Bağırsak İsviçre ruloları ve parafine gömülü dokunun immünofloresan boyaması için optimize edilmiş protokol
Summary
Bağırsak, sindirim ve emilim için hayati önem taşır. Her bölge -duodenum, jejunum, ileum, kolon- benzersiz hücresel yapılar nedeniyle farklı işlevlere hizmet eder. Bağırsak fizyolojisini incelemek, titiz bir doku analizi gerektirir. Bu protokol, İsviçre rulo tekniğini kullanarak doku fiksasyonunu ve işlenmesini ana hatlarıyla belirtir ve uygun doku koruması ve oryantasyonu yoluyla doğru immün boyamayı sağlar.
Abstract
Bağırsak, ince ve kalın bağırsaklardan oluşan karmaşık bir organdır. İnce bağırsak ayrıca duodenum, jejunum ve ileum olarak ikiye ayrılabilir. Bağırsağın her anatomik bölgesi, hücresel yapıdaki farklılıklarla yansıtılan benzersiz bir işleve sahiptir. Bağırsaktaki değişikliklerin araştırılması, farklı doku bölgelerinin ve hücresel değişikliklerin derinlemesine analizini gerektirir. Bağırsakları incelemek ve büyük doku parçalarını görselleştirmek için, araştırmacılar genellikle bağırsak İsviçre ruloları olarak bilinen bir teknik kullanırlar. Bu teknikte bağırsak her anatomik bölgeye ayrılır ve düz bir yönelimde sabitlenir. Daha sonra, doku dikkatlice yuvarlanır ve parafin gömme için işlenir. Uygun doku fiksasyonu ve oryantasyonu genellikle gözden kaçan bir laboratuvar tekniğidir, ancak aşağı akış analizi için kritik öneme sahiptir. Ek olarak, bağırsak dokusunun yanlış İsviçre yuvarlanması, kırılgan bağırsak epiteline zarar verebilir ve bu da immün boyama için düşük doku kalitesine yol açabilir. Sağlam hücresel yapılara sahip iyi sabitlenmiş ve düzgün yönlendirilmiş dokunun sağlanması, bağırsak hücrelerinin en iyi şekilde görüntülenmesini sağlayan çok önemli bir adımdır. Bağırsağın tüm bölümlerini tek bir parafine gömülü blokta içerecek şekilde İsviçre ruloları yapmak için uygun maliyetli ve basit bir yöntem sunuyoruz. Ayrıca, bağırsak epitelinin çeşitli yönlerini incelemek için bağırsak dokusunun optimize edilmiş immünofloresan boyamasını da tarif ediyoruz. Aşağıdaki protokol, araştırmacılara bağırsak dokusu fiksasyonu, Swiss-roll tekniği ve immünoboyama yoluyla yüksek kaliteli immünofloresan görüntüleri elde etmek için kapsamlı bir kılavuz sağlar. Bu rafine yaklaşımları kullanmak, bağırsak epitelinin karmaşık morfolojisini korur ve bağırsak fizyolojisi ve patobiyolojisinin daha derin bir şekilde anlaşılmasını sağlar.
Introduction
Bağırsağın hücresel mimarisi, bağırsak dokusu immün boyama için korunurken yapısal bütünlüğünün korunmasında benzersiz bir zorluk teşkil eder. İnce bağırsak, villus1 olarak bilinen uzun parmak benzeri yapılardan oluşur. Bu villuslar genellikle gömme işlemleri sırasında malform hale gelir. Araştırmacıların, bağırsağın tüm bölgelerinin yanı sıra bağırsağı oluşturan katmanların (yani muscularis propria, mukoza ve serosa) görselleştirilmesine izin vererek, enine kesitler elde etmek için bağırsakları düzgün bir şekilde gömme tekniklerine sahip olmalarını sağlamak, sağlam deneysel analiz için çok önemlidir2. Yetersiz fiksasyon, aşırı fiksasyon ve yanlış doku kullanımı doku bütünlüğünü tehlikeye atarak bağırsak epitelinde yanlışlıkla hasara neden olur 3,4. Bu adımlar sırasında bağırsak epiteline zarar vermek, immünohistokimya protokollerinin ve kullanılan antikorların etkinliğinden bağımsız olarak, immünofloresan gibi sonraki analizlerin kalitesini önemli ölçüde azaltabilir.
