Protocolo otimizado para rolos suíços intestinais e coloração imunofluorescente de tecido embebido em parafina
Summary
O intestino é vital para a digestão e absorção. Cada região – duodeno, jejuno, íleo, cólon – tem funções distintas devido a estruturas celulares únicas. Estudar a fisiologia intestinal exige uma análise meticulosa do tecido. Este protocolo descreve a fixação e o processamento do tecido usando a técnica do rolo suíço, garantindo uma imunocoloração precisa por meio da preservação e orientação adequadas do tecido.
Abstract
O intestino é um órgão complexo composto pelos intestinos delgado e grosso. O intestino delgado pode ser dividido em duodeno, jejuno e íleo. Cada região anatômica do intestino tem uma função única que se reflete nas diferenças na estrutura celular. Investigar alterações no intestino requer uma análise aprofundada de diferentes regiões teciduais e alterações celulares. Para estudar o intestino e visualizar grandes pedaços de tecido, os pesquisadores costumam usar uma técnica conhecida como rolos suíços intestinais. Nesta técnica, o intestino é dividido em cada região anatômica e fixado em uma orientação plana. Em seguida, o tecido é cuidadosamente enrolado e processado para inclusão em parafina. A fixação e orientação adequadas do tecido são uma técnica laboratorial frequentemente negligenciada, mas são extremamente importantes para a análise a jusante. Além disso, o enrolamento inadequado do tecido intestinal pode danificar o epitélio intestinal frágil, levando à má qualidade do tecido para imunocoloração. Garantir um tecido bem fixado e devidamente orientado com estruturas celulares intactas é uma etapa crucial que garante a visualização ideal das células intestinais. Apresentamos um método simples e econômico para fazer rolos suíços para incluir todas as seções do intestino em um único bloco embebido em parafina. Também descrevemos a coloração otimizada por imunofluorescência do tecido intestinal para estudar vários aspectos do epitélio intestinal. O protocolo a seguir fornece aos pesquisadores um guia abrangente para obter imagens de imunofluorescência de alta qualidade por meio de fixação de tecido intestinal, técnica de rolo suíço e imunocoloração. O emprego dessas abordagens refinadas preserva a intrincada morfologia do epitélio intestinal e promove uma compreensão mais profunda da fisiologia intestinal e da patobiologia.
Introduction
A arquitetura celular do intestino representa um desafio único na manutenção de sua integridade estrutural quando o tecido intestinal está sendo preservado para imunocoloração. O intestino delgado é composto de estruturas alongadas semelhantes a dedos conhecidas como vilosidades1. Essas vilosidades geralmente ficam malformadas durante os processos de incorporação. Garantir que os pesquisadores tenham técnicas para incorporar adequadamente os intestinos para obter seções transversais, permitindo a visualização de todas as regiões do intestino, bem como das camadas que compõem o intestino (ou seja, muscular própria, mucosa e serosa), é crucial para uma análise experimental robusta2. A fixação inadequada, a fixação excessiva e o manuseio inadequado do tecido comprometerão a integridade do tecido, resultando em danos inadvertidos ao epitélio intestinal 3,4. Danificar o epitélio intestinal durante essas etapas pode diminuir significativamente a qualidade das análises subsequentes, como a imunofluorescência, independentemente da eficácia dos protocolos de imuno-histoquímica e dos anticorpos empregados.
A imunocoloração, como a fixação adequada do tecido, é uma parte importante da pesquisa biomédica. Quando bem feita, a imunocoloração pode iluminar aspectos anteriormente desconhecidos da estrutura e função celular. A coloração por imunofluorescência de cortes de parafina pode ser desafiadora devido a modificações físico-químicas resultantes do processo de fixação e inclusão de parafina5. A fixação e a inclusão em parafina resultam em mascaramento de antígenos que podem interferir na detecção de imunofluorescência de epítopos de interesse6. A fixação tardia pode induzir degradação proteolítica, o que resulta em coloração enfraquecida ou ausente de epítopos críticos7. Além disso, os anticorpos costumam ser imprecisos com altos níveis de fundo. Protocolos de imunocoloração que promovem a ligação consistente e específica de anticorpos e uma alta relação sinal-ruído podem fornecer informações valiosas para os pesquisadores.
