Protocole optimisé pour les Swiss Rolls intestinaux et la coloration immunofluorescente des tissus inclus dans la paraffine
Summary
L’intestin est vital pour la digestion et l’absorption. Chaque région – duodénum, jéjunum, iléon, côlon – remplit des fonctions distinctes en raison de structures cellulaires uniques. L’étude de la physiologie intestinale nécessite une analyse méticuleuse des tissus. Ce protocole décrit la fixation et le traitement des tissus à l’aide de la technique du rouleau suisse, assurant une immunocoloration précise grâce à une préservation et une orientation appropriées des tissus.
Abstract
L’intestin est un organe complexe composé de l’intestin grêle et du gros intestin. L’intestin grêle peut être divisé en duodénum, jéjunum et iléon. Chaque région anatomique de l’intestin a une fonction unique qui se reflète dans les différences de structure cellulaire. L’étude des changements dans l’intestin nécessite une analyse approfondie des différentes régions tissulaires et des altérations cellulaires. Pour étudier l’intestin et visualiser de gros morceaux de tissu, les chercheurs utilisent couramment une technique connue sous le nom de rouleaux suisses intestinaux. Dans cette technique, l’intestin est divisé en chaque région anatomique et fixé dans une orientation plate. Ensuite, le tissu est soigneusement roulé et traité pour l’enrobage de paraffine. La fixation et l’orientation correctes des tissus sont une technique de laboratoire souvent négligée, mais elles sont d’une importance cruciale pour l’analyse en aval. De plus, un mauvais roulement suisse du tissu intestinal peut endommager l’épithélium intestinal fragile, entraînant une mauvaise qualité des tissus pour l’immunocoloration. S’assurer que les tissus sont bien fixés et correctement orientés avec des structures cellulaires intactes est une étape cruciale qui garantit une visualisation optimale des cellules intestinales. Nous présentons une méthode simple et rentable pour fabriquer des rouleaux suisses afin d’inclure toutes les sections de l’intestin dans un seul bloc inclus dans la paraffine. Nous décrivons également la coloration par immunofluorescence optimisée du tissu intestinal pour étudier divers aspects de l’épithélium intestinal. Le protocole suivant fournit aux chercheurs un guide complet pour obtenir des images d’immunofluorescence de haute qualité grâce à la fixation des tissus intestinaux, à la technique du Swiss-roll et à l’immunomarquage. L’utilisation de ces approches raffinées préserve la morphologie complexe de l’épithélium intestinal et favorise une compréhension plus profonde de la physiologie et de la pathobiologie intestinales.
Introduction
L’architecture cellulaire de l’intestin pose un défi unique pour maintenir son intégrité structurelle lorsque le tissu intestinal est préservé pour l’immunomarquage. L’intestin grêle est composé de structures allongées en forme de doigts appelées villosités1. Ces villosités se déforment souvent au cours des processus d’encastrement. Il est crucial de s’assurer que les chercheurs disposent de techniques pour intégrer correctement les intestins afin d’obtenir des coupes efficaces, permettant de visualiser toutes les régions de l’intestin, ainsi que les couches qui composent l’intestin (c’est-à-dire la musculeuse propria, la muqueuse et la séreuse), est crucial pour une analyse expérimentale robuste2. Une fixation inadéquate, une fixation excessive et une manipulation inappropriée des tissus compromettront l’intégrité des tissus, entraînant des dommages accidentels à l’épithélium intestinal 3,4. Endommager l’épithélium intestinal au cours de ces étapes peut diminuer considérablement la qualité des analyses ultérieures, comme l’immunofluorescence, indépendamment de l’efficacité des protocoles d’immunohistochimie et des anticorps utilisés.
L’immunomarquage, comme la bonne fixation des tissus, est une partie importante de la recherche biomédicale. Lorsqu’elle est bien faite, l’immunocoloration peut mettre en lumière des aspects jusque-là inconnus de la structure et de la fonction cellulaires. La coloration par immunofluorescence des sections de paraffine peut être difficile en raison des modifications physicochimiques résultant du processus de fixation et d’enrobage de la paraffine5. La fixation et l’intégration de la paraffine entraînent un masquage de l’antigène qui peut interférer avec la détection par immunofluorescence des épitopes d’intérêt6. Une fixation retardée peut induire une dégradation protéolytique, ce qui entraîne une coloration affaiblie ou absente des épitopes critiques7. De plus, les anticorps sont souvent imprécis avec des niveaux élevés de bruit de fond. Les protocoles d’immunomarquage qui favorisent une liaison cohérente et spécifique des anticorps et un rapport signal/bruit élevé peuvent fournir des informations précieuses aux chercheurs.
