Geoptimaliseerd protocol voor intestinale Swiss rolls en immunofluorescerende kleuring van in paraffine ingebed weefsel
Summary
De darm is van vitaal belang voor de spijsvertering en opname. Elke regio – twaalfvingerige darm, jejunum, ileum, dikke darm – vervult verschillende functies vanwege unieke cellulaire structuren. Het bestuderen van darmfysiologie vereist een nauwgezette weefselanalyse. Dit protocol schetst weefselfixatie en -verwerking met behulp van de Swiss roll-techniek, waardoor nauwkeurige immunokleuring wordt gegarandeerd door middel van de juiste weefselconservering en -oriëntatie.
Abstract
De darm is een complex orgaan dat bestaat uit de dunne en de dikke darm. De dunne darm kan verder worden onderverdeeld in twaalfvingerige darm, jejunum en ileum. Elk anatomisch gebied van de darm heeft een unieke functie die tot uiting komt in verschillen in de cellulaire structuur. Het onderzoeken van veranderingen in de darm vereist een diepgaande analyse van verschillende weefselregio’s en cellulaire veranderingen. Om de darm te bestuderen en grote stukken weefsel te visualiseren, gebruiken onderzoekers vaak een techniek die bekend staat als intestinale Swiss rolls. Bij deze techniek wordt de darm verdeeld in elk anatomisch gebied en in een vlakke richting gefixeerd. Vervolgens wordt het weefsel zorgvuldig opgerold en verwerkt voor paraffine-inbedding. Een goede weefselfixatie en -oriëntatie is een laboratoriumtechniek die vaak over het hoofd wordt gezien, maar is van cruciaal belang voor stroomafwaartse analyse. Bovendien kan onjuist Zwitsers rollen van darmweefsel het fragiele darmepitheel beschadigen, wat leidt tot een slechte weefselkwaliteit voor immunokleuring. Zorgen voor goed gefixeerd en goed georiënteerd weefsel met intacte celstructuren is een cruciale stap die zorgt voor een optimale visualisatie van darmcellen. We presenteren een kosteneffectieve en eenvoudige methode voor het maken van Zwitserse broodjes om alle delen van de darm in een enkel in paraffine ingebed blok op te nemen. We beschrijven ook geoptimaliseerde immunofluorescentiekleuring van darmweefsel om verschillende aspecten van het darmepitheel te bestuderen. Het volgende protocol biedt onderzoekers een uitgebreide gids voor het verkrijgen van immunofluorescentiebeelden van hoge kwaliteit door middel van fixatie van darmweefsel, Swiss-roll-techniek en immunokleuring. Door gebruik te maken van deze verfijnde benaderingen blijft de ingewikkelde morfologie van het darmepitheel behouden en wordt een beter begrip van de darmfysiologie en pathobiologie bevorderd.
Introduction
De cellulaire architectuur van de darm vormt een unieke uitdaging bij het behouden van de structurele integriteit wanneer darmweefsel wordt bewaard voor immunokleuring. De dunne darm bestaat uit langwerpige vingerachtige structuren die bekend staan als villi1. Deze villi raken vaak misvormd tijdens inbeddingsprocessen. Ervoor zorgen dat onderzoekers technieken hebben om darmen goed in te bedden om dwarsdoorsneden te bereiken, waardoor visualisatie van alle delen van de darm mogelijk is, evenals de lagen waaruit de darm bestaat (d.w.z. muscularis propria, slijmvlies en de serosa), is cruciaal voor robuuste experimentele analyse2. Onvoldoende fixatie, overmatige fixatie en onjuiste weefselbehandeling zullen de weefselintegriteit in gevaar brengen, wat resulteert in onbedoelde schade aan het darmepitheel 3,4. Het beschadigen van het darmepitheel tijdens deze stappen kan de kwaliteit van latere analyses, zoals immunofluorescentie, aanzienlijk verminderen, ongeacht de werkzaamheid van immunohistochemische protocollen en gebruikte antilichamen.
