Summary
Her beskriver vi et avansert verktøy designet for klorofyllbiosynteseovervåking i de tidlige stadiene av Arabidopsis frøplante de-etiolasjon. Den nye metodikken gir ikke-invasiv klorofyllfluorescensavbildning i sanntid ved høy romlig og tidsmessig oppløsning.
Abstract
Klorofyllbiosyntese er et kjennetegn på de-etiolering, et av de mest dramatiske stadiene i plantens livssyklus. Den tett kontrollerte og svært dynamiske prosessen med klorofyllbiosyntese utløses under skiftet fra mørket til lyset i blomstrende planter. I det øyeblikket etiolerte frøplanter blir utsatt for de første sporene av sollys, formidles rask (i rekkefølge av sekunder) omdannelse av protoklorofyllid til klorofyllid av unike lysaksepterende proteinkomplekser, som via etterfølgende metabolske trinn fører til produksjon av fullt funksjonell klorofyll. Standard teknikker for klorofyllinnholdsanalyse inkluderer pigmentekstraksjon fra frittliggende plantevev, noe som ikke gjelder for å studere slike raske prosesser. For å undersøke klorofyllkinetikk in vivo med høy nøyaktighet og spatiotemporal oppløsning i de første timene etter lysindusert de-etiolasjon, ble et instrument og en protokoll utviklet. Her presenterer vi en detaljert prosedyre designet for statistisk robust kvantifisering av klorofyll i de tidlige stadiene av Arabidopsis de-etiolasjon.
Introduction
De-etiolasjon representerer den mest dramatiske fasen i plantens livssyklus, preget av en rekke morfologiske endringer og fullstendig omlegging av plantemetabolisme (fra hetero- til autotropisk)1. Klorofyllbiosyntese er et kjennetegn på lysindusert de-etiolasjon i planter og en meget dynamisk prosess. Dannelse av klorofyll fra mørkprodusert forløper protoklorofyllid må koordineres tett for å unngå skade på grunn av reaktive biprodukter2. Protoklorfyllidreduksjonen til klorofyllid katalyseres av lysavhengige protoklorofyllidoksidoreduktaser (PORs), unike enzymer aktivert direkte av lys. Reaksjonen er svært rask, og finner sted i størrelsesorden mstil s 3, noe som fører til gjenkjennelig klorofyllakkumulering i løpet av minutter etter etiolert frøplantebestråling 4,5,6. Mer tid (fra timer til dager) er nødvendig for kloroplastbiogenese for å etablere et fullt funksjonelt fotosyntetisk apparat3.
Det finnes ulike metoder for å analysere klorofyllinnhold, inkludert høyytelsesvæskekromatografi (HPLC) eller spektrofotometri. Vanligvis krever disse teknikkene ødeleggelse av plantevev 4,5,6, noe som begrenser bestemmelsen av endringer i klorofyllnivåer over tid. Metoder som tillater ikke-invasiv klorofyllkinetikketablering kan åpne et helt nytt perspektiv for å studere planter i ulike aspekter som spenner fra grunnleggende forskningsspørsmål, for eksempel å analysere prosessen med klorofyllsyntese i tid og rom, til mer praktiske anvendelser, for eksempel vurdering av stresstoleranse eller effekt av biostimulerende midler på klorofyllkinetikken. Med tanke på dette introduserte vi et system for overvåking av klorofylldannelse, iReenCAM7. Den inneholder et CCD-kamera, utslippsfiltre, lyskilder og en rørledning for automatisert fluorescensanalyse (figur 1). Hovedtrekk ved den utviklede enheten er høy romlig og tidsmessig oppløsning, som overgår parametrene som brukes i dagens tilnærminger, og tilstrekkelig følsomhet og spesifisitet sammenlignet med standard analytiske metoder7.
Den ikke-invasive prosedyren beskrevet her krever minimale reagenser og består av enkle trinn, noe som gjør det mulig å oppnå en klorofyllkinetikkprofil i levende Arabidopsis-frøplanter under svært tidlige stadier av de-etiolering. Protokollen kan være nyttig for studiet av svært dynamisk prosess med klorofyllsyntese påvirket av antall faktorer, både eksogene (salt, tørke, biostimulerende midler, tungmetaller, etc.) og endogene (vanligvis forbundet med endringer i genaktiviteten) i opprinnelse uten behov for å løsne plantevev, og dermed unngå ekstra stress.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Middels forberedelse
- Klargjør dyrkingsmidlet ved å blande 0,75 g geleringsmiddel med 50 ml sterilt avionisert vann i en glassflaske for å oppnå en konsentrasjon på 1,5 % (w/v) for én petriskplate (120 x 120 x 17 mm). Rist blandingen forsiktig og varm den deretter i en mikrobølgeovn til den koker for å oppløse geleringsmidlet (løsningen blir klar).
