פרוטוקול ממוטב לגלילים שוויצריים במעי וצביעה אימונופלואורסצנטית של רקמה משובצת פרפין
Summary
המעי חיוני לעיכול וספיגה. כל אזור – תריסריון, ג’ג’ונום, איליאום, המעי הגס – משרת פונקציות נפרדות בשל מבנים תאיים ייחודיים. לימוד הפיזיולוגיה של המעי דורש ניתוח רקמות קפדני. פרוטוקול זה מתאר קיבוע ועיבוד רקמות בטכניקת הרול השוויצרית, ומבטיח אימונוסטיין מדויק באמצעות שימור וכיוון נכון של הרקמות.
Abstract
המעי הוא איבר מורכב המורכב מהמעי הדק והגס. המעי הדק יכול להיות מחולק עוד יותר תריסריון, jejunum, ו ileum. לכל אזור אנטומי במעי יש תפקיד ייחודי המתבטא בהבדלים במבנה התאים. חקירת שינויים במעי דורשת ניתוח מעמיק של אזורי רקמות שונים ושינויים תאיים שונים. כדי לחקור את המעי ולדמיין חתיכות גדולות של רקמה, חוקרים משתמשים בדרך כלל בטכניקה המכונה לחמניות שוויצריות מעיים. בטכניקה זו, המעי מחולק לכל אזור אנטומי קבוע בכיוון שטוח. לאחר מכן, הרקמה מגולגלת בזהירות ומעובדת להטבעת פרפין. קיבוע וכיוון נכונים של רקמות הם טכניקת מעבדה שלעתים קרובות מתעלמים ממנה, אך היא חשובה באופן קריטי לניתוח במורד הזרם. בנוסף, גלגול שוויצרי לא תקין של רקמת המעי עלול לפגוע באפיתל המעי השברירי, מה שמוביל לאיכות רקמה ירודה לצביעת מערכת החיסון. הבטחת רקמה קבועה היטב ומכוונת כראוי עם מבנים תאיים שלמים היא צעד חיוני המבטיח הדמיה אופטימלית של תאי המעי. אנו מציגים שיטה חסכונית ופשוטה להכנת לחמניות שוויצריות כדי לכלול את כל חלקי המעי בבלוק אחד משובץ פרפין. אנו מתארים גם צביעה אימונופלואורסצנטית אופטימלית של רקמת המעי כדי לחקור היבטים שונים של אפיתל המעי. הפרוטוקול הבא מספק לחוקרים מדריך מקיף להשגת תמונות אימונופלואורסנציה באיכות גבוהה באמצעות קיבוע רקמת מעי, טכניקת סוויס-רול וצביעת מערכת החיסון. שימוש בגישות מעודנות אלה משמר את המורפולוגיה המורכבת של אפיתל המעי ומטפח הבנה עמוקה יותר של הפיזיולוגיה של המעי והפתוביולוגיה.
Introduction
הארכיטקטורה התאית של המעי מציבה אתגר ייחודי בשמירה על שלמותו המבנית כאשר רקמת המעי נשמרת לצורך צביעה חיסונית. המעי הדק מורכב ממבנים מוארכים דמויי אצבעות המכונים וילי1. וילי אלה לעתים קרובות הופכים מעוותים במהלך תהליכי הטמעה. הבטחת שלחוקרים יש טכניקות להטמעה נכונה של מעיים כדי להשיג חתכים, המאפשרים הדמיה של כל אזורי המעי, כמו גם את השכבות המרכיבות את המעי (כלומר, muscularis propria, רירית והסרוסה), היא חיונית לניתוח ניסויי חזק2. קיבוע לא מספק, קיבוע מוגזם וטיפול לא נכון ברקמות יפגעו בשלמות הרקמה, וכתוצאה מכך ייגרם נזק לא מכוון לאפיתל המעי 3,4. פגיעה באפיתל המעי במהלך שלבים אלה יכולה להפחית באופן משמעותי את איכות הניתוחים הבאים, כמו immunofluorescence, ללא קשר ליעילות של פרוטוקולים אימונוהיסטוכימיים ונוגדנים בשימוש.