Immunokleuring is, net als een goede weefselfixatie, een belangrijk onderdeel van biomedisch onderzoek. Als het goed wordt gedaan, kan immunokleuring voorheen onbekende aspecten van de cellulaire structuur en functie verlichten. Immunofluorescentiekleuring van paraffinesecties kan een uitdaging zijn vanwege fysisch-chemische veranderingen als gevolg van het fixatie- en paraffine-inbeddingsproces5. Fixatie en inbedding van paraffine resulteren in antigeenmaskering die de immunofluorescentiedetectie van interessante epitopen kan verstoren6. Vertraagde fixatie kan proteolytische degradatie induceren, wat resulteert in een verzwakte of afwezige kleuring van kritieke epitopen7. Bovendien zijn antilichamen vaak onnauwkeurig met een hoge achtergrond. Immunokleuringsprotocollen die consistente en specifieke antilichaambinding en een hoge signaal-ruisverhouding bevorderen, kunnen waardevolle informatie opleveren voor onderzoekers.
Hier bieden we een uitgebreid protocol dat is ontworpen om immunofluorescentiebeelden van hoge kwaliteit te verkrijgen door middel van fixatie van darmweefsel, Swiss roll-voorbereiding8 en immunokleuring. Het protocol legt de nadruk op richtlijnen om de integriteit van de darm te behouden en heeft tot doel onderzoekers een robuuste methodologie te bieden om de kwaliteit en betrouwbaarheid van immunofluorescentiebeeldvormingsonderzoeken te verbeteren. We hebben ook geprobeerd kosteneffectieve middelen te gebruiken, waaronder filterpapier en zelfgemaakte antigeenextractie, blokkeringsoplossingen en antilichaamverdunningsmiddelen om het protocol toegankelijker te maken voor laboratoria die mogelijk beperkte middelen hebben. Zoals voor alle experimentele protocollen, moeten onderzoekers het huidige protocol optimaliseren op basis van hun experimentele aanpak en interessegebieden.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hier presenteren we een geoptimaliseerde methode voor weefselfixatie met behulp van de Swiss roll-techniek om de darmarchitectuur te behouden en nauwkeurige immunokleuring te bevorderen. Eenmaal onder de knie kan deze techniek worden gebruikt om een breed scala aan onderzoeksvragen op het gebied van darmfysiologie en celbiologie te onderzoeken19. Er zijn verschillende geoptimaliseerde Zwitserse walsmethoden gepubliceerd die zeer nuttig zijn20,21…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Deze studie werd ondersteund door de National Institutes of Health (NIH) subsidies K01 DK121869 aan ACE en deze publicatie werd gedeeltelijk ondersteund door T32 GM132055 (RME), F31 DK139736 (SAD), T32 DK124191 (SAD), TL1 TR001451 (RS), UL1 TR001450 (RS) en de HCS-hoeksteensubsidies aan SAD en RS. Dit werk werd ondersteund door startup-fondsen van de Medical University of South Carolina (MUSC) tot ACE en werd ondersteund door het MUSC Digestive Disease Research Core Center (P30 DK123704) en de COBRE in Digestive and Liver Disease (P20 GM120475). Beeldvorming werd uitgevoerd met behulp van de cel- en moleculaire beeldvormingskern bij MUSC.