İmmün boyama, uygun doku fiksasyonu gibi, biyomedikal araştırmanın önemli bir parçasıdır. İyi yapıldığında, immün boyama, hücresel yapı ve fonksiyonun daha önce bilinmeyen yönlerini aydınlatabilir. Parafin bölümlerinin immünofloresan boyaması, fiksasyon ve parafin gömme işleminden kaynaklanan fizikokimyasal modifikasyonlar nedeniyle zor olabilir5. Fiksasyon ve parafin gömme, ilgilenilen epitopların immünofloresan tespitine müdahale edebilecek antijen maskelemesi ile sonuçlanır6. Gecikmiş fiksasyon proteolitik bozulmaya neden olabilir, bu da kritik epitoplarınzayıflamasına veya hiç boyanmamasına neden olur 7. Ek olarak, antikorlar genellikle yüksek düzeyde arka plan ile yanlıştır. Tutarlı ve spesifik antikor bağlanmasını ve yüksek sinyal-gürültü oranını destekleyen immün boyama protokolleri, araştırmacılar için değerli bilgiler sağlayabilir.
Burada, bağırsak dokusu fiksasyonu, İsviçre rulo hazırlığı8 ve immünoboyama yoluyla yüksek kaliteli immünofloresan görüntüler elde etmek için tasarlanmış kapsamlı bir protokol sunuyoruz. Bağırsağın bütünlüğünü korumaya yönelik kılavuzları vurgulayan protokol, araştırmacılara immünofloresan görüntüleme çalışmalarının kalitesini ve güvenilirliğini artırmak için sağlam bir metodoloji sağlamayı amaçlamaktadır. Ayrıca, protokolü kısıtlı fonlara sahip olabilecek laboratuvarlar için daha erişilebilir hale getirmek için filtre kağıdı ve ev yapımı antijen alımı, bloke edici çözümler ve antikor seyrelticileri dahil olmak üzere uygun maliyetli kaynakları kullanmaya çalıştık. Tüm deneysel protokollerde olduğu gibi, araştırmacılar mevcut protokolü deneysel yaklaşımlarına ve ilgi alanlarına göre optimize etmelidir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Burada, bağırsak mimarisini korumak ve doğru immün boyamayı teşvik etmek için İsviçre rulo tekniğini kullanarak doku fiksasyonu için optimize edilmiş bir yöntem sunuyoruz. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik bağırsak fizyolojisi ve hücre biyolojisini içeren çok çeşitli araştırma sorularını araştırmak için kullanılabilir19. Optimize edilmiş birkaç İsviçre haddeleme yöntemi yayınlanmıştır ve çok faydalıdır 20,21<sup clas…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma, Ulusal Sağlık Enstitüleri (NIH) tarafından ACE’ye verilen K01 DK121869 tarafından desteklenmiştir ve bu yayın kısmen T32 GM132055 (RME), F31 DK139736 (SAD), T32 DK124191 (SAD), TL1 TR001451 (RS), UL1 TR001450 (RS) ve SAD & RS’ye HCS köşe taşı hibeleri tarafından desteklenmiştir. Bu çalışma, Güney Carolina Tıp Üniversitesi’nden (MUSC) ACE’ye başlangıç fonları tarafından desteklendi ve MUSC Sindirim Hastalığı Araştırma Çekirdek Merkezi (P30 DK123704) ve Sindirim ve Karaciğer Hastalığında COBRE (P20 GM120475) tarafından desteklendi. Görüntüleme, MUSC’deki hücre ve moleküler görüntüleme çekirdeği kullanılarak gerçekleştirildi.