- La mediet avkjøles til 58-60 °C før du går videre til neste trinn. Alle påfølgende trinn må utføres under sterile forhold i en hette med laminær luftstrøm for å forhindre forurensning.
- Bruk petrisklater med lyse tette kanter for å unngå overdreven aktinisk lysrefleksjon og høy bakgrunnsautofluorescens under målingene. For dette, bruk svart tape (eller andre tilgjengelige midler) for å dekke alle sidene av den tomme petriskplaten (figur 2).
- Utfør sterilisering av platen(e) etter tapepåføring ved bestråling med bakteriedrepende UV-lampe i 20-30 min.
- Hvis forsøket involverer kjemisk behandling (dvs. abiotiske / biotiske stressorer, plantehormoner og / eller vekstregulatorer, etc.), tilsett riktig mengde tilsvarende kjemikalie direkte til mediet. Vær oppmerksom på at en valgt kjemisk stabilitet blir tilsatt mediet (for eksempel hvis kjemikaliet ikke er termostabilt, tilsett mediet når det er avkjølt rett før det helles i platen). Bland mediet grundig ved å riste for å sikre en jevn fordeling av kjemikaliet.
- Unngå belysning av plater til UV-lys etter at mediet er hellet (vil føre til oksygenradikalproduksjon som kan forstyrre eksperimentet).
- Hell det tilberedte mediet i firkantet petriskålen(e) og la mediet størkne ved romtemperatur.
2. Frøoverflatesterilisering og plantevekstforhold
- Få den nødvendige mengden Arabidopsis thaliana Col-0 frø fra lagerbalken (10-20 mg) og legg den til et 2 ml mikrosentrifugerør.
MERK: Ingen spesifikke modifikasjoner er nødvendige når du arbeider med forskjellige Arabidopsis-linjer (økotype / mutantlinjer). Revisjon av saggitteret og måletrinn bør utføres for andre plantearter, idet det tas hensyn til forskjeller i frøstørrelse, spirehastighet og frøplantestørrelse. - Overflatesteriliser Arabidopsis-frø ved å tilsette 70% etanol til røret i 2 minutter. Rist forsiktig rørene under sterilisering.
- Fjern etanol ved å pipettere forsiktig, pass på at du ikke mister frø. Vask frøene ved å tilsette sterilt vann til røret i 5 minutter for å fjerne gjenværende etanol (rist rørene forsiktig i vaskeperioden).
- La frøene sedimentere til bunnen av røret ved tyngdekraften, fjern det gjenværende vannet.
- Skyll frøene igjen 2x med sterilt vann som beskrevet i trinn 2.3 for å sikre at de er fri for etanolegenskaper. La frøene sedimentere til bunnen av røret ved tyngdekraften, fjern det gjenværende vannet.
- Tilsett et like stort volum sterilt vann til røret som inneholder frøene for å lage en frøvannssuspensjon.
- Bruk et sågitter for å fordele frøvannssuspensjonen av den gitte genotypen jevnt på de utvalgte områdene av mediumplaten (figur 2 og tilleggsfigur 1). Fordel frøene (ca. 30-40) på rad i hvert område ved hjelp av en bred pipettespiss.
- La vannet tørke i frøområdene i ca. 30 min, og hold tallerkenen(e) åpen i en avtrekkshette for laminær luftstrøm for å forhindre forurensning. Forsegl platen med mikroporetape og pakk den inn med aluminiumsfolie.
- Stratifiser frøene i 3 dager ved 4 °C i mørke for å (avhengig av hvilken økotype som brukes) overvinne frødvalen og/eller for å fremme jevn spiring.
- Overfør platen med stratifiserte frø til hvitt lys (150 μmol / m2 / s) i 1 time for å indusere spiring (pakk ut folien bare for lysbehandlingen).
- Etter lysbehandlingen, pakk platen inn med aluminiumsfolie for å beskytte frøene mot lys og legg den i vertikal stilling i et vekstkammer og dyrk i 4 dager i mørket ved 21 °C.
3. Klorofyllfluorescensmåling og analyse
- Slå på iReenCAM-systemet og sørg for at systemet er klart og riktig konfigurert i den automatisk initierte PS-serverprogramvaren (f.eks. hvis det er nok lagringsplass for eksperimentdataene, hvis fluorescenskameraet er koblet til PC osv.).
- Aktiver Scheduler-programvaren for å opprette den eksperimentelle planen for målingen ved å klikke Eksperimenter > Nytt eksperiment. Oppgi et beskrivende navn for eksperimentet, og fyll ut detaljene (beskrivelse).