Materials
| β-CATENIN | GeneTex | GTX101435 | |
| Cellulose filter paper | Cytiva | 10427804 | Thick Whatman paper |
| Charged glass slides | Thermo Fisher Scientific | 23888114 | |
| Coverslip | Epredia | 152440 | |
| Dissecting pins size 00 | Phusis | B082DH4TZF | |
| E-CADHERIN | R&D Systems | AF748 | |
| Freezer gloves | Tempshield | UX-09113-02 | |
| Heating block | Premiere | XH-2001 | Slide Warmer |
| Histo-Clear II | Electron Microscopy Sciences | 64111-04 | Clearing reagent |
| Hoescht | Thermo Fisher Scientific | 62249 | |
| Hydrochloric Acid | Sigma Aldrich | 320331 | |
| Hydrophobic pen | Millipore | 402176 | |
| LAMININ | GeneTex | GTX27463 | |
| LAMP1 | Santa Cruz | SC-19992 | |
| Large cassettes | Tissue-Tek | 4173 | |
| Minutien pins | Fine Science Tools | NC9679721 | |
| Mouse-on-mouse blocking reagent | Vector Laboratories | MKB-2213 | Mouse-on-mouse block |
| MUC2 | GeneTex | GTX100664 | |
| PCNA | Cell Signaling Technology | 2586S | |
| Pressure Cooker | Cuisinart | B000MPA044 | |
| ProLong gold antifade | Thermo Fisher Scientific | P36934 | Mounting medium |
| Reverse action forceps | Dumont | 5748 | |
| Slide Rack | Tissue-Tek | 62543-06 | |
| Slide Staining Set | Tissue-Tek | 62540-01 | Solvent Resistant Dishes and Metal Frame |
| Small cassettes | Fisherbrand | 15-200-403B | |
| Sodium citrate dihydrate | Fisher Bioreagents | BP327-1 | |
| Teleostein Gelatin | Sigma | G7765 | Blocking buffer |
| Triton X-100 | Thermo Fisher Scientific | A16046 | |
| Tween 20 | Thermo Fisher Scientific | J20605-AP | |
| Wipes | KimTech | 34155 | |
| Xylenes | Fisher Chemical | 1330-20-7 | |
| γ-ACTIN | Santa Cruz | SC-65638 |
References
- Louvard, D., Kedinger, M., Hauri, H. P. The differentiating intestinal epithelial cell: Establishment and maintenance of functions through interactions between cellular structures. Annu Rev Cell Biol. 8, 157-195 (1992).
- Rieger, J., Pelckmann, L. M., Drewes, B. . Animal models of allergic disease: Methods and protocols. , (2021).
- Webster, J. D., Miller, M. A., Dusold, D., Ramos-Vara, J. Effects of prolonged formalin fixation on the immunohistochemical detection of infectious agents in formalin-fixed, paraffin-embedded tissues. Vet Pathol. 47 (3), 529-535 (2010).
- Hayashi, Y., Koike, M., Matsutani, M., Hoshino, T. Effects of fixation time and enzymatic digestion on immunohistochemical demonstration of bromodeoxyuridine in formalin-fixed, paraffin-embedded tissue. J Histochem Cytochemis. 36 (5), 511-514 (1988).
- Werner, M., Chott, A., Fabiano, A., Battifora, H. Effect of formalin tissue fixation and processing on immunohistochemistry. Am J Surg Pathol. 24 (7), 1016-1019 (2000).
- Scalia, C. R., et al. Antigen masking during fixation and embedding, dissected. J Histochem Cytochem. 65 (1), 5-20 (2017).
- Masood, S., Von Wasielewski, R., Mengel, M., Nolte, M., Werner, M. Influence of fixation, antibody clones, and signal amplification on steroid receptor analysis. Breast J. 4 (1), 33-40 (1998).
- Moolenbeek, C., Ruitenberg, E. J. The "swiss roll": A simple technique for histological studies of the rodent intestine. Lab Anim. 15 (1), 57-59 (1981).
- Casteleyn, C., Rekecki, A., Van Der Aa, A., Simoens, P., Van Den Broeck, W. Surface area assessment of the murine intestinal tract as a prerequisite for oral dose translation from mouse to man. Lab Animals. 44 (3), 176-183 (2010).
- Lunnemann, H. M., et al. Cecum axis (cecax) preservation reveals physiological and pathological gradients in mouse gastrointestinal epithelium. Gut Microbes. 15 (1), 2185029 (2023).
- Qin, C., et al. The cutting and floating method for paraffin-embedded tissue for sectioning. J Vis Exp. (139), e58288 (2018).
- Feldman, A. T., Wolfe, D. . Histopathology: Methods and protocols. , (2014).
