بروتوكول محسن للرولز السويسرية المعوية وتلطيخ الفلورسنت المناعي للأنسجة المدمجة في البارافين
Summary
الأمعاء أمر حيوي للهضم والامتصاص. كل منطقة – الاثني عشر ، الصائم ، الدقاق ، القولون – تخدم وظائف مميزة بسبب الهياكل الخلوية الفريدة. تتطلب دراسة فسيولوجيا الأمعاء تحليلا دقيقا للأنسجة. يحدد هذا البروتوكول تثبيت الأنسجة ومعالجتها باستخدام تقنية Swiss roll ، مما يضمن تلطيخا مناعيا دقيقا من خلال الحفاظ على الأنسجة وتوجيهها بشكل صحيح.
Abstract
الأمعاء هي عضو معقد يتكون من الأمعاء الدقيقة والأمعاء. يمكن تقسيم الأمعاء الدقيقة إلى اثني عشر والصائم والدقاقي. كل منطقة تشريحية من الأمعاء لها وظيفة فريدة تنعكس من خلال الاختلافات في البنية الخلوية. يتطلب التحقيق في التغيرات في الأمعاء تحليلا متعمقا لمناطق الأنسجة المختلفة والتغيرات الخلوية. لدراسة الأمعاء وتصور قطع كبيرة من الأنسجة ، يستخدم الباحثون عادة تقنية تعرف باسم القوائم السويسرية المعوية. في هذه التقنية ، تنقسم الأمعاء إلى كل منطقة تشريحية وثابتة في اتجاه مسطح. بعد ذلك ، يتم لف الأنسجة بعناية ومعالجتها لتضمين البارافين. يعد التثبيت والتوجيه المناسبين للأنسجة تقنية مختبرية غالبا ما يتم تجاهلها ولكنها مهمة للغاية للتحليل النهائي. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن أن يؤدي التدحرج السويسري غير السليم للأنسجة المعوية إلى إتلاف ظهارة الأمعاء الهشة ، مما يؤدي إلى ضعف جودة الأنسجة للتلطيخ المناعي. يعد ضمان الأنسجة الثابتة جيدا والموجهة بشكل صحيح مع الهياكل الخلوية السليمة خطوة حاسمة تضمن التصور الأمثل للخلايا المعوية. نقدم طريقة فعالة من حيث التكلفة وبسيطة لصنع لفائف سويسرية لتشمل جميع أقسام الأمعاء في كتلة واحدة مدمجة بالبارافين. كما وصفنا تلطيخ الأنسجة المعوية بالإشعاع المناعي الأمثل لدراسة الجوانب المختلفة لظهارة الأمعاء. يوفر البروتوكول التالي للباحثين دليلا شاملا للحصول على صور مضان مناعي عالية الجودة من خلال تثبيت الأنسجة المعوية وتقنية Swiss-roll و immunostaining. إن استخدام هذه الأساليب المكررة يحافظ على التشكل المعقد لظهارة الأمعاء ويعزز فهما أعمق لفسيولوجيا الأمعاء وعلم الأمراض المرضي.
Introduction
تشكل البنية الخلوية للأمعاء تحديا فريدا في الحفاظ على سلامتها الهيكلية عندما يتم الحفاظ على الأنسجة المعوية للتلطيخ المناعي. تتكون الأمعاء الدقيقة من تراكيب ممدودة تشبه الأصابع تعرف باسم الزغابات1. غالبا ما تصبح هذه الزغابات مشوهة أثناء عمليات التضمين. إن التأكد من أن الباحثين لديهم تقنيات لتضمين الأمعاء بشكل صحيح لتحقيق المقاطع العرضية ، مما يسمح بتصور جميع مناطق الأمعاء ، وكذلك الطبقات التي تشكل الأمعاء (أي البروبريا العضلية ، والغشاء المخاطي ، والمصل) ، أمر بالغ الأهمية للتحليل التجريبي القوي2. سيؤدي التثبيت غير الكافي والتثبيت المفرط والتعامل غير السليم مع الأنسجة إلى الإضرار بسلامة الأنسجة ، مما يؤدي إلى تلف غير مقصود لظهارة الأمعاء 3,4. يمكن أن يؤدي إتلاف ظهارة الأمعاء خلال هذه الخطوات إلى تقليل جودة التحليلات اللاحقة بشكل كبير ، مثل التألق المناعي ، بغض النظر عن فعالية بروتوكولات الكيمياء الهيستولوجية المناعية والأجسام المضادة المستخدمة.