אימונוסטיין, כמו קיבוע רקמות תקין, הוא חלק חשוב במחקר הביו-רפואי. כאשר הוא נעשה היטב, immunostaining יכול להאיר היבטים שלא היו ידועים בעבר של מבנה התא ותפקודו. צביעה אימונופלואורסצנטית של חלקי פרפין יכולה להיות מאתגרת עקב שינויים פיסיקוכימיים הנובעים מתהליך הקיבוע והטמעת הפרפין5. קיבוע והטמעת פרפין גורמים למיסוך אנטיגן שיכול להפריע לזיהוי אימונופלואורסנציה של אפיטופים מעניינים6. קיבוע מושהה עלול לגרום להתפרקות פרוטאוליטית, וכתוצאה מכך הכתמה מוחלשת או נעדרת של אפיטופים קריטיים7. בנוסף, נוגדנים הם לעתים קרובות לא מדויקים עם רמות גבוהות של רקע. פרוטוקולי אימונוסטיין המקדמים קשירת נוגדנים עקבית וספציפית ויחס אות לרעש גבוה יכולים לספק מידע רב ערך לחוקרים.
כאן, אנו מספקים פרוטוקול מקיף שנועד להשיג תמונות אימונופלואורסנציה באיכות גבוהה באמצעות קיבוע רקמת מעי, הכנת גליל שוויצרי8 ו immunostaining. תוך שימת דגש על הנחיות לשמירה על שלמות המעי, הפרוטוקול נועד לספק לחוקרים מתודולוגיה חזקה לשיפור האיכות והאמינות של מחקרי הדמיה אימונופלואורסצנטית. ביקשנו גם להשתמש במשאבים חסכוניים, כולל נייר סינון ואחזור אנטיגן ביתי, פתרונות חסימה ודילול נוגדנים כדי להפוך את הפרוטוקול לנגיש יותר למעבדות שאולי הגבילו את הכספים. באשר לכל פרוטוקולי הניסוי, החוקרים צריכים לייעל את הפרוטוקול הנוכחי בהתבסס על הגישה הניסויית שלהם ותחומי העניין שלהם.
Protocol
Representative Results
Discussion
כאן, אנו מציגים שיטה אופטימלית לקיבוע רקמות בטכניקת הרול השוויצרית כדי לשמר את ארכיטקטורת המעי ולקדם אימונוסטיין מדויק. לאחר השליטה, טכניקה זו יכולה לשמש כדי לחקור מגוון רחב של שאלות מחקר הקשורות פיזיולוגיה של המעי וביולוגיה התא19. פורסמו מספר שיטות גלגול שוויצריות אופטימליו…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
מחקר זה נתמך על ידי המכונים הלאומיים לבריאות (NIH) מענקי K01 DK121869 ל- ACE ופרסום זה נתמך בחלקו על ידי T32 GM132055 (RME), F31 DK139736 (SAD), T32 DK124191 (SAD), TL1 TR001451 (RS), UL1 TR001450 (RS) ומענקי אבן הפינה של HCS ל- SAD &; RS. עבודה זו נתמכה על ידי קרנות סטארט-אפ מהאוניברסיטה הרפואית של דרום קרוליינה (MUSC) ל-ACE ונתמכה על ידי MUSC Digestive Disease Research Core Center (P30 DK123704) ו-COBRE in Digestive and Liver Disease (P20 GM120475). ההדמיה בוצעה באמצעות ליבת התא וההדמיה המולקולרית ב-MUSC.