Materials
| β-CATENIN | GeneTex | GTX101435 | |
| Cellulose filter paper | Cytiva | 10427804 | Thick Whatman paper |
| Charged glass slides | Thermo Fisher Scientific | 23888114 | |
| Coverslip | Epredia | 152440 | |
| Dissecting pins size 00 | Phusis | B082DH4TZF | |
| E-CADHERIN | R&D Systems | AF748 | |
| Freezer gloves | Tempshield | UX-09113-02 | |
| Heating block | Premiere | XH-2001 | Slide Warmer |
| Histo-Clear II | Electron Microscopy Sciences | 64111-04 | Clearing reagent |
| Hoescht | Thermo Fisher Scientific | 62249 | |
| Hydrochloric Acid | Sigma Aldrich | 320331 | |
| Hydrophobic pen | Millipore | 402176 | |
| LAMININ | GeneTex | GTX27463 | |
| LAMP1 | Santa Cruz | SC-19992 | |
| Large cassettes | Tissue-Tek | 4173 | |
| Minutien pins | Fine Science Tools | NC9679721 | |
| Mouse-on-mouse blocking reagent | Vector Laboratories | MKB-2213 | Mouse-on-mouse block |
| MUC2 | GeneTex | GTX100664 | |
| PCNA | Cell Signaling Technology | 2586S | |
| Pressure Cooker | Cuisinart | B000MPA044 | |
| ProLong gold antifade | Thermo Fisher Scientific | P36934 | Mounting medium |
| Reverse action forceps | Dumont | 5748 | |
| Slide Rack | Tissue-Tek | 62543-06 | |
| Slide Staining Set | Tissue-Tek | 62540-01 | Solvent Resistant Dishes and Metal Frame |
| Small cassettes | Fisherbrand | 15-200-403B | |
| Sodium citrate dihydrate | Fisher Bioreagents | BP327-1 | |
| Teleostein Gelatin | Sigma | G7765 | Blocking buffer |
| Triton X-100 | Thermo Fisher Scientific | A16046 | |
| Tween 20 | Thermo Fisher Scientific | J20605-AP | |
| Wipes | KimTech | 34155 | |
| Xylenes | Fisher Chemical | 1330-20-7 | |
| γ-ACTIN | Santa Cruz | SC-65638 |
References
- Louvard, D., Kedinger, M., Hauri, H. P. The differentiating intestinal epithelial cell: Establishment and maintenance of functions through interactions between cellular structures. Annu Rev Cell Biol. 8, 157-195 (1992).
- Rieger, J., Pelckmann, L. M., Drewes, B. . Animal models of allergic disease: Methods and protocols. , (2021).
- Webster, J. D., Miller, M. A., Dusold, D., Ramos-Vara, J. Effects of prolonged formalin fixation on the immunohistochemical detection of infectious agents in formalin-fixed, paraffin-embedded tissues. Vet Pathol. 47 (3), 529-535 (2010).
- Hayashi, Y., Koike, M., Matsutani, M., Hoshino, T. Effects of fixation time and enzymatic digestion on immunohistochemical demonstration of bromodeoxyuridine in formalin-fixed, paraffin-embedded tissue. J Histochem Cytochemis. 36 (5), 511-514 (1988).
- Werner, M., Chott, A., Fabiano, A., Battifora, H. Effect of formalin tissue fixation and processing on immunohistochemistry. Am J Surg Pathol. 24 (7), 1016-1019 (2000).
- Scalia, C. R., et al. Antigen masking during fixation and embedding, dissected. J Histochem Cytochem. 65 (1), 5-20 (2017).
- Masood, S., Von Wasielewski, R., Mengel, M., Nolte, M., Werner, M. Influence of fixation, antibody clones, and signal amplification on steroid receptor analysis. Breast J. 4 (1), 33-40 (1998).
- Moolenbeek, C., Ruitenberg, E. J. The "swiss roll": A simple technique for histological studies of the rodent intestine. Lab Anim. 15 (1), 57-59 (1981).
- Casteleyn, C., Rekecki, A., Van Der Aa, A., Simoens, P., Van Den Broeck, W. Surface area assessment of the murine intestinal tract as a prerequisite for oral dose translation from mouse to man. Lab Animals. 44 (3), 176-183 (2010).
- Lunnemann, H. M., et al. Cecum axis (cecax) preservation reveals physiological and pathological gradients in mouse gastrointestinal epithelium. Gut Microbes. 15 (1), 2185029 (2023).
- Qin, C., et al. The cutting and floating method for paraffin-embedded tissue for sectioning. J Vis Exp. (139), e58288 (2018).