يعد التلوين المناعي ، مثل التثبيت المناسب للأنسجة ، جزءا مهما من البحوث الطبية الحيوية. عندما يتم ذلك بشكل جيد ، يمكن أن يضيء التلوين المناعي جوانب غير معروفة سابقا من البنية الخلوية والوظيفة. يمكن أن يكون تلطيخ التألق المناعي لأقسام البارافين أمرا صعبا بسبب التعديلات الفيزيائية والكيميائية الناتجة عن عملية التثبيت وتضمين البارافين5. يؤدي التثبيت وتضمين البارافين إلى إخفاء المستضد الذي يمكن أن يتداخل مع الكشف عن التألق المناعي للحواتم ذات الأهمية6. يمكن أن يؤدي التثبيت المتأخر إلى تدهور التحلل البروتيني ، مما يؤدي إلى ضعف أو غياب تلطيخ الحواتم الحرجة7. بالإضافة إلى ذلك ، غالبا ما تكون الأجسام المضادة غير دقيقة مع مستويات عالية من الخلفية. يمكن أن توفر بروتوكولات التلوين المناعي التي تعزز ارتباط الأجسام المضادة المتسق والمحدد ونسبة الإشارة إلى الضوضاء العالية معلومات قيمة للباحثين.
هنا ، نقدم بروتوكولا شاملا مصمما للحصول على صور مضان مناعي عالية الجودة من خلال تثبيت الأنسجة المعوية ، وإعداد اللفةالسويسرية 8 ، والتلوين المناعي. مع التأكيد على المبادئ التوجيهية للحفاظ على سلامة الأمعاء ، يهدف البروتوكول إلى تزويد الباحثين بمنهجية قوية لتعزيز جودة وموثوقية دراسات التصوير المناعي. لقد سعينا أيضا إلى استخدام موارد فعالة من حيث التكلفة ، بما في ذلك ورق الترشيح واسترجاع المستضد محلي الصنع ، وحلول الحظر ، ومخففات الأجسام المضادة لجعل البروتوكول في متناول المختبرات التي قد تكون مقيدة الأموال. بالنسبة لجميع البروتوكولات التجريبية ، يجب على الباحثين تحسين البروتوكول الحالي بناء على نهجهم التجريبي ومجالات اهتمامهم.
Protocol
Representative Results
Discussion
هنا ، نقدم طريقة محسنة لتثبيت الأنسجة باستخدام تقنية Swiss roll للحفاظ على بنية الأمعاء وتعزيز تلطيخ المناعة الدقيق. بمجرد إتقانها ، يمكن استخدام هذه التقنية للتحقيق في مجموعة متنوعة من الأسئلة البحثية التي تنطوي على فسيولوجيا الأمعاء وبيولوجيا الخلية19. تم نشر العديد من طرق الدر…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم دعم هذه الدراسة من قبل المعاهد الوطنية للصحة (NIH) تمنح K01 DK121869 إلى ACE وكان هذا المنشور مدعوما جزئيا من قبل T32 GM132055 (RME) و F31 DK139736 (SAD) و T32 DK124191 (SAD) و TL1 TR001451 (RS) و UL1 TR001450 (RS) ومنح حجر الزاوية HCS إلى SAD & RS. تم دعم هذا العمل من خلال أموال بدء التشغيل من جامعة ساوث كارولينا الطبية (MUSC) إلى ACE وتم دعمه من قبل المركز الأساسي لأبحاث أمراض الجهاز الهضمي MUSC (P30 DK123704) و COBRE في أمراض الجهاز الهضمي والكبد (P20 GM120475). تم إجراء التصوير باستخدام نواة التصوير الخلوي والجزيئي في MUSC.