Materials
| β-CATENIN | GeneTex | GTX101435 | |
| Cellulose filter paper | Cytiva | 10427804 | Thick Whatman paper |
| Charged glass slides | Thermo Fisher Scientific | 23888114 | |
| Coverslip | Epredia | 152440 | |
| Dissecting pins size 00 | Phusis | B082DH4TZF | |
| E-CADHERIN | R&D Systems | AF748 | |
| Freezer gloves | Tempshield | UX-09113-02 | |
| Heating block | Premiere | XH-2001 | Slide Warmer |
| Histo-Clear II | Electron Microscopy Sciences | 64111-04 | Clearing reagent |
| Hoescht | Thermo Fisher Scientific | 62249 | |
| Hydrochloric Acid | Sigma Aldrich | 320331 | |
| Hydrophobic pen | Millipore | 402176 | |
| LAMININ | GeneTex | GTX27463 | |
| LAMP1 | Santa Cruz | SC-19992 | |
| Large cassettes | Tissue-Tek | 4173 | |
| Minutien pins | Fine Science Tools | NC9679721 | |
| Mouse-on-mouse blocking reagent | Vector Laboratories | MKB-2213 | Mouse-on-mouse block |
| MUC2 | GeneTex | GTX100664 | |
| PCNA | Cell Signaling Technology | 2586S | |
| Pressure Cooker | Cuisinart | B000MPA044 | |
| ProLong gold antifade | Thermo Fisher Scientific | P36934 | Mounting medium |
| Reverse action forceps | Dumont | 5748 | |
| Slide Rack | Tissue-Tek | 62543-06 | |
| Slide Staining Set | Tissue-Tek | 62540-01 | Solvent Resistant Dishes and Metal Frame |
| Small cassettes | Fisherbrand | 15-200-403B | |
| Sodium citrate dihydrate | Fisher Bioreagents | BP327-1 | |
| Teleostein Gelatin | Sigma | G7765 | Blocking buffer |
| Triton X-100 | Thermo Fisher Scientific | A16046 | |
| Tween 20 | Thermo Fisher Scientific | J20605-AP | |
| Wipes | KimTech | 34155 | |
| Xylenes | Fisher Chemical | 1330-20-7 | |
| γ-ACTIN | Santa Cruz | SC-65638 |
References
- Louvard, D., Kedinger, M., Hauri, H. P. The differentiating intestinal epithelial cell: Establishment and maintenance of functions through interactions between cellular structures. Annu Rev Cell Biol. 8, 157-195 (1992).
- Rieger, J., Pelckmann, L. M., Drewes, B. . Animal models of allergic disease: Methods and protocols. , (2021).
- Webster, J. D., Miller, M. A., Dusold, D., Ramos-Vara, J. Effects of prolonged formalin fixation on the immunohistochemical detection of infectious agents in formalin-fixed, paraffin-embedded tissues. Vet Pathol. 47 (3), 529-535 (2010).
- Hayashi, Y., Koike, M., Matsutani, M., Hoshino, T. Effects of fixation time and enzymatic digestion on immunohistochemical demonstration of bromodeoxyuridine in formalin-fixed, paraffin-embedded tissue. J Histochem Cytochemis. 36 (5), 511-514 (1988).
- Werner, M., Chott, A., Fabiano, A., Battifora, H. Effect of formalin tissue fixation and processing on immunohistochemistry. Am J Surg Pathol. 24 (7), 1016-1019 (2000).
- Scalia, C. R., et al. Antigen masking during fixation and embedding, dissected. J Histochem Cytochem. 65 (1), 5-20 (2017).
- Masood, S., Von Wasielewski, R., Mengel, M., Nolte, M., Werner, M. Influence of fixation, antibody clones, and signal amplification on steroid receptor analysis. Breast J. 4 (1), 33-40 (1998).
- Moolenbeek, C., Ruitenberg, E. J. The "swiss roll": A simple technique for histological studies of the rodent intestine. Lab Anim. 15 (1), 57-59 (1981).
- Casteleyn, C., Rekecki, A., Van Der Aa, A., Simoens, P., Van Den Broeck, W. Surface area assessment of the murine intestinal tract as a prerequisite for oral dose translation from mouse to man. Lab Animals. 44 (3), 176-183 (2010).
- Lunnemann, H. M., et al. Cecum axis (cecax) preservation reveals physiological and pathological gradients in mouse gastrointestinal epithelium. Gut Microbes. 15 (1), 2185029 (2023).
- Qin, C., et al. The cutting and floating method for paraffin-embedded tissue for sectioning. J Vis Exp. (139), e58288 (2018).
- Feldman, A. T., Wolfe, D. . Histopathology: Methods and protocols. , (2014).