- Feldman, A. T., Wolfe, D. . Histopathology: Methods and protocols. , (2014).
- Yang, W. H., et al. Innate mechanism of mucosal barrier erosion in the pathogenesis of acquired colitis. iScience. 26 (10), 107883 (2023).
- Dooley, S. A., et al. Myosin 5b is required for proper localization of the intermicrovillar adhesion complex in the intestinal brush border. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 323 (5), G501-G510 (2022).
- Danan, C. H., et al. Intestinal transit amplifying cells require mettl3 for growth factor signaling, kras expression, and cell survival. bioRxiv. , (2023).
- Han, B., Qi, S., Hu, B., Luo, H., Wu, J. Tgf-beta i promotes islet beta-cell function and regeneration. J Immunol. 186 (10), 5833-5844 (2011).
- Chen, L. C., Wang, H. W., Huang, C. C. Modulation of inherent niches in 3d multicellular msc spheroids reconfigures metabolism and enhances therapeutic potential. Cells. 10 (10), 2747 (2021).
- Fang, Y., et al. Cd36 inhibits beta-catenin/c-myc-mediated glycolysis through ubiquitination of gpc4 to repress colorectal tumorigenesis. Nat Commun. 10 (1), 3981 (2019).
- Whittem, C. G., Williams, A. D., Williams, C. S. Murine colitis modeling using dextran sulfate sodium (dss). J Vis Exp. (35), e1652 (2010).
- Bialkowska, A. B., Ghaleb, A. M., Nandan, M. O., Yang, V. W. Improved swiss-rolling technique for intestinal tissue preparation for immunohistochemical and immunofluorescent analyses. J Vis Exp. (113), e54161 (2016).
- Le Naour, J., et al. Improved swiss-rolling method for histological analyses of colon tissue. MethodsX. 9, 101630 (2022).
- Cardiff, R. D., Miller, C. H., Munn, R. J. Mouse tissue fixation. Cold Spring Harb Protoc. 2014 (5), (2014).
- Pereira E Silva, A., Lourenço, A. L., Marmello, B. O., Bitteti, M., Teixeira, G. a. P. B. Comparison of two techniques for a comprehensive gut histopathological analysis: Swiss roll versus intestine strips. Exp Mol Pathol. 111, 104302 (2019).
- Williams, J. M., Duckworth, C. A., Vowell, K., Burkitt, M. D., Pritchard, D. M. Intestinal preparation techniques for histological analysis in the mouse. Curr Prot Mouse Biol. 6 (2), 148-168 (2016).
- Boenisch, T. Effect of heat-induced antigen retrieval following inconsistent formalin fixation. Appl Immunohistochem Mol Morphol. 13 (3), 283-286 (2005).
- Hasegawa, Y., Mark Welch, J. L., Rossetti, B. J., Borisy, G. G. Preservation of three-dimensional spatial structure in the gut microbiome. PLoS One. 12 (11), e0188257 (2017).
- Garabedian, E. M., Roberts, L. J., Mcnevin, M. S., Gordon, J. I. Examining the role of paneth cells in the small intestine by lineage ablation in transgenic mice. J Biol Chem. 272 (38), 23729-23740 (1997).
- Moshi, J. M., Ummelen, M., Broers, J. L. V., Ramaekers, F. C. S., Hopman, A. H. N. Impact of antigen retrieval protocols on the immunohistochemical detection of epigenetic DNA modifications. Histochem Cell Biol. 159 (6), 513-526 (2023).
- Krenacs, L., Krenacs, T., Stelkovics, E., Raffeld, M. Heat-induced antigen retrieval for immunohistochemical reactions in routinely processed paraffin sections. Methods Mol Biol. 588, 103-119 (2010).
- Pereira, E. S. A., Lourenco, A. L., Marmello, B. O., Bitteti, M., Teixeira, G. Comparison of two techniques for a comprehensive gut histopathological analysis: Swiss roll versus intestine strips. Exp Mol Pathol. 104302, 111 (2019).
- Bolognesi, M. a. O., et al. Antibodies validated for routinely processed tissues stain frozen sections unpredictably. BioTechniques. 70 (3), 137-148 (2021).
.