Optimiertes Protokoll für intestinale Swiss Rolls und Immunfluoreszenzfärbung von in Paraffin eingebettetem Gewebe
Summary
Der Darm ist wichtig für die Verdauung und Resorption. Jede Region – Duodenum, Jejunum, Ileum, Dickdarm – erfüllt aufgrund einzigartiger zellulärer Strukturen unterschiedliche Funktionen. Das Studium der Darmphysiologie erfordert eine sorgfältige Gewebeanalyse. Dieses Protokoll beschreibt die Gewebefixierung und -verarbeitung mit der Swiss-Roll-Technik, um eine genaue Immunfärbung durch die richtige Gewebekonservierung und -ausrichtung zu gewährleisten.
Abstract
Der Darm ist ein komplexes Organ, das sich aus dem Dünn- und dem Dickdarm zusammensetzt. Der Dünndarm kann weiter in Duodenum, Jejunum und Ileum unterteilt werden. Jede anatomische Region des Darms hat eine einzigartige Funktion, die sich in Unterschieden in der Zellstruktur widerspiegelt. Um Veränderungen im Darm zu untersuchen, bedarf es einer vertieften Analyse verschiedener Geweberegionen und zellulärer Veränderungen. Um den Darm zu untersuchen und große Gewebestücke sichtbar zu machen, verwenden Forscher häufig eine Technik, die als Darmrollen bekannt ist. Bei dieser Technik wird der Darm in jede anatomische Region unterteilt und in einer flachen Ausrichtung fixiert. Anschließend wird das Gewebe sorgfältig gerollt und für die Paraffineinbettung verarbeitet. Die richtige Fixierung und Ausrichtung des Gewebes ist eine oft übersehene Labortechnik, die jedoch für die nachgelagerte Analyse von entscheidender Bedeutung ist. Darüber hinaus kann ein unsachgemäßes Rollen des Darmgewebes das empfindliche Darmepithel schädigen, was zu einer schlechten Gewebequalität für die Immunfärbung führt. Die Sicherstellung eines gut fixierten und richtig ausgerichteten Gewebes mit intakten Zellstrukturen ist ein entscheidender Schritt, um eine optimale Visualisierung der Darmzellen zu gewährleisten. Wir stellen eine kostengünstige und einfache Methode zur Herstellung von Schweizer Rollen vor, bei der alle Teile des Darms in einem einzigen, in Paraffin eingebetteten Block enthalten sind. Wir beschreiben auch eine optimierte Immunfluoreszenzfärbung von Darmgewebe, um verschiedene Aspekte des Darmepithels zu untersuchen. Das folgende Protokoll bietet Forschern einen umfassenden Leitfaden zur Gewinnung hochwertiger Immunfluoreszenzbilder durch Fixierung des Darmgewebes, Swiss-Roll-Technik und Immunfärbung. Die Anwendung dieser verfeinerten Ansätze bewahrt die komplizierte Morphologie des Darmepithels und fördert ein tieferes Verständnis der Darmphysiologie und Pathobiologie.
Introduction
Die zelluläre Architektur des Darms stellt eine einzigartige Herausforderung für die Aufrechterhaltung seiner strukturellen Integrität dar, wenn Darmgewebe für die Immunfärbung konserviert wird. Der Dünndarm besteht aus länglichen, fingerartigen Strukturen, die als Zotten1 bekannt sind. Diese Zotten werden während der Einbettungsprozesse oft missgebildet. Für eine robuste experimentelleAnalyse ist es von entscheidender Bedeutung, sicherzustellen, dass die Forscher über Techniken zur korrekten Einbettung des Darms verfügen, um Querschnitte zu erzielen, die eine Visualisierung aller Regionen des Darms sowie der Schichten, aus denen der Darm besteht (d. h. Muscularis propria, Mukosa und die Serosa), ermöglichen. Eine unzureichende Fixierung, eine übermäßige Fixierung und eine unsachgemäße Handhabung des Gewebes beeinträchtigen die Integrität des Gewebes, was zu einer unbeabsichtigten Schädigung des Darmepithels führt 3,4. Eine Schädigung des Darmepithels während dieser Schritte kann die Qualität nachfolgender Analysen, wie z. B. der Immunfluoreszenz, erheblich beeinträchtigen, unabhängig von der Wirksamkeit der immunhistochemischen Protokolle und der verwendeten Antikörper.
Die Immunfärbung ist, wie die richtige Gewebefixierung, ein wichtiger Bestandteil der biomedizinischen Forschung. Wenn sie gut gemacht wird, kann die Immunfärbung bisher unbekannte Aspekte der Zellstruktur und -funktion beleuchten. Die Immunfluoreszenzfärbung von Paraffinschnitten kann aufgrund physikalisch-chemischer Modifikationen, die sich aus dem Fixierungs- und Paraffineinbettungsprozess ergeben, eine Herausforderung darstellen5. Die Fixierung und Paraffineinbettung führt zu einer Antigenmaskierung, die die Immunfluoreszenzdetektion von Epitopen von Interesse beeinträchtigen kann6. Eine verzögerte Fixierung kann zu einer proteolytischen Degradation führen, was zu einer geschwächten oder fehlenden Färbung kritischer Epitope führt7. Darüber hinaus sind Antikörper bei hohen Hintergrundwerten oft ungenau. Immunfärbeprotokolle, die eine konsistente und spezifische Antikörperbindung und ein hohes Signal-Rausch-Verhältnis fördern, können wertvolle Informationen für Forscher liefern.