Materials
| β-CATENIN | GeneTex | GTX101435 | |
| Cellulose filter paper | Cytiva | 10427804 | Thick Whatman paper |
| Charged glass slides | Thermo Fisher Scientific | 23888114 | |
| Coverslip | Epredia | 152440 | |
| Dissecting pins size 00 | Phusis | B082DH4TZF | |
| E-CADHERIN | R&D Systems | AF748 | |
| Freezer gloves | Tempshield | UX-09113-02 | |
| Heating block | Premiere | XH-2001 | Slide Warmer |
| Histo-Clear II | Electron Microscopy Sciences | 64111-04 | Clearing reagent |
| Hoescht | Thermo Fisher Scientific | 62249 | |
| Hydrochloric Acid | Sigma Aldrich | 320331 | |
| Hydrophobic pen | Millipore | 402176 | |
| LAMININ | GeneTex | GTX27463 | |
| LAMP1 | Santa Cruz | SC-19992 | |
| Large cassettes | Tissue-Tek | 4173 | |
| Minutien pins | Fine Science Tools | NC9679721 | |
| Mouse-on-mouse blocking reagent | Vector Laboratories | MKB-2213 | Mouse-on-mouse block |
| MUC2 | GeneTex | GTX100664 | |
| PCNA | Cell Signaling Technology | 2586S | |
| Pressure Cooker | Cuisinart | B000MPA044 | |
| ProLong gold antifade | Thermo Fisher Scientific | P36934 | Mounting medium |
| Reverse action forceps | Dumont | 5748 | |
| Slide Rack | Tissue-Tek | 62543-06 | |
| Slide Staining Set | Tissue-Tek | 62540-01 | Solvent Resistant Dishes and Metal Frame |
| Small cassettes | Fisherbrand | 15-200-403B | |
| Sodium citrate dihydrate | Fisher Bioreagents | BP327-1 | |
| Teleostein Gelatin | Sigma | G7765 | Blocking buffer |
| Triton X-100 | Thermo Fisher Scientific | A16046 | |
| Tween 20 | Thermo Fisher Scientific | J20605-AP | |
| Wipes | KimTech | 34155 | |
| Xylenes | Fisher Chemical | 1330-20-7 | |
| γ-ACTIN | Santa Cruz | SC-65638 |
References
- Louvard, D., Kedinger, M., Hauri, H. P. The differentiating intestinal epithelial cell: Establishment and maintenance of functions through interactions between cellular structures. Annu Rev Cell Biol. 8, 157-195 (1992).
- Rieger, J., Pelckmann, L. M., Drewes, B. . Animal models of allergic disease: Methods and protocols. , (2021).
- Webster, J. D., Miller, M. A., Dusold, D., Ramos-Vara, J. Effects of prolonged formalin fixation on the immunohistochemical detection of infectious agents in formalin-fixed, paraffin-embedded tissues. Vet Pathol. 47 (3), 529-535 (2010).
- Hayashi, Y., Koike, M., Matsutani, M., Hoshino, T. Effects of fixation time and enzymatic digestion on immunohistochemical demonstration of bromodeoxyuridine in formalin-fixed, paraffin-embedded tissue. J Histochem Cytochemis. 36 (5), 511-514 (1988).
- Werner, M., Chott, A., Fabiano, A., Battifora, H. Effect of formalin tissue fixation and processing on immunohistochemistry. Am J Surg Pathol. 24 (7), 1016-1019 (2000).
- Scalia, C. R., et al. Antigen masking during fixation and embedding, dissected. J Histochem Cytochem. 65 (1), 5-20 (2017).
- Masood, S., Von Wasielewski, R., Mengel, M., Nolte, M., Werner, M. Influence of fixation, antibody clones, and signal amplification on steroid receptor analysis. Breast J. 4 (1), 33-40 (1998).
- Moolenbeek, C., Ruitenberg, E. J. The "swiss roll": A simple technique for histological studies of the rodent intestine. Lab Anim. 15 (1), 57-59 (1981).
- Casteleyn, C., Rekecki, A., Van Der Aa, A., Simoens, P., Van Den Broeck, W. Surface area assessment of the murine intestinal tract as a prerequisite for oral dose translation from mouse to man. Lab Animals. 44 (3), 176-183 (2010).
- Lunnemann, H. M., et al. Cecum axis (cecax) preservation reveals physiological and pathological gradients in mouse gastrointestinal epithelium. Gut Microbes. 15 (1), 2185029 (2023).