- Angi de nødvendige handlingene for eksperimentet ved å klikke på Legg til handling , som fører til tidsplanen for eksperimentelle handlinger.
MERK: Ordet handling betyr her å utføre et komplett eksperiment (dvs. inkludere alle trinnene som er nødvendige for å utføre en platemåling). - Spesifiser betingelsene for en enkelt rund måling (dvs. lengden på lys / mørkeperiode).
- Ved å klikke Generer liste definerer du tidsintervallene mellom målerundene. Velg tidspunkt for når runden skal starte og slutte (4 t totalt) og intervallene mellom rundene (i det nåværende oppsettet en runde hvert 2. minutt).
- Klikk på Generer og kontroller at tidsrammen og intervallene mellom lysimpulser er riktige ved å sjekke listen som genereres på venstre side av skjermen.
- Velg måleprotokoll (tilleggsfigur 2). Lagre alle endringer i databasen for fremtidig referanse.
- Rett før målingen starter, bruk grønt lys med lav intensitet (se Materialfortegnelse) inne i det mørke rommet og juster nivået på hyllen inne i målekammeret eller utfør andre forberedelsestrinn før du fjerner folien fra petriskplaten. Slå deretter av lyset og overfør platene inn i målekammeret i fullstendig mørke.
- Fjern forsiktig aluminiumsfolien som dekker petriskplaten som inneholder de 4 dager gamle plantene. Plasser petriskplaten horisontalt inne i enhetens målekammer. Inne i kammeret, indusere aktiniske lyspulser, og utfør avbildning i henhold til eksperimentplanen (handlinger) satt i trinn 3.1-3.7.
MERK: Det er viktig å unngå belysning av platene med etiolerte frøplanter før du plasserer dem i målekammeret. Manipulasjonen med platen med etiolerte frøplanter må utføres i mørkerommet/kammeret (for et mulig eksperimentelt oppsett, se tilleggsfigur 3).
4. Datautvinning og analyse
- Etter å ha fullført målingen, åpne det tilsvarende eksperimentet i analysatorprogramvaren.
- For å analysere fluorescensen til plantene, generer to typer masker - en grov (brett) maske som dekker området der plantene er plassert, og en presis (plante) maske som bare dekker vevet av interesse (vanligvis cotyledoner).
- Generer en skuffmaske ved å klikke på alternativet Opprett ny skuffetype . Tilordne de riktige genotypenavnene til de respektive områdene på platebildet.
- For å tilordne genotype, velg et bildenummer på Rund og klikk deretter Last inn bilde i den øvre delen av skjermen. Bildet av platen vises på skjermen. Ved å klikke på et av settene med knapper som representerer forskjellige figurer tegneverktøy (tilleggsfigur 4), skriv inn Ny formmodus som gjør det mulig å tegne interesseområdet på platebildet. Velg de nødvendige områdene (f.eks. forskjellige genotyper på platen) og gi riktig navngivning.
- Klikk Esc for å avslutte figurmodus. Lagre den genererte skuffmasken (etter at du har angitt et navn for den) ved å klikke på Lagre skufftype.
- Gå tilbake et trinn og bruk masken som ble generert i tidligere trinn ved å velge navnet fra alternativet Endre etter skuffetype .
- For å generere plantemaske med høy nøyaktighet, bruk bildet som er tatt etter 180 minutters måling (rundt 91) for å angi minimumsgrenseverdien for fluorescenssignalintensitet, slik at bakgrunnsstøysubtraksjon. For dette, fjern haken fra Auto Threshold og sett en manuell terskel på 0 (tilleggsfigur 4).
- Klikk Forhåndsvisning for å sikre at skuffemasken dekker alle nødvendige områder (genotyper) på platebildet. For dette velger du runde 91 og klikker Oppdater forhåndsvisning.
- Gå inn i Run-menyen ved å klikke Kjør. Kjør analysen utelukkende for runde 91 ved å sette en hake bare på runde 91. Velg deretter utgangsbanen og klikk Start analyse.
- Etter at analysen er fullført, åpnes Fullfør-menyen automatisk. Velg den utførte runden (det vil være den eneste) fra eksperimenter og klikk Bytt analysator til analyserte data for å eksportere dataene for dette spesifikke tidspunktet (runde 91).
- Pakk ut XSEL-filen fra det eksporterte arkivet, siden denne filen inneholder den essensielle plantemaskeinformasjonen ved å klikke Åpne Eksporter del-ikonet .
