol. 2 (2), 83-91 (1963).
- Reinbothe, C., et al. Chlorophyll biosynthesis: Spotlight on protochlorophyllide reduction. Trends Plant Sci. 15 (11), 614-624 (2010).
- Kobayashi, K., Masuda, T. Transcriptional regulation of tetrapyrrole biosynthesis in arabidopsis thaliana. Front Plant Sci. 7, 1811 (2016).
- Wang, Y., Folta, K. M. Contributions of green light to plant growth and development. Am J Bot. 100 (1), 70-78 (2013).
- Brzezowski, P., Richter, A. S., Grimm, B. Regulation and function of tetrapyrrole biosynthesis in plants and algae. Biochim Biophys Acta. 1847 (9), 968-985 (2015).
- Pipitone, R., et al. A multifaceted analysis reveals two distinct phases of chloroplast biogenesis during de-etiolation in arabidopsis. eLife. 10, e62709 (2021).
- Stirbet, A. G. On the relation between the kautsky effect (chlorophyll a fluorescence induction) and photosystem ii: Basics and applications of the ojip fluorescence transient. J Photochem Photobiol B-Biol. 104 (1-2), 236-257 (2011).
- Kupper, H., et al. Analysis of ojip chlorophyll fluorescence kinetics and q(a) reoxidation kinetics by direct fast imaging. Plant Physiol. 179 (2), 369-381 (2019).
- Avin-Wittenberg, T., et al. Global analysis of the role of autophagy in cellular metabolism and energy homeostasis in arabidopsis seedlings under carbon starvation. Plant Cell. 27 (2), 306-322 (2015).
- Kósa, A., Preininger, É, Böddi, B. Nitrogen deficiency hinders etioplast development in stems of dark-grown pea (pisum sativum) shoot cultures. Physiol Plant. 155 (3), 330-337 (2015).
- Liang, Y., et al. A nondestructive method to estimate the chlorophyll content of arabidopsis seedlings. Plant Met. 13 (1), 26 (2017).
- Pérez-Patricio, M., et al. Optical method for estimating the chlorophyll contents in plant leaves. Sensors. 18 (2), 650 (2018).
- Spyroglou, I., et al. Mixed models as a tool for comparing groups of time series in plant sciences. Plants (Basel). 10 (2), (2021).
- Tanaka, R., Kobayashi, K., Masuda, T.
- De Wit, M., Galvao, V. C., Fankhauser, C. Light-mediated hormonal regulation of plant growth and development. Annu Rev Plant Biol. 67, 513-537 (2016).
- Liu, X., Li, Y., Zhong, S. Interplay between light and plant hormones in the control of arabidopsis seedling chlorophyll biosynthesis. Front Plant Sci. 8, 1433 (2017).