- Yang, W. H., et al. Innate mechanism of mucosal barrier erosion in the pathogenesis of acquired colitis. iScience. 26 (10), 107883 (2023).
- Dooley, S. A., et al. Myosin 5b is required for proper localization of the intermicrovillar adhesion complex in the intestinal brush border. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 323 (5), G501-G510 (2022).
- Danan, C. H., et al. Intestinal transit amplifying cells require mettl3 for growth factor signaling, kras expression, and cell survival. bioRxiv. , (2023).
- Han, B., Qi, S., Hu, B., Luo, H., Wu, J. Tgf-beta i promotes islet beta-cell function and regeneration. J Immunol. 186 (10), 5833-5844 (2011).
- Chen, L. C., Wang, H. W., Huang, C. C. Modulation of inherent niches in 3d multicellular msc spheroids reconfigures metabolism and enhances therapeutic potential. Cells. 10 (10), 2747 (2021).
- Fang, Y., et al. Cd36 inhibits beta-catenin/c-myc-mediated glycolysis through ubiquitination of gpc4 to repress colorectal tumorigenesis. Nat Commun. 10 (1), 3981 (2019).
- Whittem, C. G., Williams, A. D., Williams, C. S. Murine colitis modeling using dextran sulfate sodium (dss). J Vis Exp. (35), e1652 (2010).
- Bialkowska, A. B., Ghaleb, A. M., Nandan, M. O., Yang, V. W. Improved swiss-rolling technique for intestinal tissue preparation for immunohistochemical and immunofluorescent analyses. J Vis Exp. (113), e54161 (2016).
- Le Naour, J., et al. Improved swiss-rolling method for histological analyses of colon tissue. MethodsX. 9, 101630 (2022).
- Cardiff, R. D., Miller, C. H., Munn, R. J. Mouse tissue fixation. Cold Spring Harb Protoc. 2014 (5), (2014).
- Pereira E Silva, A., Lourenço, A. L., Marmello, B. O., Bitteti, M., Teixeira, G. a. P. B. Comparison of two techniques for a comprehensive gut histopathological analysis: Swiss roll versus intestine strips. Exp Mol Pathol. 111, 104302 (2019).
- Williams, J. M., Duckworth, C. A., Vowell, K., Burkitt, M. D., Pritchard, D. M. Intestinal preparation techniques for histological analysis in the mouse. Curr Prot Mouse Biol. 6 (2), 148-168 (2016).
- Boenisch, T. Effect of heat-induced antigen retrieval following inconsistent formalin fixation. Appl Immunohistochem Mol Morphol. 13 (3), 283-286 (2005).
- Hasegawa, Y., Mark Welch, J. L., Rossetti, B. J., Borisy, G. G. Preservation of three-dimensional spatial structure in the gut microbiome. PLoS One. 12 (11), e0188257 (2017).
- Garabedian, E. M., Roberts, L. J., Mcnevin, M. S., Gordon, J. I. Examining the role of paneth cells in the small intestine by lineage ablation in transgenic mice. J Biol Chem. 272 (38), 23729-23740 (1997).
- Moshi, J. M., Ummelen, M., Broers, J. L. V., Ramaekers, F. C. S., Hopman, A. H. N. Impact of antigen retrieval protocols on the immunohistochemical detection of epigenetic DNA modifications. Histochem Cell Biol. 159 (6), 513-526 (2023).
- Krenacs, L., Krenacs, T., Stelkovics, E., Raffeld, M. Heat-induced antigen retrieval for immunohistochemical reactions in routinely processed paraffin sections. Methods Mol Biol. 588, 103-119 (2010).
- Pereira, E. S. A., Lourenco, A. L., Marmello, B. O., Bitteti, M., Teixeira, G. Comparison of two techniques for a comprehensive gut histopathological analysis: Swiss roll versus intestine strips. Exp Mol Pathol. 104302, 111 (2019).
- Bolognesi, M. a. O., et al. Antibodies validated for routinely processed tissues stain frozen sections unpredictably. BioTechniques. 70 (3), 137-148 (2021).
.