- Åpne eksperimentet på nytt ved å klikke på ikonet Åpne lokal analysedel . Gå inn i Mask Builder-menyen igjen, klikk Last inn bilde, velg runde 1 og deretter Last fra fil øverst til høyre på skjermen og last inn den tidligere utpakkede .xsel-filen. Bildet av platen vises med brettmasken på.
- Lagre masken ved å klikke Lagre skufftype og bruk den ved å velge navnet i alternativet Endre etter skuffetype .
- Generer plantemasken ved å justere fluorescenssignalintensitetsterskelen. Øk verdien for manuell terskel til masken som genereres i forhåndsvisningsmenyen , passer perfekt til avkastningen (f.eks. cotyledoner) i hver av genotypene (tilleggsfigur 4). Sjekk om masken passer til alle runder av målingene ved å bla gjennom rundene (det skal være nok å sjekke riktig maskeplassering i runde 1, 61 og 121) i forhåndsvisningsmenyen .
- Utfør analysen for alle målerunder og eksporter data.
MERK: Utdatafilen inneholder klorofyllfluorescensverdier av en gitt genotype for hvert tidspunkt, noe som gjør det mulig å konstruere valgfrie diagrammer og legge til rette for ytterligere statistisk evaluering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den typiske produksjonen oppnådd ved hjelp av den nyutviklede prosedyren i de 4 dager gamle de-etiolerte Arabidopsis-plantene av villtype (WT), økotype Columbia-0 (Col-0) er vist i figur 3. Under kontrollbetingelser (DMSO-supplert MS-media) starter klorofyll biosyntetiske kurve med et første utbrudd av klorofyllsyntesen, hvor protoklorfyllidbassenget syntetisert under den skotomorfogene fasen av veksten, raskt omdannes til klorofyll på grunn av de lysinduserte PORs 7,8,9. Den innledende fasen av rask klorofyllakkumulering tar ca. 10 minutter og etterfølges av en lagfase, hvor minima av det mørksyntetiserte protoklorfyllidet nås (ca. 30 minutter etter bestråling; for den HPLC-målte protoklorofyllidkurven, se7). I lagfasen oppreguleres klorofyllets biosyntetiske gener10, noe som fører til lysindusert produksjon av protoklorofyllid. Det nylig syntetiserte protoklorfyllidet omdannes umiddelbart til klorofyll, detekterbart som eksponentiell fase (i tilfelle WT Col-0 starter ca. 120 minutter etter bestråling), og avsluttes med en annen lagfase ca. 4 timer etter den de-etiolerte frøplantebestrålingen (figur 3). I nærvær av 6-benzylaminopurine (BAP) kan de første signifikante forskjellene påvises under eksponentiell fase7, noe som tyder på negativ effekt av BAP på klorofyllkinetikken i senere stadier av klorofyllbiosyntese (ca. 2 timer etter starten av belysning med aktinisk lys; Figur 3).
For sammenligning av ulike tilstander og/eller genotyper er normalisering av rådataene nødvendig. Siden klorofyll ikke kunne påvises med HPLC under ulike forhold og/eller ulike genotyper i etiolerte frøplanter, utførte vi normaliseringen (F/F0) til T0-fluorescensnivået (F0) målt for tilsvarende behandling og/eller genotype7. For å demonstrere viktigheten av normalisering presenterer vi både rådata og dataene normalisert til gjennomsnittlig klorofyllfluorescensverdi for kontroll målt ved T0 (F0; henholdsvis figur 3A og figur 3B).