- Qin, C., et al. The cutting and floating method for paraffin-embedded tissue for sectioning. J Vis Exp. (139), e58288 (2018).
- Feldman, A. T., Wolfe, D. . Histopathology: Methods and protocols. , (2014).
- Yang, W. H., et al. Innate mechanism of mucosal barrier erosion in the pathogenesis of acquired colitis. iScience. 26 (10), 107883 (2023).
- Dooley, S. A., et al. Myosin 5b is required for proper localization of the intermicrovillar adhesion complex in the intestinal brush border. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 323 (5), G501-G510 (2022).
- Danan, C. H., et al. Intestinal transit amplifying cells require mettl3 for growth factor signaling, kras expression, and cell survival. bioRxiv. , (2023).
- Han, B., Qi, S., Hu, B., Luo, H., Wu, J. Tgf-beta i promotes islet beta-cell function and regeneration. J Immunol. 186 (10), 5833-5844 (2011).
- Chen, L. C., Wang, H. W., Huang, C. C. Modulation of inherent niches in 3d multicellular msc spheroids reconfigures metabolism and enhances therapeutic potential. Cells. 10 (10), 2747 (2021).
- Fang, Y., et al. Cd36 inhibits beta-catenin/c-myc-mediated glycolysis through ubiquitination of gpc4 to repress colorectal tumorigenesis. Nat Commun. 10 (1), 3981 (2019).
- Whittem, C. G., Williams, A. D., Williams, C. S. Murine colitis modeling using dextran sulfate sodium (dss). J Vis Exp. (35), e1652 (2010).
- Bialkowska, A. B., Ghaleb, A. M., Nandan, M. O., Yang, V. W. Improved swiss-rolling technique for intestinal tissue preparation for immunohistochemical and immunofluorescent analyses. J Vis Exp. (113), e54161 (2016).
- Le Naour, J., et al. Improved swiss-rolling method for histological analyses of colon tissue. MethodsX. 9, 101630 (2022).
- Cardiff, R. D., Miller, C. H., Munn, R. J. Mouse tissue fixation. Cold Spring Harb Protoc. 2014 (5), (2014).
- Pereira E Silva, A., Lourenço, A. L., Marmello, B. O., Bitteti, M., Teixeira, G. a. P. B. Comparison of two techniques for a comprehensive gut histopathological analysis: Swiss roll versus intestine strips. Exp Mol Pathol. 111, 104302 (2019).
- Williams, J. M., Duckworth, C. A., Vowell, K., Burkitt, M. D., Pritchard, D. M. Intestinal preparation techniques for histological analysis in the mouse. Curr Prot Mouse Biol. 6 (2), 148-168 (2016).
- Boenisch, T. Effect of heat-induced antigen retrieval following inconsistent formalin fixation. Appl Immunohistochem Mol Morphol. 13 (3), 283-286 (2005).
- Hasegawa, Y., Mark Welch, J. L., Rossetti, B. J., Borisy, G. G. Preservation of three-dimensional spatial structure in the gut microbiome. PLoS One. 12 (11), e0188257 (2017).
- Garabedian, E. M., Roberts, L. J., Mcnevin, M. S., Gordon, J. I. Examining the role of paneth cells in the small intestine by lineage ablation in transgenic mice. J Biol Chem. 272 (38), 23729-23740 (1997).
- Moshi, J. M., Ummelen, M., Broers, J. L. V., Ramaekers, F. C. S., Hopman, A. H. N. Impact of antigen retrieval protocols on the immunohistochemical detection of epigenetic DNA modifications. Histochem Cell Biol. 159 (6), 513-526 (2023).
- Krenacs, L., Krenacs, T., Stelkovics, E., Raffeld, M. Heat-induced antigen retrieval for immunohistochemical reactions in routinely processed paraffin sections. Methods Mol Biol. 588, 103-119 (2010).
- Pereira, E. S. A., Lourenco, A. L., Marmello, B. O., Bitteti, M., Teixeira, G. Comparison of two techniques for a comprehensive gut histopathological analysis: Swiss roll versus intestine strips. Exp Mol Pathol. 104302, 111 (2019).
- Bolognesi, M. a. O., et al. Antibodies validated for routinely processed tissues stain frozen sections unpredictably. BioTechniques. 70 (3), 137-148 (2021).
.