Ici, nous fournissons un protocole complet conçu pour obtenir des images d’immunofluorescence de haute qualité grâce à la fixation des tissus intestinaux, à la préparation du rouleau suisse8 et à l’immunomarquage. Mettant l’accent sur les lignes directrices visant à préserver l’intégrité de l’intestin, le protocole vise à fournir aux chercheurs une méthodologie robuste pour améliorer la qualité et la fiabilité des études d’imagerie par immunofluorescence. Nous avons également cherché à utiliser des ressources rentables, notamment du papier filtre et une récupération d’antigène maison, des solutions de blocage et des diluants d’anticorps pour rendre le protocole plus accessible aux laboratoires qui peuvent disposer de fonds limités. Comme pour tous les protocoles expérimentaux, les chercheurs doivent optimiser le protocole actuel en fonction de leur approche expérimentale et de leurs domaines d’intérêt.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ici, nous présentons une méthode optimisée de fixation tissulaire utilisant la technique du rouleau suisse pour préserver l’architecture intestinale et favoriser une immunocoloration précise. Une fois maîtrisée, cette technique peut être utilisée pour étudier une grande variété de questions de recherche impliquant la physiologie intestinale et la biologie cellulaire19. Plusieurs méthodes de laminage suisses optimisées ont été publiées et sont très utiles20,21<…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Cette étude a été financée par les subventions K01 DK121869 des National Institutes of Health (NIH) à l’ACE et cette publication a été financée en partie par les GM132055 T32 (RME), F31 DK139736 (SAD), T32 DK124191 (SAD), TL1 TR001451 (RS), UL1 TR001450 (RS) et les subventions HCS cornerstone à SAD & RS. Ce travail a été soutenu par des fonds de démarrage de l’Université médicale de Caroline du Sud (MUSC) à l’ACE et a été soutenu par le MUSC Digestive Disease Research Core Center (P30 DK123704) et le COBRE in Digestive and Liver Disease (P20 GM120475). L’imagerie a été réalisée à l’aide de la carotte d’imagerie cellulaire et moléculaire de MUSC.
Materials
| β-CATENIN | GeneTex | GTX101435 | |
| Cellulose filter paper | Cytiva | 10427804 | Thick Whatman paper |
| Charged glass slides | Thermo Fisher Scientific | 23888114 | |
| Coverslip | Epredia | 152440 | |
| Dissecting pins size 00 | Phusis | B082DH4TZF | |
| E-CADHERIN | R&D Systems | AF748 | |
| Freezer gloves | Tempshield | UX-09113-02 | |
| Heating block | Premiere | XH-2001 | Slide Warmer |
| Histo-Clear II | Electron Microscopy Sciences | 64111-04 | Clearing reagent |
| Hoescht | Thermo Fisher Scientific | 62249 | |
| Hydrochloric Acid | Sigma Aldrich | 320331 | |
| Hydrophobic pen | Millipore | 402176 | |
| LAMININ | GeneTex | GTX27463 | |
| LAMP1 | Santa Cruz | SC-19992 | |
| Large cassettes | Tissue-Tek | 4173 | |
| Minutien pins | Fine Science Tools | NC9679721 | |
| Mouse-on-mouse blocking reagent | Vector Laboratories | MKB-2213 | Mouse-on-mouse block |
| MUC2 | GeneTex | GTX100664 | |
| PCNA | Cell Signaling Technology | 2586S | |
| Pressure Cooker | Cuisinart | B000MPA044 | |
| ProLong gold antifade | Thermo Fisher Scientific | P36934 | Mounting medium |
| Reverse action forceps | Dumont | 5748 | |
| Slide Rack | Tissue-Tek | 62543-06 | |
| Slide Staining Set | Tissue-Tek | 62540-01 | Solvent Resistant Dishes and Metal Frame |
| Small cassettes | Fisherbrand | 15-200-403B | |
| Sodium citrate dihydrate | Fisher Bioreagents | BP327-1 | |
| Teleostein Gelatin | Sigma | G7765 | Blocking buffer |
| Triton X-100 | Thermo Fisher Scientific | A16046 | |
| Tween 20 | Thermo Fisher Scientific | J20605-AP | |
| Wipes | KimTech | 34155 | |
| Xylenes | Fisher Chemical | 1330-20-7 | |
| γ-ACTIN | Santa Cruz | SC-65638 |
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