Figur 1: Oversikt over måleapparatprotokollen. Ordningen med iReenCAM måling og analyse rørledning. (A) Prøvepreparering ved rutenettdefinert frøsåing, lagdeling, lysinduksjon av spiring og vertikalt orientert petriskåldyrking i mørke. (B) Kontrollmodul for automatisk og programmerbar bildeinnsamling og datahåndtering basert på PlantScreen fenotyping SW verktøykasse organiserer driften av hele systemet ved å kontrollere og synkronisere HW-operasjonen med brukerdefinert måle- og analyseprotokoll. (C) Måleprotokollen er designet for dynamiske målinger av fluorescerende prøvebilder i intervaller på 2 minutter i totalt 4 timer, dvs. 120 målerunder. Tid visuell ramme av representativt falskt fargebilde av vertikalt orienterte 4 dager gamle Arabidopsis-frøplanter anskaffet på tidspunktet 180 min brukes til generering av ROI-maske. (D) Maske som definerer avkastning for et vev av interesse (f.eks. cotyledon, hypocotyl eller rotsone) brukes på den visuelle tidsrammen, bakgrunnssubtraksjon utføres og piksel for pikselfluorescensverdier for hver avkastning (definert av plantemasken) fra alle målerunder trekkes ut. Til slutt normaliseres rådataene (fluorescens F) til gjennomsnittlig fluorescensverdi ved T0 (F0). Skalastenger = 1 cm (A) og 0,25 cm (C). Figuren ble endret fra7. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Plassering av frø. Figuren viser plassering av Arabidopsisfrø på petriskålen med lystette kanter ved hjelp av saggitteret. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Klorofyllakkumuleringskinetikk i de tidlige stadier av Arabidopsis de-etiolasjon. Etiolated WT Col-0 frøplanter ble dyrket på media supplert med BAP eller DMSO (mock). (A) Middelverdien ± SD (skyggelagt område), n = 9 av rådata og (B) data normalisert til gjennomsnittlig fluorescensverdi ved T0 (F0). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Tilleggsfigur 1: Sågitter. Venstre: Sågitter med skisserte rektangulære bokser for å plassere frøene til hver genotype i et målepunkt som ligger i området med aktinisk lyshomogenitet (lysintensitet ≥ 0,7 av maksimal lysintensitet). Høyre: Skjematisk fremstilling av 4 dager gamle, etiolerte Arabidopsis-frøplanter dyrket for analysen. Sågitteret gir et mulig skjema for Arabidopsis frøposisjonering som sikrer lyshomogenitet og riktig frøtetthet (hvert spor kan brukes til frøplassering ettersom størrelsen på et spor, avstanden mellom sporene og lyshomogeniteten i rutenettet er forenet). Klikk her for å laste ned denne filen.
Tilleggsfigur 2: Måleprotokoll for fluorescens. Klikk her for å laste ned denne filen.
Tilleggsfigur 3: Eksperimentell konfigurasjon som gjør det mulig å unngå uønsket lyseksponering. (A) Måleapparatet plasseres i plante-inn-fytotronen, (B) til kammeret atskilt med lystett dør. (C) In vitro-dyrkingsboksene (rød pilspiss) dedikert til etiolerte frøplanters vekst under definerte forhold (temperatur og relativ fuktighet) plasseres like under enheten (gul pilspiss), noe som sikrer minimal risiko for lyseksponering. Kilden til grønt svakt lys (blå pilspiss) er montert på veggen ved siden av kontroll-PCen (oransje pilspiss). Klikk her for å laste ned denne filen.
Tilleggsfigur 4: Prosedyre for maskegenerering i arbeidsflyten ved hjelp av PS-programvare for dataanalyse. Skriv ut skjermbilder av individuelle trinn som skal utføres for generering av brettmaske (trinn 4.3-4.6) og plantemaske (trinn 4.12) og dataanalyse (trinn 4.7 og 4.13). Klikk her for å laste ned denne filen.
Tilleggsfigur 5: Såtetthet som påvirker målevariabiliteten. Klorofyllakkumuleringskinetikk i 4 dager gamle, etiolerte Arabidopsis WT Col-0-frøplanter dyrket (A) separat (som individuelle frøplanter, her n = 5) eller i en gruppe på (B) høy (HD, n = 30-40) eller (C) lav tetthet (LD, n = 10-15). N tilsvarer antall frøplanter per spor i sågitteret, data representerer middelverdiene ± SD (skyggelagt region). Den høye eller lave tettheten tilsvarer antall frøplanter per spor i sågitteret som nevnt. Klikk her for å laste ned denne filen.
Tilleggsfigur 6: Dyrkingsintervall og areal krever artsspesifikk optimalisering. Vekst av ulike plantearter ved hjelp av Arabidopsis-optimalisert protokoll. (A) Plassering av frø på sågitteret. (B) 4 dager gamle, etiolerte frøplanter av (fra venstre til høyre) Arabidopsis thaliana, Brassica napus og Crambe abyssinica. Klikk her for å laste ned denne filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kritiske trinn i protokollen og feilsøking - ikke lys og ta vare på masken
Som fremhevet direkte i protokollbeskrivelsen ovenfor, er det av kritisk betydning11 å unngå selv spormengder av lys både under dyrking av etiolerte planter eller like før du starter protokollen. I vårt oppsett bruker vi et dedikert mørkt kammer plassert i plantetronen og atskilt fra resten av fytotronen med lystett roterende dør (tilleggsfigur 3). Kammeret er utstyrt med plantedyrkingsplass og arbeidsbenk, slik at du kan imøtekomme enheten sammen med kontroll-PC og avtrekkshette. Dette gjør at vi både kan dyrke plantene i mørke og starte målingen uten behov for platetransport.