Aqui, fornecemos um protocolo abrangente projetado para obter imagens de imunofluorescência de alta qualidade por meio de fixação de tecido intestinal, preparação de rolo suíço8 e imunocoloração. Enfatizando diretrizes para preservar a integridade do intestino, o protocolo visa fornecer aos pesquisadores uma metodologia robusta para melhorar a qualidade e a confiabilidade dos estudos de imagem de imunofluorescência. Também procuramos usar recursos econômicos, incluindo papel de filtro e recuperação caseira de antígenos, soluções de bloqueio e diluentes de anticorpos para tornar o protocolo mais acessível a laboratórios que podem ter fundos restritos. Como para todos os protocolos experimentais, os pesquisadores devem otimizar o protocolo atual com base em sua abordagem experimental e áreas de interesse.
Protocol
Representative Results
Discussion
Aqui, apresentamos um método otimizado para fixação tecidual usando a técnica de rolo suíço para preservar a arquitetura intestinal e promover imunocoloração precisa. Uma vez dominada, essa técnica pode ser usada para investigar uma ampla variedade de questões de pesquisa envolvendo fisiologia intestinal e biologia celular19. Vários métodos de laminação suíços otimizados foram publicados e são muito úteis20,21. Uma vantag…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este estudo foi apoiado pelo National Institutes of Health (NIH) concede K01 DK121869 à ACE e esta publicação foi apoiada em parte pelo T32 GM132055 (RME), F31 DK139736 (SAD), T32 DK124191 (SAD), TL1 TR001451 (RS), UL1 TR001450 (RS) e as concessões fundamentais do HCS para SAD & RS. Este trabalho foi apoiado por fundos iniciais da Universidade Médica da Carolina do Sul (MUSC) para ACE e foi apoiado pelo MUSC Digestive Disease Research Core Center (P30 DK123704) e pelo COBRE em Digestive and Liver Disease (P20 GM120475). A imagem foi realizada usando o núcleo de imagem celular e molecular no MUSC.
Materials
| β-CATENIN | GeneTex | GTX101435 | |
| Cellulose filter paper | Cytiva | 10427804 | Thick Whatman paper |
| Charged glass slides | Thermo Fisher Scientific | 23888114 | |
| Coverslip | Epredia | 152440 | |
| Dissecting pins size 00 | Phusis | B082DH4TZF | |
| E-CADHERIN | R&D Systems | AF748 | |
| Freezer gloves | Tempshield | UX-09113-02 | |
| Heating block | Premiere | XH-2001 | Slide Warmer |
| Histo-Clear II | Electron Microscopy Sciences | 64111-04 | Clearing reagent |
| Hoescht | Thermo Fisher Scientific | 62249 | |
| Hydrochloric Acid | Sigma Aldrich | 320331 | |
| Hydrophobic pen | Millipore | 402176 | |
| LAMININ | GeneTex | GTX27463 | |
| LAMP1 | Santa Cruz | SC-19992 | |
| Large cassettes | Tissue-Tek | 4173 | |
| Minutien pins | Fine Science Tools | NC9679721 | |
| Mouse-on-mouse blocking reagent | Vector Laboratories | MKB-2213 | Mouse-on-mouse block |
| MUC2 | GeneTex | GTX100664 | |
| PCNA | Cell Signaling Technology | 2586S | |
| Pressure Cooker | Cuisinart | B000MPA044 | |
| ProLong gold antifade | Thermo Fisher Scientific | P36934 | Mounting medium |
| Reverse action forceps | Dumont | 5748 | |
| Slide Rack | Tissue-Tek | 62543-06 | |
| Slide Staining Set | Tissue-Tek | 62540-01 | Solvent Resistant Dishes and Metal Frame |
| Small cassettes | Fisherbrand | 15-200-403B | |
| Sodium citrate dihydrate | Fisher Bioreagents | BP327-1 | |
| Teleostein Gelatin | Sigma | G7765 | Blocking buffer |
| Triton X-100 | Thermo Fisher Scientific | A16046 | |
| Tween 20 | Thermo Fisher Scientific | J20605-AP | |
| Wipes | KimTech | 34155 | |
| Xylenes | Fisher Chemical | 1330-20-7 | |
| γ-ACTIN | Santa Cruz | SC-65638 |
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