- Yang, W. H., et al. Innate mechanism of mucosal barrier erosion in the pathogenesis of acquired colitis. iScience. 26 (10), 107883 (2023).
- Dooley, S. A., et al. Myosin 5b is required for proper localization of the intermicrovillar adhesion complex in the intestinal brush border. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 323 (5), G501-G510 (2022).
- Danan, C. H., et al. Intestinal transit amplifying cells require mettl3 for growth factor signaling, kras expression, and cell survival. bioRxiv. , (2023).
- Han, B., Qi, S., Hu, B., Luo, H., Wu, J. Tgf-beta i promotes islet beta-cell function and regeneration. J Immunol. 186 (10), 5833-5844 (2011).
- Chen, L. C., Wang, H. W., Huang, C. C. Modulation of inherent niches in 3d multicellular msc spheroids reconfigures metabolism and enhances therapeutic potential. Cells. 10 (10), 2747 (2021).
- Fang, Y., et al. Cd36 inhibits beta-catenin/c-myc-mediated glycolysis through ubiquitination of gpc4 to repress colorectal tumorigenesis. Nat Commun. 10 (1), 3981 (2019).
- Whittem, C. G., Williams, A. D., Williams, C. S. Murine colitis modeling using dextran sulfate sodium (dss). J Vis Exp. (35), e1652 (2010).
- Bialkowska, A. B., Ghaleb, A. M., Nandan, M. O., Yang, V. W. Improved swiss-rolling technique for intestinal tissue preparation for immunohistochemical and immunofluorescent analyses. J Vis Exp. (113), e54161 (2016).
- Le Naour, J., et al. Improved swiss-rolling method for histological analyses of colon tissue. MethodsX. 9, 101630 (2022).
- Cardiff, R. D., Miller, C. H., Munn, R. J. Mouse tissue fixation. Cold Spring Harb Protoc. 2014 (5), (2014).
- Pereira E Silva, A., Lourenço, A. L., Marmello, B. O., Bitteti, M., Teixeira, G. a. P. B. Comparison of two techniques for a comprehensive gut histopathological analysis: Swiss roll versus intestine strips. Exp Mol Pathol. 111, 104302 (2019).
- Williams, J. M., Duckworth, C. A., Vowell, K., Burkitt, M. D., Pritchard, D. M. Intestinal preparation techniques for histological analysis in the mouse. Curr Prot Mouse Biol. 6 (2), 148-168 (2016).
- Boenisch, T. Effect of heat-induced antigen retrieval following inconsistent formalin fixation. Appl Immunohistochem Mol Morphol. 13 (3), 283-286 (2005).
- Hasegawa, Y., Mark Welch, J. L., Rossetti, B. J., Borisy, G. G. Preservation of three-dimensional spatial structure in the gut microbiome. PLoS One. 12 (11), e0188257 (2017).
- Garabedian, E. M., Roberts, L. J., Mcnevin, M. S., Gordon, J. I. Examining the role of paneth cells in the small intestine by lineage ablation in transgenic mice. J Biol Chem. 272 (38), 23729-23740 (1997).
- Moshi, J. M., Ummelen, M., Broers, J. L. V., Ramaekers, F. C. S., Hopman, A. H. N. Impact of antigen retrieval protocols on the immunohistochemical detection of epigenetic DNA modifications. Histochem Cell Biol. 159 (6), 513-526 (2023).
- Krenacs, L., Krenacs, T., Stelkovics, E., Raffeld, M. Heat-induced antigen retrieval for immunohistochemical reactions in routinely processed paraffin sections. Methods Mol Biol. 588, 103-119 (2010).
- Pereira, E. S. A., Lourenco, A. L., Marmello, B. O., Bitteti, M., Teixeira, G. Comparison of two techniques for a comprehensive gut histopathological analysis: Swiss roll versus intestine strips. Exp Mol Pathol. 104302, 111 (2019).
- Bolognesi, M. a. O., et al. Antibodies validated for routinely processed tissues stain frozen sections unpredictably. BioTechniques. 70 (3), 137-148 (2021).
.