Veien for plantedyrking og maskegenerering er kritisk for etterfølgende kvantifisering av klorofyllfluorescenssignal via den foreslåtte analysen. Man bør unngå å få klumper av geleringsmiddel eller lite visuelt søppel / støv i media, da det kan føre til lysrefleksjon. Siden gjenkjennelsen av klorofyllfluorescens av programvaren er begrenset av masken, vil et planteområde som ikke dekkes av masken, ganske enkelt ikke bli analysert av programvaren. Under 4-timersmålingen vokser / beveger plantene seg litt, derfor kan utpekt maske kreve justeringer, da det kanskje ikke passer gjennom alle målerundene for nøyaktig signalintensitetskvantifisering. Ifølge vår erfaring synes den ufullkomne maskedefinisjonen å være hovedkilden til variabilitet. Under optimaliseringsforsøkene overvåket vi endringene i variabiliteten av klorofyllfluorescensverdier tatt for analyse i i) individuelle frøplanter og en gruppe frøplanter med ii) høyere (30-40 frø) og iii) lavere (10-15 frø) tetthetssåing (tilleggsfigur 5). Vi brukte en høyere tetthet av frøsåing siden den viste den laveste variasjonen. Den høyere variasjonen sett ved individuelle frøplanter / såing med lavere tetthet stammer hovedsakelig fra den høyere andelen piksler som ligger i kanten mellom signalet og bakgrunnen og den svake bevegelsen av plantene i løpet av 4 timers måleintervall.
For å sikre at alle målinger er nøyaktige, sjekk om plantemasken passer til første runde, deretter til 15., 30., 45., 60. 75. og så videre til den siste (ved å velge nummeret på runden og klikke på Oppdater forhåndsvisning). Dette tar bare et par minutter, men vil sikre at hele cotyledon-området blir dekket og evaluert. Hvis plantemasken ikke passer (det nødvendige området er ikke fullt dekket), del eksperimentet i flere deler. Utfør deretter protokollen fra trinn 4 (4.1-4.13) for å opprette en bestemt maske separat for hver del av eksperimentet. For eksempel, hvis du oppdager forskyvningen av plantemasken ved runden 60-61 (eller litt tidligere), del eksperimentet i to deler - 1. del (1-60 runder) og 2. del (61-121 runder). For 1. del bruk bildet av runde 41 for å generere en plantemaske og for 2. del bruk runde 91. I trinn 4.13, når du analyserer dataene, må du passe på å velge rundene i henhold til den tilsvarende delen av eksperimentet (f.eks. avrunder 1-60 for den første delen og 61-121 for den andre, som i det nevnte eksemplet) før du klikker på Analyser. Når du arbeider med Arabidopsis, er bevegelsen av planter ubetydelig ettersom de vokser ganske sakte, men hvis du bruker protokollen for forskjellige arter (se nedenfor), bør veksttempoet tas i betraktning.
Modifikasjoner og begrensninger
Antall parametere kan endres, inkludert intensiteten og bølgelengden til aktinisk lys og/eller lyset som påføres mellom intervallene for aktinisk lyspåføring. Måleenheten inkluderer det integrerte, fullt motoriserte og programvarestyrte filterhjulet. Dermed kan målealgoritmen som er egnet for kvantifisering av andre pigmenter, typisk også produkter av tetrapyrolle biosyntetiske vei10,12, inkluderes i protokollen ved tilsetning av passende filtre.
Også, som det ble nevnt tidligere, kan protokollen brukes ikke bare for Arabidopsis-planter . Når du arbeider med andre plantearter, bør imidlertid hvert trinn i protokollen revideres tilsvarende, idet det tas hensyn til de artsspesifikke egenskapene, inkludert spiring og veksthastighet og/eller størrelsen (tilleggsfigur 6).
En av de viktige begrensningene i protokollen er tidsperioden, hvor klorofyllkvantifiseringsanalysen kan utføres. Etter at klorofyll blir integrert i fotosystemkompleksene, blir fluorescenssignalet partisk av fotosyntesens energiforbruk (det som kalles den variable klorofyllflorescensen er tilstede) som det har blitt observert i senere stadier av de-etiolering13. Som analysert ved bruk av OJIP-transientanalyse14,15, var det ingen tegn på fotosyntetisk aktivitet som kunne påvises ved hjelp av dette eksperimentelle oppsettet i løpet av de første 4 timene av de-etiolasjon 7. Imidlertid, hvis den utvidede tidsperioden for fotomorfogenese antas / er nødvendig for å bli analysert, bør nivået av fotosystemmontering og mulig effekt av fotosyntese på de totale fluorescensnivåene testes.
Til slutt skal det nevnes at vår protokoll basert på fluorescensmålingene, tillater relativ, ikke absolutt klorofyllkvantifisering. Hvis absolutt kvantifisering er nødvendig, må tilsvarende kalibrering utføres ved hjelp av et alternativ, f.eks. HPLC-tilnærming.