Hier stellen wir ein umfassendes Protokoll zur Verfügung, das entwickelt wurde, um qualitativ hochwertige Immunfluoreszenzbilder durch Fixierung des Darmgewebes, Schweizer Rollenvorbereitung8 und Immunfärbung zu erhalten. Das Protokoll legt den Schwerpunkt auf Richtlinien zur Erhaltung der Integrität des Darms und zielt darauf ab, den Forschern eine robuste Methodik an die Hand zu geben, um die Qualität und Zuverlässigkeit von Immunfluoreszenz-Bildgebungsstudien zu verbessern. Wir haben auch versucht, kostengünstige Ressourcen zu verwenden, darunter Filterpapier und hausgemachte Antigengewinnung, Blockierungslösungen und Antikörperverdünnungsmittel, um das Protokoll für Labore zugänglicher zu machen, die möglicherweise nur über begrenzte Mittel verfügen. Wie bei allen experimentellen Protokollen sollten Forscher das aktuelle Protokoll auf der Grundlage ihres experimentellen Ansatzes und ihrer Interessengebiete optimieren.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hier stellen wir eine optimierte Methode zur Gewebefixierung mit der Swiss-Roll-Technik vor, um die Darmarchitektur zu erhalten und eine genaue Immunfärbung zu fördern. Einmal gemeistert, kann diese Technik zur Untersuchung einer Vielzahl von Forschungsfragen im Zusammenhang mit der Darmphysiologie und Zellbiologie verwendet werden19. Mehrere optimierte Schweizer Walzverfahren wurden publiziert und sind sehr nützlich20,21. Ein Vorteil d…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Studie wurde von den National Institutes of Health (NIH) Grants K01 DK121869 an ACE unterstützt, und diese Veröffentlichung wurde teilweise von T32 GM132055 (RME), F31 DK139736 (SAD), T32 DK124191 (SAD), TL1 TR001451 (RS), UL1 TR001450 (RS) und den HCS Cornerstone Grants für SAD & RS unterstützt. Diese Arbeit wurde durch Startkapital von der Medical University of South Carolina (MUSC) bis ACE unterstützt und vom MUSC Digestive Disease Research Core Center (P30 DK123704) und dem COBRE in Digestive and Liver Disease (P20 GM120475) unterstützt. Die Bildgebung wurde mit dem Zell- und molekularen Bildgebungskern am MUSC durchgeführt.
Materials
| β-CATENIN | GeneTex | GTX101435 | |
| Cellulose filter paper | Cytiva | 10427804 | Thick Whatman paper |
| Charged glass slides | Thermo Fisher Scientific | 23888114 | |
| Coverslip | Epredia | 152440 | |
| Dissecting pins size 00 | Phusis | B082DH4TZF | |
| E-CADHERIN | R&D Systems | AF748 | |
| Freezer gloves | Tempshield | UX-09113-02 | |
| Heating block | Premiere | XH-2001 | Slide Warmer |
| Histo-Clear II | Electron Microscopy Sciences | 64111-04 | Clearing reagent |
| Hoescht | Thermo Fisher Scientific | 62249 | |
| Hydrochloric Acid | Sigma Aldrich | 320331 | |
| Hydrophobic pen | Millipore | 402176 | |
| LAMININ | GeneTex | GTX27463 | |
| LAMP1 | Santa Cruz | SC-19992 | |
| Large cassettes | Tissue-Tek | 4173 | |
| Minutien pins | Fine Science Tools | NC9679721 | |
| Mouse-on-mouse blocking reagent | Vector Laboratories | MKB-2213 | Mouse-on-mouse block |
| MUC2 | GeneTex | GTX100664 | |
| PCNA | Cell Signaling Technology | 2586S | |
| Pressure Cooker | Cuisinart | B000MPA044 | |
| ProLong gold antifade | Thermo Fisher Scientific | P36934 | Mounting medium |
| Reverse action forceps | Dumont | 5748 | |
| Slide Rack | Tissue-Tek | 62543-06 | |
| Slide Staining Set | Tissue-Tek | 62540-01 | Solvent Resistant Dishes and Metal Frame |
| Small cassettes | Fisherbrand | 15-200-403B | |
| Sodium citrate dihydrate | Fisher Bioreagents | BP327-1 | |
| Teleostein Gelatin | Sigma | G7765 | Blocking buffer |
| Triton X-100 | Thermo Fisher Scientific | A16046 | |
| Tween 20 | Thermo Fisher Scientific | J20605-AP | |
| Wipes | KimTech | 34155 | |
| Xylenes | Fisher Chemical | 1330-20-7 | |
| γ-ACTIN | Santa Cruz | SC-65638 |
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