Betydning i forhold til eksisterende metoder - enkel, rask og statistisk robust klorofyllkvantifisering med høy tid og romlig oppløsning
Prosedyren beskrevet her tillater sanntidsdeteksjon og kvantifisering av klorofyll i levende Arabidopsis-frøplanter i tidlige stadier av de-etiolering. Sammenlignet med andre tilnærminger som hovedsakelig er avhengige av klorofyllekstraksjon fra frittliggende plantemateriale16,17 eller nylig utviklede optiske metoder 18,19, er denne tilnærmingen rent ikke-invasiv, noe som tillater klorofyllkvantifisering ved in vivo-måling av fluorescensintensitet. Det er heller ikke behov for ytterligere reagenser som er nødvendige for prøvepreparering som med andre eksisterende alternative metoder, inkludert de nevnte HPLC- eller spektrofotometribaserte tilnærmingene. Den nylig introduserte protokollen er enkel, rask og nøyaktig, som tidligere verifisert ved hjelp av HPLC5. Ved hjelp av standard protokollinnstillinger er den endelige kurven for en enkelt biologisk repetisjon laget av 120 målepunkter (fluorescensintensitetsmidler) tatt i løpet av 4 timer etter målingen, hver bestående av opptil 15 målepunkter. Vanligvis inneholder den endelige kurven data fra tre biologiske replikaer (f.eks. Tre uavhengig preparerte plater) og tre målepunkter (tre tekniske replikaer), hver bestående av 30-40 frøplanter. Dermed er det rundt 300 frøplanter analysert i hvert tidsintervall, noe som gir statistisk robust datasett, noe som gjør det mulig å pålidelig oppdage selv små forskjeller som demonstrert på mutanter som er berørt i forskjellige trinn av klorofyllbiosyntese7. Her oppfordrer vi brukeren til å benytte den nylig utviklede statistiske tilnærmingen basert på generaliserte lineære blandede modeller kombinert med klassiske tidsseriemodeller som et egnet verktøy for klorofyllkinetikkdataanalysen20.
Fremtidige anvendelser av teknikken - rask og billig screening
De nevnte funksjonene gjør denne tilnærmingen til et nyttig verktøy egnet for rask og billig screening og svært presis kvantifisering av egenskaper assosiert (direkte eller indirekte) med klorofyllbiosyntese. Dette kan omfatte studier som bruker den fremadrettede genetiske screeningen for bedre å karakterisere de komplekse og flernivåreguleringene av klorofyllbiosyntese 10,12,21. Med tanke på muligheten for ulike forbindelsesbehandlinger, er protokollen også svært verdifull for å studere for eksempel betydningen av lysmedierte hormonelle forskrifter22,23 eller screening for lavmolekylære forbindelser med mulig innvirkning på klorofyllakkumuleringskinetikk.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Z.B. og K.P. er ansatte i PSI og Martin Trtilek er administrerende direktør og eier av PSI-selskapet som produserer iReenCAM. Alle disse forfatterne var involvert i utviklingen av instrumentet som tidligere beskrevet7.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet fra European Regional Development Fund-Project SINGING PLANT (nr. CZ.02.1.01/0.0/0.0/16_026/0008446). Dette prosjektet har fått finansiering gjennom MSCA4Ukraine-prosjektet (ID 1233580), som er finansiert av EU. Vi er takknemlige for Lenka Sochurkova for den grafiske utformingen av figur 1.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6-benzylaminopurine | Duchefa Biochemie | B0904.0001 | |
| Aluminum foil | Merck | Z691577 | |
| Arabidopsis thaliana Col-0 seeds | NASC collection | N1092 | |
| Cultivation chamber | PSI | custom made | |
| Dimethilsulfoxid | Thermo Fisher Scientific | 042780.AK | |
| Eppendorf single-channeled, variable (100-1000 μL) | Merck | EP3123000063 | |
| Gelrite | Duchefa Biochemie | G1101 | |
| iReenCAM device | PSI | custom made/prototype | |
| Laboratory bottles, with caps (Duran), 100mL | Merck | Z305170-10EA | |
| Laminar-flow box | UniGreenScheme | ITEM-31156 | |
| Linerless Rubber Splicing Tape, 19 mm width, black, Scotch | 3M Science. Applied to Life | 7000006085 | |
| Microcentrifuge tube, 2 mL with lid, PPT, BRAND | Merck | BR780546-500EA | |
| Micropore tape | 3M Science. Applied to Life | 7100225115 | |
| Osram lumilux green l18w/66 | Ovalamp | 200008833 | |
| Petri plates - Greiner dishes, square, 120 x 120 x17mm, vented | Merck | Z617679-240EA | |
| Pipet tips, 1000 μL, Axygen | Merck | AXYT1000B | |
| The Plant Screen Data Analyzer software | PSI | delivered as a part of the iReenCAM |
References
- Arsovski, A. A., Galstyan, A., Guseman, J. M., Nemhauser, J. L.
- Reinbothe, S., Reinbothe, C., Apel, K., Lebedev, N. Evolution of chlorophyll biosynthesis--the challenge to survive photooxidation. Cell. 86 (5), 703-705 (1996).
- Heyes, D. J., et al. Photocatalysis as the 'master switch' of photomorphogenesis in early plant development. Nat Plants. 7 (3), 268-276 (2021).
- Hu, X. Y., Tanaka, A., Tanaka, R. Simple extraction methods that prevent the artifactual conversion of chlorophyll to chlorophyllide during pigment isolation from leaf samples. Plant Methods. 9 (1), 19 (2013).
- Chazaux, M., Schiphorst, C., Lazzari, G., Caffarri, S. Precise estimation of chlorophyll a, b and carotenoid content by deconvolution of the absorption spectrum and new simultaneous equations for chl determination. Plant J. 109 (6), 1630-1648 (2022).
- Marr, I. L., Suryana, N., Lukulay, P., Marr, M. I. Determination of chlorophyll-a and chlorophyll-b by simultaneous multicomponent spectrophotometry. Fresenius J Anal Chem. 352 (5), 456-460 (1995).
- Balakhonova, V., et al. Ireencam: Automated imaging system for kinetic analysis of photosynthetic pigment biosynthesis at high spatiotemporal resolution during early deetiolation. Front Plant Sci. 14, 1093292 (2023).
- Virgin, H. I., Kahn, A., Vonwettstein, D. The physiology of chlorophyll formation in relation to structural changes in chloroplasts. Photochem Photobiol. 2 (2), 83-91 (1963).
- Reinbothe, C., et al. Chlorophyll biosynthesis: Spotlight on protochlorophyllide reduction. Trends Plant Sci. 15 (11), 614-624 (2010).
- Kobayashi, K., Masuda, T. Transcriptional regulation of tetrapyrrole biosynthesis in arabidopsis thaliana. Front Plant Sci. 7, 1811 (2016).
- Wang, Y., Folta, K. M. Contributions of green light to plant growth and development. Am J Bot. 100 (1), 70-78 (2013).
- Brzezowski, P., Richter, A. S., Grimm, B. Regulation and function of tetrapyrrole biosynthesis in plants and algae. Biochim Biophys Acta. 1847 (9), 968-985 (2015).
- Pipitone, R., et al. A multifaceted analysis reveals two distinct phases of chloroplast biogenesis during de-etiolation in arabidopsis. eLife. 10, e62709 (2021).
- Stirbet, A. G. On the relation between the kautsky effect (chlorophyll a fluorescence induction) and photosystem ii: Basics and applications of the ojip fluorescence transient. J Photochem Photobiol B-Biol. 104 (1-2), 236-257 (2011).
- Kupper, H., et al. Analysis of ojip chlorophyll fluorescence kinetics and q(a) reoxidation kinetics by direct fast imaging. Plant Physiol. 179 (2), 369-381 (2019).
- Avin-Wittenberg, T., et al. Global analysis of the role of autophagy in cellular metabolism and energy homeostasis in arabidopsis seedlings under carbon starvation. Plant Cell. 27 (2), 306-322 (2015).
- Kósa, A., Preininger, É, Böddi, B. Nitrogen deficiency hinders etioplast development in stems of dark-grown pea (pisum sativum) shoot cultures. Physiol Plant. 155 (3), 330-337 (2015).
- Liang, Y., et al. A nondestructive method to estimate the chlorophyll content of arabidopsis seedlings. Plant Met. 13 (1), 26 (2017).
- Pérez-Patricio, M., et al. Optical method for estimating the chlorophyll contents in plant leaves. Sensors. 18 (2), 650 (2018).
- Spyroglou, I., et al. Mixed models as a tool for comparing groups of time series in plant sciences. Plants (Basel). 10 (2), (2021).
- Tanaka, R., Kobayashi, K., Masuda, T.
- De Wit, M., Galvao, V. C., Fankhauser, C. Light-mediated hormonal regulation of plant growth and development. Annu Rev Plant Biol. 67, 513-537 (2016).
- Liu, X., Li, Y., Zhong, S. Interplay between light and plant hormones in the control of arabidopsis seedling chlorophyll biosynthesis. Front Plant Sci. 8, 1433 (2017).
